Orthotopic Transplantation af Syngeneic lunge adenocarcinom celler at studere PD-L1 udtryk
Summary
Her beskriver vi en minimalt invasiv syngeneic orthotopic transplantation model af musen lunge adenocarcinom celler som tid og omkostningsreducerende model til at studere ikke-småcellet lungekræft.
Abstract
Brug af musen modeller er uundværlig for at studere Patofysiologi af forskellige sygdomme. Med hensyn til lungekræft, flere modeller er til rådighed, herunder genetisk manipuleret modeller samt transplantation modeller. Dog er gensplejsede musemodeller tidskrævende og dyrt, der henviser til, at nogle orthotopic transplantation modeller er svært at reproducere. Her, er en non-invasiv intratrakeal leveringsmetode til lunge tumorceller som en alternativ orthotopic transplantation modellen beskrevet. Brug af musen lunge adenocarcinom celler og syngeneic graft modtagere giver mulighed for at studere tumordannelse under tilstedeværelse af en fuldt aktive immunsystem. Derudover genetiske manipulationer af tumor celler før transplantation gør denne model en attraktiv tidsbesparende tilgang at undersøge effekten af genetiske faktorer på tumorvækst og tumor celle genekspression profiler fysiologiske betingelser. Ved hjælp af denne model, vi vise at lunge adenocarcinom celler programmeret udtrykkelige forhøjede niveauer af T-celle suppressor død-ligand 1 (PD-L1) når der dyrkes i deres naturlige miljø i forhold til dyrkning i vitro.
Introduction
Lungekræft er stadig langt den største cancer-relaterede dræber i både mænd og kvinder1. Faktisk, ifølge American Cancer Society, hvert år flere mennesker dør af lungekræft end af bryst-, prostata- og tyktarmskræft kræft sammen1. Indtil for nylig, blev størstedelen af patienter med ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), som er den mest rigelige undertype af lungekræft, behandlet med platin-baseret kemoterapi i en første-line indstilling, for det meste med tilsætning af angiogenese hæmmere2. Kun en delmængde af patienter havne muterede mutationer i epidermal vækstfaktor receptor (EGFR), i Anaplastisk lymfom kinase (ALK) eller i ROS1, og kan behandles med tilgængelige målretning narkotika3,4. Med fremkomsten af immun checkpoint hæmmere, er nyt håb for patienter med lungecancer opstået, selv om indtil nu kun 20-40% af patienter reagerer på immun terapi5. Derfor, yderligere forskning er forpligtet til at forbedre resultatet af finjustering immun checkpoint terapi og undersøge combinatory behandlingsmuligheder.
For at studere lungekræft, en bred vifte af prækliniske modeller er tilgængelige, herunder spontan modeller udløses af kemikalier og kræftfremkaldende stoffer og genetisk manipulerede mus modeller (CLAUSS) hvor autokton tumorer opstår efter en betinget aktivering af onkogener og/eller inaktivering af tumor suppressor gener6,7,8. Disse modeller er af ganske særlig værdi at undersøge grundlæggende processer i lunge tumor udvikling, men de kræver også omfattende mus avl, og eksperimenter er tidskrævende. Derfor, mange undersøgelser evaluering af potentielle hæmmere drage fordel af subkutan (patient-afledt) xenograft modeller hvor menneskelige lung cancer cellelinjer subkutant injiceres i immundefekte mus9.
I disse modeller, er micromilieu af tumorer ikke repræsenteret i overensstemmelse hermed; Derfor bruger forskere også orthotopic transplantation modeller, hvor tumorceller injiceres intravenøst, intrabronchially eller direkte i den lunge parenkym10,11,12,13, 14,15,16,17,18,19,20. Nogle af disse metoder er teknisk udfordrende og vanskelige at gengives, og kræver intensiv uddannelse af forskerne. 21 her vi tilpasset en non-invasiv orthotopic, intratrakeal transplantation metode hos immunkompetente mus, hvor tumorer udvikle sig inden for 3-5 uger og udviser betydelige ligheder med menneskelige tumorer, at inducere udtryk for T-celle suppressor programmeret død-ligand 1 (PD-L1) på tumorceller. 11 , 12 , 20 brug af musen tumorceller stammer fra CLAUSS modeller og syngeneic recipient mus giver mulighed for korrekt at studere i tumor mikromiljø herunder immunceller. Derudover kan gen redigeringsværktøjer som CRISPR/Cas9 teknologi22 anvendes in vitro-før transplantation, som letter undersøgelsen af virkningen af genetiske faktorer i lunge tumordannelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
For at studere lunge fysiologiske og patologiske begivenheder i lungen, er invasive og non-invasiv intratrakeal intubation metoder til instillation af forskellige reagenser udbredte26,27,28,29 ,30,31,32. I feltet kræft forskere bruger intratrakeal (og intranasal) instillation af Cre-recomb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Safia Zahma for hendes hjælp med udarbejdelse af væv sektioner.
Materials
| mouse lung adenocarcinoma cell line | isolated in house | ||
| C57Bl/6 mice | F1 of the cross of the two backgrounds may be used (8-12 weeks) | ||
| 129S mice | |||
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11544446 | |
| Fetal Calf Serum | Life Technologies | 11573397 | |
| Penicillin/Streptomycin Solution | Life Technologies | 11548876 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 11539876 | |
| Trypsin, 0.25% (1X) with EDTA | Life Technologies | 11560626 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
| Ketasol (100 mg/ml Ketamine) | Ogris Pharma | 8-00173 | |
| Xylasol (20 mg/ml Xylazine) | Ogris Pharma | 8-00178 | |
| BD Insyste (22GA 1.00 IN) | BD | 381223 | |
| Blunt forceps | Roboz | RS8260 | |
| Leica CLS150 LED | Leica | 30250004 | Fibre Light Illuminator |
| Student Iris Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| DNase I (RNase-Free) | New England Biolabs | M0303S | |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100017 | |
| ACK Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | |
| CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-5982-82 | |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4321-82 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
- Zappa, C., Mousa, S. A. Non-small cell lung cancer: current treatment and future advances. Translational Lung Cancer Research. 5 (3), 288-300 (2016).
- Dolly, S. O., Collins, D. C., Sundar, R., Popat, S., Yap, T. A. Advances in the Development of Molecularly Targeted Agents in Non-Small-Cell Lung. Drugs. 77 (8), 813-827 (2017).
- Stinchcombe, T. E. Targeted Therapies for Lung Cancer. Cancer Treatment Research. 170, 165-182 (2016).
- Brody, R., et al. PD-L1 expression in advanced NSCLC: Insights into risk stratification and treatment selection from a systematic literature review. Lung Cancer. 112, 200-215 (2017).
- Safari, R., Meuwissen, R. Practical use of advanced mouse models for lung cancer. Methods in Molecular Biology. 1267, 93-124 (2015).
- DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nature Protocols. 4 (7), 1064-1072 (2009).
- Kwon, M. C., Berns, A. Mouse models for lung cancer. Molecular Oncology. 7 (2), 165-177 (2013).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Chen, X., et al. An orthotopic model of lung cancer to analyze primary and metastatic NSCLC growth in integrin alpha1-null mice. Clinical & Experiment Metastasis. 22 (2), 185-193 (2005).
- Kang, Y., et al. Development of an orthotopic transplantation model in nude mice that simulates the clinical features of human lung cancer. Cancer Science. 97 (10), 996-1001 (2006).
- Kang, Y., et al. Proliferation of human lung cancer in an orthotopic transplantation mouse model. Experimental and Therapeutic. 1 (3), 471-475 (2010).
- Kuo, T. H., et al. Orthotopic reconstitution of human small-cell lung carcinoma after intravenous transplantation in SCID mice. Anticancer Research. 12 (5), 1407-1410 (1992).
- Li, B., et al. A novel bioluminescence orthotopic mouse model for advanced lung cancer. Radiation Research. 176 (4), 486-493 (2011).
- Mase, K., et al. Intrabronchial orthotopic propagation of human lung adenocarcinoma–characterizations of tumorigenicity, invasion and metastasis. Lung Cancer. 36 (3), 271-276 (2002).
- McLemore, T. L., et al. Novel intrapulmonary model for orthotopic propagation of human lung cancers in athymic nude mice. Cancer Research. 47 (19), 5132-5140 (1987).
- Tsai, L. H., et al. The MZF1/c-MYC axis mediates lung adenocarcinoma progression caused by wild-type lkb1 loss. Oncogene. 34 (13), 1641-1649 (2015).
- Winslow, M. M., et al. Suppression of lung adenocarcinoma progression by Nkx2-1. Nature. 473 (7345), 101-104 (2011).
- Zou, Y., Fu, H., Ghosh, S., Farquhar, D., Klostergaard, J. Antitumor activity of hydrophilic Paclitaxel copolymer prodrug using locoregional delivery in human orthotopic non-small cell lung cancer xenograft models. Clinical Cancer Research. 10 (21), 7382-7391 (2004).
- Buckle, T., van Leeuwen, F. W. Validation of intratracheal instillation of lung tumour cells in mice using single photon emission computed tomography/computed tomography imaging. Lab Animal. 44 (1), 40-45 (2010).
- Berry-Pusey, B. N., et al. A semi-automated vascular access system for preclinical models. Physics in Medicine & Biology. 58 (16), 5351-5362 (2013).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Singer, B. D., et al. Flow-cytometric method for simultaneous analysis of mouse lung epithelial, endothelial, and hematopoietic lineage cells. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (9), L796-L801 (2016).
- Moll, H. P., et al. Afatinib restrains K-RAS-driven lung tumorigenesis. Science Translational Medicine. 10 (446), (2018).
- Campeau, E., et al. A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells. PLoS One. 4 (8), e6529 (2009).
- Gui, L., Qian, H., Rocco, K. A., Grecu, L., Niklason, L. E. Efficient intratracheal delivery of airway epithelial cells in mice and pigs. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 308 (2), L221-L228 (2015).
- Helms, M. N., Torres-Gonzalez, E., Goodson, P., Rojas, M. Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (42), e1941 (2010).
- Lin, Y. W., et al. Pharmacokinetics/Pharmacodynamics of Pulmonary Delivery of Colistin against Pseudomonas aeruginosa in a Mouse Lung Infection Model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (3), (2017).
- Wegesser, T. C., Last, J. A. Lung response to coarse PM: bioassay in mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 230 (2), 159-166 (2008).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (81), e50601 (2013).
- Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation: a noninvasive, lung-specific delivery system. Journal of Visualized Experiments. (93), e52261 (2014).
- Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), e53771 (2016).
