Summary
Aquí describimos un modelo de trasplante orthotopic syngeneic mínimamente invasivo de células de adenocarcinoma de pulmón de ratón como un modelo de reducción de costos y tiempo para el estudio de cáncer de pulmón de células no pequeñas.
Abstract
El uso de modelos de ratón es indispensable para el estudio de la fisiopatología de diversas enfermedades. Con respecto al cáncer de pulmón, varios modelos están disponibles, incluyendo genéticamente diseñado modelos como modelos de trasplante. Sin embargo, modelos de ratón modificados genéticamente son lentos y caros, mientras que algunos modelos de trasplante ortotópico son difíciles de reproducir. Aquí, se describe un método de entrega intratraqueal no invasivo de las células tumorales de pulmón como un modelo de trasplante orthotopic alternativos. El uso de células de adenocarcinoma de pulmón de ratón y receptores de injerto syngeneic permite estudiar tumorigenesis bajo la presencia de un sistema inmune activo. Además, las manipulaciones genéticas del tumor células antes del trasplante hace este modelo un atractivo enfoque de ahorro de tiempo para estudiar el impacto de los factores genéticos en el crecimiento del tumor y la expresión de gene de la célula de tumor perfiles bajo condiciones fisiológicas. Usando este modelo, demostramos eso pulmón células de adenocarcinoma expresados niveles crecientes del supresor de T-cell programan ligando de muerte 1 (PD-L1) cuando cultivadas en su entorno natural en comparación con el cultivo in vitro.
Introduction
Cáncer de pulmón es todavía en gran medida el más grande asesino relacionado con el cáncer en hombres y mujeres1. De hecho, según la American Cancer Society, cada año más personas mueren de cáncer de pulmón que de mama, próstata y colon cáncer juntos1. Hasta hace poco, la mayoría de los pacientes que sufren de cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP), que es el más abundante subtipo de cáncer de pulmón, fueron tratada con quimioterapia basada en platino en un entorno de primera línea, sobre todo con la adición de la angiogénesis inhibidores de la2. Sólo un subconjunto de pacientes alberga las mutaciones oncogénicas en el receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR), kinasa del linfoma anaplásico (ALK), o en ROS1 y puede tratarse con medicamentos dirigidos a disposición3,4. Con el advenimiento de los inhibidores de control inmune, ha surgido la nueva esperanza para pacientes con cáncer de pulmón, aunque hasta ahora, sólo un 20-40% de los pacientes responden a la terapia inmune5. Por lo tanto, se necesita investigación adicional para mejorar este resultado por ajuste terapia inmune checkpoint e investigando opciones de tratamiento combinatorio.
Para estudiar el cáncer de pulmón, una gran variedad de modelos preclínicos están disponible, incluyendo modelos espontáneos provocados por productos químicos y agentes carcinógenos y ratón genéticamente modelos (GEMM) donde se presentan tumores autóctonos tras la activación condicional de oncogenes o la inactivación de tumor supresor genes6,7,8. Estos modelos son de particular valor para investigar los procesos fundamentales en el desarrollo del tumor de pulmón, pero también requieren extensa ratones de cría, y los experimentos son desperdiciadores de tiempo. Por lo tanto, muchos estudios evaluando potenciales inhibidores aprovechan modelos de xenoinjerto subcutáneo (paciente de origen) en líneas celulares de cáncer humano de pulmón se inyectan por vía subcutánea en ratones inmunodeficientes9.
En estos modelos, la micromilieu de tumores no está representado en consecuencia; por lo tanto, los investigadores también utilizan modelos de trasplante orthotopic, donde las células del tumor se inyectan por vía intravenosa, intrabronchially o directamente en el pulmón parénquima10,11,12,13, 14,15,16,17,18,19,20. Algunos de estos métodos son un desafío técnico, difícil de reproducir y requieren una capacitación intensiva de los investigadores. 21 aquí adaptamos un orthotopic invasiva, método de trasplante intratraqueal en ratones inmunocompetentes, donde los tumores desarrollan dentro de 3-5 semanas y exhiben semejanzas significativas en los tumores humanos, inducir la expresión de la célula de T supresor programados ligando de muerte 1 (PD-L1) en las células del tumor. 11 , 12 , 20 el uso de las células tumorales de ratón derivadas de modelos GEMM y ratones receptores syngeneic permite el estudio adecuado del microambiente tumoral incluyendo las células inmunes. Además, gen herramientas como CRISPR/Cas9 tecnología22 de edición puede ser utilizado in vitro antes de un trasplante que facilita la investigación del impacto de factores genéticos en la tumorogénesis pulmonar.
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Protocol
Todos los protocolos experimentales como se describe a continuación siguen las directrices éticas y fueron aprobados por el Ministerio Federal austríaco de la ciencia, la investigación y la economía.
Nota: El protocolo aquí describe un modelo de trasplante ortotópico de células de adenocarcinoma de pulmón de ratón en los receptores syngeneic. Las células pueden ser aisladas de pulmones con tumores de KrasLSL-G12D: p53fl/fl (KP) ratones7,18, si están disponibles en el local y trasplantado en ratones del mismo fondo y sexo. Si las células se de otros grupos de investigación y el fondo exacto sigue siendo desconocido, se recomienda el uso de la generación F1 de un cruce entre ratones C57BL/6 y 129S como para garantizar la máxima tolerancia del trasplante.
1. preparación de la célula
- Las células de KP semilla 24 h antes del trasplante en aproximadamente 50% de confluencia en RPMI suplementado con suero de ternera fetal 10% (FCS), glutamina y 100 U/mL de penicilina y 100 de μg/mL estreptomicina (en lo sucesivo como medio de cultivo estándar). Incubar los cultivos celulares a 37° C, 5% CO2y alrededor del 95% de humedad relativa.
- Al día siguiente, las células con 1 mL de tripsina-EDTA (0,05% en solución salina tamponada con fosfato [PBS]) por 5 min por placa de 10 cm de la cosecha y, posteriormente, resuspender las células separadas con 9 mL de medio de cultivo estándar.
- Contar las células en un hemocitómetro y transferir el número de células necesarias para los experimentos en un tubo de centrífuga cónico de 50 mL.
Nota: Se recomienda trasplantar entre KP 1 x 106 y 2.5 x 105 células por ratón, pero esto podría ser adaptado basado en las necesidades del investigador. - Posteriormente, centrifugar las células durante 5 min a 300 x gaspirar el sobrenadante y, usando una pipeta, resuspender las células en una densidad de 2 x 107/ml (por la inhalación de 1 x 106 células de KP por ratón) en el suero y antibióticos RPMI , complementado con 0.01 M de ácido etilendiaminotetracético (EDTA).
- Mantener las células en hielo hasta el trasplante.
2. trasplante orthotopic vía intratraqueal entrega
- Sedar a un ratón (8-12 semanas de edad) mediante una inyección subcutánea de una mezcla de ketamina (100 mg/kg de peso corporal) y xilacina (10 mg/kg de peso corporal).
- Mientras que la anestesia se establece, preparar el catéter para la intubación. Por lo tanto, embota la aguja de un catéter cortando el extremo con las tijeras. Después, empuje completamente el catéter en el extremo de la aguja.
- Confirmar el nivel de anestesia adecuado pedal reflejo a través del dedo del pie firme pellizcando y aplicar pomada oftálmica en los ojos.
- Fijar el ratón en la plataforma de intubación (figura 1A) enganchando sus incisivos superiores sobre una sutura y confirmar que el pecho es vertical por debajo de la sutura.
- Coloque un cable de fibra óptica entre las patas delanteras para iluminar el pecho (figura 1B).
- Cuidadosamente abra la boca del ratón y sacar la lengua con unas pinzas desinfectadas de planas. Busque la emisión de luz blanca para ubicar la laringe y visualizar las epiglotis y aritenoides cartílagos (figura 1).
- Una vez que la abertura de la tráquea es claramente visible, deslice suavemente la sonda en la tráquea (figura 1). La longitud del catéter a introducir depende de la edad y el tamaño del animal, ya que no debe ir por debajo de la bifurcación para garantizar una distribución uniforme del pulmón de células de adenocarcinoma de pulmón. Retire rápidamente la aguja del catéter.
- La correcta colocación del catéter en la tráquea está indicada por la luz blanca brillante a través del catéter (Figura 1E). Para confirmar la colocación del catéter en la tráquea, acople una jeringa de 1 mL que contiene agua al catéter. El agua en la jeringa rápidamente se moverá hacia arriba y hacia abajo según la respiración (Figura 1F).
Nota: Este paso puede ser omitido por los investigadores con experiencia. - Calentar la suspensión de la célula manteniendo el tubo en la mano y, posteriormente, pipetee 50 μl de la suspensión que contiene 1 x 106 células (el número de células puede ser variable) en el centro de la muesca del catéter. La suspensión será aspirada inmediatamente. Posteriormente, conectar una jeringa de 1 mL y añada 300 μL de aire para asegurar una distribución uniforme dentro de los pulmones.
- Suavemente Retire el catéter, quitar el ratón de la plataforma de la intubación y ponerlo en una almohadilla de calor hasta que recupera de la anestesia.
3. pulmón preparación para citometría de flujo
- En el extremo experimental deseado, SEDAR el ratón mediante una inyección subcutánea de una mezcla de ketamina (100 mg/kg de peso corporal) y xilacina (10 mg/kg de peso corporal) y eutanasia por dislocación cervical.
- Remoje el cadáver en etanol al 70% y asegure el ratón sobre una tabla de disección utilizando cinta.
- Haga una incisión de línea media ventral e invierta suavemente la piel para dejar al descubierto los músculos de la pared torácica y los órganos abdominales. Perfore la membrana y corte las costillas con unas tijeras para exponer la cavidad torácica.
- Perfusión de los pulmones 3 x 6-8 ml de PBS helado a través del ventrículo derecho con una aguja de 27 G después de cortar una abertura pequeña en el ventrículo izquierdo para permitir que la sangre salir. Los pulmones deben borrarse de la sangre y vuelta completamente blanco.
- Sacar los pulmones y pique los lóbulos en trozos pequeños con unas tijeras. Transferir las piezas del pulmón a un tubo de microcentrífuga de 2 mL e incubar en 1,5 mL de tampón de digestión pulmonar (RPMI, 5% FCS, colagenasa U/mL 150 I y 50 U/mL DNasa I).
- Incubar el pulmón piezas 30-60 min a 37 ° C y con agitación constante.
- Transfiera la suspensión de células de pulmón a través de un tamiz de célula 70 μm en un tubo de 50 mL. Limpiar el filtro con la parte posterior de una jeringa estéril de 10 mL y enjuagar el filtro con 15 mL de PBS con FCS 2%.
- Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min a 4 ° C y aspirar el sobrenadante. Resuspender las células en 1 mL de buffer lisis de amonio cloruro de potasio (ACK) e Incube por 5 min a temperatura ambiente durante la lisis de los eritrocitos residuales.
- Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min a 4 ° C y resuspender las células en 1 mL de PBS con 2% de FCS y proceder con el protocolo de tinción deseado para citometría de flujo23.
Nota: Alternativamente, pueden ser serán suspendidas las células en RPMI conteniendo 30% FCS y 10% DMSO y congelado utilizando un recipiente congelación para posterior análisis.
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Representative Results
Se utilizó el modelo de trasplante ortotópico vía intratraqueal entrega de células de tumor para probar si el microambiente tumoral estimula la expresión de PD-L1. Por lo tanto, se aislaron células de pulmón AC de ratón desde el modelo autóctono de KP (células de KP), 10 semanas después de inducción de tumor a través expresión recombinase de Cre adenovirus (Ad.Cre) entrega24. Posteriormente, etiquetamos el pulmón células AC usando una proteína fluorescente verde (GFP)-expresión de lentivirus25 y orthotopically engrafted en entrega de ratones inmunocompetentes, syngeneic vía intratraqueal. Para validar el modelo, trasplantado diferentes cantidades de las células del tumor y análisis de supervivencia. Como era de esperar, la supervivencia de los ratones receptores se correlacionó con el número de células implantadas, y la supervivencia fue de entre 2 semanas para los receptores de 2 x 106 células y alrededor de 10 semanas para los receptores de 2.5 x 105 células (figura 2A). Cuando los pulmones se disecaron tras la muerte de los ratones utilizados para el análisis de supervivencia, nos dimos cuenta de una distribución uniforme de los nódulos del tumor a lo largo de todos los lóbulos de los pulmones (figura 2B). En cuanto a la morfología de los tumores, en comparación con tumores trasplantados con autóctonas KRASG12D-impulsado por tumores7 y no notó ninguna diferencia obvia (figura 2).
Para estudiar la expresión de PD-L1 de células tumorales trasplantadas, sacrificados a ratones receptores 3 semanas después del trasplante de 1 x 106 células y preparar los pulmones para análisis cytometric del flujo. Sondeo para la expresión de PD-L1 y bloquean las células GFP+ , se identificó un cambio significativo en las células positivas en comparación con células cultivadas de PD-L1+ in vitro (Figura 2D). Por lo tanto, hemos validado este modelo como un modelo de ahorro de tiempo para probar para las alteraciones de la expresión del gene en las células del tumor bajo condiciones fisiológicas, que, por ejemplo, pueden utilizarse para investigar los efectos de alteraciones genéticas o de tratamientos farmacológicos en la PD-L1 expresión en células de pulmón AC.
Figura 1 : Intratraqueal del trasplante del pulmón tumor celular. (A) este panel muestra los caseros intubación plataforma utilizando una tapa de poliestireno, dos tubos de 15 mL y una sutura de seda 6.0. (B) el cable de fibra óptica se dirige al pecho del ratón y (C) después de sacar suavemente de la lengüeta, puede verse la luz blanca emitida por la abertura de la tráquea. (D y E) la colocación correcta del ratón está indicada por la luz brillante a través del catéter y puede ser verificada (F) por el movimiento hacia arriba y abajo del agua colocado en una jeringa de 1 mL. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Morfología de los pulmones de ratón siguiendo syngeneic, trasplante intratraqueal de las células del pulmón AC. (A) este panel muestra un análisis de Kaplan Meier de los ratones receptoras tras el trasplante ortotópico de cantidades diferentes de las células del tumor. Las cantidades de las células del tumor usadas para distribuir la intratraqueal se indican en la leyenda de. (B) es un cuadro representativo de un pulmón de un ratón receptor de célula tumoral. Es el pulmón de un ratón que recibió las células 5 x 105 y 43 días después del trasplante de los difuntos. (C) este panel muestra una hematoxilina y eosina de la sección del pulmón de tumores autóctonas 10 semanas después de la entrega de Ad.Cre (panel izquierdo) y 6 semanas tras el trasplante ortotópico de 5 x 105 células del tumor (panel derecho), incluyendo un aumento mayor de las zonas indicadas (abajo). (D) el PD-L1 expresión fue medida por citometría de flujo en GFP+ KP las células después de cultivo in vitro en condiciones estándar (antes del trasplante, rojo) y después de trasplante ortotópico y aislamiento de los pulmones del ratón 3 semanas engraftment siguiente (después del trasplante, azul). Rat IgG2a PE-Cyanine7 fue utilizado como control de isotipo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Para estudiar eventos fisiológicos y patológicos del pulmón en el pulmón, métodos de intubación endotraqueal invasiva y no invasiva para la instilación de diversos reactivos son ampliamente utilizado26,27,28,29 ,30,31,32. En el campo del cáncer, los investigadores utilizan la intratraqueal (y intranasal) la instilación de los virus expresando su recombinase de Cre para introducir mutaciones somáticas en las células epiteliales de pulmón. La administración de un Ad.Cre o lentivirus permite la activación condicional de k-Ras oncogénico en los ratones de KRAS-LSL-G12D, concomitante con el nocaut de p53 en células transduced, cuando se crían ratones p53-floxed ratones7. La posibilidad de estudiar la tumorigénesis pulmonar desde la etapa más temprana hasta la muerte del animal, así como una alta similitud entre ratón tumores y tumores humanos, hace que estos modelos extremadamente popular. Sin embargo, desde un punto de vista práctico, este modelo requiere la cría de ratón extenso para el estudio de genotipos diferentes, y en algunos genotipos, experimentos pueden tomar hasta un año de la inducción del tumor hasta el extremo experimental. Esto requiere ratón mayor espacio y, por lo tanto, los costos para ratón vivienda.
La posibilidad de manipular fácilmente las células del tumor in vitro mediante el uso de tecnología CRISPR Cas922 hace modelos de trasplante orthotopic una alternativa rápida para estudiar los efectos de los genes seleccionados en perfiles de expresión de tumor y el crecimiento del tumor. El etiquetado de las células tumorales puede usarse para el monitoreo en tiempo real del crecimiento del tumor con los toner de la vivo de la célula o para ordenar a las células del tumor según sus etiquetas. Esto también permite una fácil cuantificación de las células del tumor (es decir, carga tumoral) según sus etiquetas. Una vez establecido, este método de entrega de células de tumor es altamente reproducible. En comparación con el trasplante orthotopic del via cola vena entrega, las células del tumor se entregan directamente a su ambiente natural en los pulmones, mientras que la exposición a la sangre y sus componentes puede alterar propiedades de la célula del tumor. Además, los efectos de los genes manipulados en la supervivencia de la célula del tumor en el torrente sanguíneo y extravasación a los pulmones no están claros y pueden resultar en alteraciones del genotipo dependiente de la cantidad de las células a los pulmones.
En el modelo descrito aquí, tumores extienden simétricamente por todo el pulmón. Esto permite que la independiente recolección y análisis de diversas lesiones, por ejemplo, un lóbulo puede someterse a análisis de citometría de flujo como se describe anteriormente, mientras que el otro lóbulo puede ser utilizado para el análisis de immunohistochemical, preparación de lisado de pulmón, etcetera. Crecimiento resultado de tumores en la muerte del ratón receptor dentro de 3 a 10 semanas después del parto intratraqueal, depende del número de células utilizadas. Esto permite al investigador de adaptar el número de células trasplantadas a las necesidades individuales, y menor número de células permite el crecimiento del tumor más tiempo y exposición de células de tumor en el microambiente. Por otro lado, un mayor número de células se puede desear para que estudios farmacológicos acortar el período de entrega de la droga.
Una vez establecida, la administración intratraqueal de las células del tumor es altamente reproducible. Sin embargo, algunos puntos críticos tienen que ser considerados al realizar este procedimiento. En primer lugar, se debe tener precaución para evitar daños en los tejidos al desplazar la lengua con las pinzas y, en particular, cuando se inserta el catéter. Para la colocación del catéter, es esencial que el investigador puede ver claramente la luz blanca para localizar la abertura de la tráquea. Sin embargo, por error, el catéter pueda ser insertado fácilmente en el esófago yuxtapuesto. Por lo tanto, le recomendamos siempre verificar la correcta colocación del catéter en la tráquea como se describió anteriormente. También es esencial para evitar colocar el catéter a profundo (es decir, el catéter no se debe colocar debajo de la bifurcación bronquial). Esto garantiza una distribución uniforme de las células del pulmón y, por tanto, los tumores en los pulmones.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Safia Zahma por su ayuda con la preparación de las secciones de tejido.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mouse lung adenocarcinoma cell line | isolated in house | ||
| C57Bl/6 mice | F1 of the cross of the two backgrounds may be used (8-12 weeks) | ||
| 129S mice | |||
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11544446 | |
| Fetal Calf Serum | Life Technologies | 11573397 | |
| Penicillin/Streptomycin Solution | Life Technologies | 11548876 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 11539876 | |
| Trypsin, 0.25% (1x) with EDTA | Life Technologies | 11560626 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
| Ketasol (100 mg/mL Ketamine) | Ogris Pharma | 8-00173 | |
| Xylasol (20 mg/mL Xylazine) | Ogris Pharma | 8-00178 | |
| BD Insyste (22 GA 1.00 IN) | BD | 381223 | |
| Blunt forceps | Roboz | RS8260 | |
| Leica CLS150 LED | Leica | 30250004 | Fibre Light Illuminator |
| Student Iris Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| DNase I (RNase-Free) | New England Biolabs | M0303S | |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100017 | |
| ACK Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | |
| CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-5982-82 | |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4321-82 |
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