Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

أورثوتوبيك زرع الخلايا غدية الرئة سينجينيك لدراسة التعبير PD-L1

Published: January 19, 2019 doi: 10.3791/58101
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 2, 1,2
1Department of Physiology, Center of Physiology and Pharmacology & Comprehensive Cancer Center (CCC), Medical University of Vienna, 2Ludwig Boltzmann Institute for Cancer Research (LBI-CR)

Summary

هنا يصف لنا نموذج أورثوتوبيك سينجينيك مينيملي زرع خلايا غدية الرئة الماوس كنموذج تخفيض وقت وتكلفة لدراسة الخلية غير الصغيرة سرطان الرئة.

Abstract

استخدام نماذج الماوس لا غنى عنه لدراسة الفسيولوجيا المرضية للأمراض المختلفة. فيما يتعلق بسرطان الرئة، والعديد من النماذج المتاحة، وراثيا بما في ذلك تصميم النماذج، فضلا عن نماذج الزرع. نماذج الماوس المهندسة وراثيا غير مضيعة للوقت وباهظة التكاليف، بينما بعض نماذج زرع أورثوتوبيك يصعب إعادة إنتاجها. هنا، يوصف بأسلوب توصيل تحسن غير الغازية للرئة ورم الخلايا كنموذج لزرع أورثوتوبيك بديلة. يسمح استخدام الماوس الرئة خلايا غدية والمتلقين الاختلاس سينجينيك دراسة tumorigenesis تحت وجود نظام المناعة نشط بشكل كامل. وعلاوة على ذلك، التلاعبات الجينية لورم الخلايا قبل الزرع يجعل ملامح هذا النموذج نهج توفير الوقت جذابة لدراسة أثر العوامل الوراثية على نمو الورم والتعبير الجيني في خلايا الورم تحت الظروف الفسيولوجية. باستخدام هذا النموذج، نعرض هذه الرئة خلايا غدية المبرمجة صريح زيادة مستويات القامع تي خلية الموت-يجند 1 (PD-L1) عندما نمت في بيئتها الطبيعية بالمقارنة مع زراعة في المختبر.

Introduction

سرطان الرئة هو لا تزال حتى الآن أكبر قاتل المتصلة بالسرطان في كل من الرجال والنساء1. وفي الواقع، وفقا "جمعية السرطان الأمريكية"، كل سنة أكثر الناس يموتون بسبب سرطان الرئة من الثدي والبروستاتا، والقولون السرطان معا1. وحتى وقت قريب، أغلبية المرضى الذين يعانون من سرطان الرئة الخلية غير الصغيرة (NSCLC)، وهو النوع الأكثر وفرة من سرطان الرئة، تعامل مع العلاج الكيميائي على أساس البلاتين في السطر الأول، معظمها بالإضافة إلى الأوعية مثبطات2. مجموعة فرعية فقط من المرضى المرافئ النمطان الطفرات في مستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR)، في الأورام اللمفاوية المتحولة كيناز (ALK)، أو في ROS1، ويمكن التعامل مع3،المخدرات تستهدف المتاحة4. مع ظهور مثبطات الحاجز المناعي، نشأ أمل جديد لمرضى سرطان الرئة، على الرغم من أن حتى الآن، سوى 20 – 40% مرضى تستجيب للعلاج المناعي5. ومن ثم يلزم البحث كذلك تحسين هذه النتيجة بالضبط الدقيق للعلاج المناعي نقطة تفتيش وتحقق من خيارات العلاج كومبيناتوري.

دراسة سرطان الرئة، مجموعة واسعة من النماذج السريرية المتاحة، بما في ذلك نماذج عفوية الناجمة عن المواد الكيميائية والمواد المسببة للسرطان والماوس المهندسة وراثيا نماذج (جيم) حيث تنشأ الأورام أصلي عقب تفعيل الشرطي المسرطنة و/أو المنظمة من ورم المكثف الجينات6،،من78. هذه النماذج ذات قيمة خاصة للتحقيق في العمليات الأساسية في التنمية ورم في الرئة، ولكن يحتاجون أيضا إلى الفئران واسعة تربية، والتجارب مضيعة للوقت. ولذلك، العديد من دراسات تقييم احتمال مثبطات الاستفادة من نماذج إكسينوجرافت تحت الجلد (المستمدة من المريض) حيث يتم حقن خطوط خلايا سرطان الرئة البشرية تحت الجلد في الفئران العوز9.

في هذه النماذج، لم يتم تمثيل ميكروميليو الأورام تبعاً لذلك؛ ومن ثم، الباحثون أيضا استخدام نماذج زرع أورثوتوبيك، حيث يتم حقن الخلايا السرطانية عن طريق الوريد، إينترابرونتشيالي، أو مباشرة في الرئة حمة10،11،،من1213، 14،15،16،،من1718،،من1920. بعض هذه الطرق صعبة من الناحية الفنية، من الصعب على استنساخ، وتتطلب تدريبا مكثفا للباحثين. 21 هنا يمكننا تكييفه أورثوتوبيك غير الغازية، تحسن أسلوب زرع في الفئران الأشخاص، حيث وضع في غضون 3-5 أسابيع الأورام ويحمل التشابه الكبير للأورام البشرية، للحث على التعبير عن تي-الخلية القامع المبرمجة الموت-يجند 1 (PD-L1) في الخلايا السرطانية. 11 , 12 , 20 استخدام الماوس ورم الخلايا المستمدة من نماذج جيمم والفئران المستفيدة سينجينيك يتيح دراسة سليمة لورم المكروية بما في ذلك الخلايا المناعية. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام الجينات أدوات التحرير مثل كريسبر/Cas9 التكنولوجيا22 في المختبر قبل الزرع الذي يسهل التحقيق في تأثير العوامل الوراثية في الرئة توموريجينيسيس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

أقرت الوزارة الاتحادية النمساوية للعلوم والأبحاث والاقتصاد جميع البروتوكولات التجريبية المبينة أدناه واتبع المبادئ التوجيهية الأخلاقية.

ملاحظة: ويصف البروتوكول هنا نموذج أورثوتوبيك زرع خلايا غدية الرئة الماوس إلى المستلمين سينجينيك. قد تكون الخلايا المعزولة من الرئتين الورم الحاملة كراسLSL-G12D: p53fl/فلوريدا (KP) الفئران7،18، إذا كانت متوفرة داخل المنظمة، وزرع في الفئران من نفس الخلفية والجنس. إذا تم توفير خلايا من المجموعات البحثية الأخرى والخلفية الدقيق لا يزال غير معروف، نحن نوصي باستخدام الجيل F1 لعبور بين الفئران C57BL/6 و 129S زرع الأعضاء المستفيدين ضمان التسامح القصوى.

1-إعداد الخلية

  1. KP البذور الخلايا 24 ساعة قبل الزرع في حوالي 50% في كونفلوينسي في استكماله بمصل العجل الجنين 10% (FCS) والبنسلين يو/مليلتر 100 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين (يشار إليه فيما يلي مستنبت القياسي)، الجلوتامين، ربمي. احتضان الثقافات الخلية في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2، وحوالي 95% رطوبة نسبية.
  2. في اليوم التالي، حصاد الخلايا باستخدام 1 مل التربسين-يدتا (0.05% في المحلول الملحي مخزنة الفوسفات [برنامج تلفزيوني]) لمدة 5 دقائق كل لوح 10 سم، وفي وقت لاحق، ريسوسبيند خلايا منفصلة مع 9 مل مستنبت القياسي.
  3. عد الخلايا في هيموسيتوميتير ونقل العدد الخلايا اللازمة للتجارب في أنبوب 50 مل مخروطية أجهزة الطرد مركزي.
    ملاحظة: نوصي بزرع الخلايا في الماوس بين 2.5 × 105 و 1 × 106 KP، لكن هذا قد يكون تكييفها على أساس الاحتياجات للباحث.
  4. في وقت لاحق، الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في 300 x زونضح المادة طافية، واستخدام ماصة، ريسوسبيند الخلايا في كثافة من 2 × 107/mL (لاستنشاق 1 × 106 KP الخلايا الواحدة الماوس) في مصل الدم وربمي خالية من المضادات الحيوية ، وتستكمل مع حمض الإيثيلين 0.01 متر (يدتا).
  5. تبقى الخلايا على الجليد حتى زرع الأعضاء.

2-أورثوتوبيك زرع عن طريق إعطاء إيصال

  1. رصانة ماوس (8-12 أسبوعا عمر) الحقن تحت الجلد من خليط من الكيتامين (100 مغ/كغ وزن الجسم) وإكسيلازيني (10 مغ/كغ وزن الجسم).
  2. في حين يعين التخدير، تعد القسطرة التنبيب. ولذلك، بصراحة الإبرة لقسطرة ببساطة قطع النهاية مع المقص. وبعد ذلك، دفع القسطرة تماما على نهاية الإبرة.
  3. تأكيد مستوى مناسب من التخدير بدواسة منعكس عن طريق شركة تو معسر وتطبيق مرهم العيون إلى العيون.
  4. إصلاح الماوس على منصة تنبيب (الشكل 1A) عن طريق تركيب القواطع العلوية لها أكثر خياطة والتأكد من أن الصدر الرأسي تحت الخياطة.
  5. ضع كابل الألياف بصرية بين الأرجل الأمامية لإلقاء الضوء على الصدر (الشكل 1B).
  6. فتح فم الماوس وسحب اللسان باستخدام الملقط شقة تطهيرها بعناية. ابحث عن انبعاث الضوء الأبيض لتحديد موقع الحنجرة وتصور غضاريف epiglottis وأريتينويد (الشكل 1).
  7. بمجرد فتح القصبة الهوائية مرئية بوضوح، بلطف الشريحة القسطرة في القصبة الهوائية (الشكل 1). يعتمد طول القسطرة لإدراجها على السن وحجم الحيوان، نظراً لأنه لا ينبغي أن تمر دون التشعب تضمن توزيعاً حتى الرئة خلايا غدية داخل الرئة. بسرعة إزالة الإبرة من القسطرة.
  8. تتم الإشارة إلى الموضع الصحيح من القسطرة في القصبة الهوائية على ضوء أبيض ساطع من خلال القسطرة (الشكل 1E). من أجل تأكيد وضع القسطرة في القصبة الهوائية، إرفاق حقنه 1 مل يحتوي على الماء بالقسطرة. سوف سرعة نقل المياه في المحاقن صعودا وهبوطاً وفقا للتنفس (الشكل 1F).
    ملاحظة: يمكن أن يتم حذف هذه الخطوة من الباحثين ذوي الخبرة.
  9. الاحماء تعليق خلية بعقد الأنبوب في متناول اليد، وفي وقت لاحق، "الماصة؛" 50 ميليلتر من تعليق تحتوي على خلايا 1 × 106 عدد الخلايا (قد يكون المتغير) في مركز المحور القسطرة. سوف يستنشق التعليق على الفور. وفي وقت لاحق، إرفاق حقنه 1 مل والاستغناء عن 300 ميليلتر من الهواء لضمان توزيع متسقة داخل الرئتين.
  10. إزالة القسطرة بلطف وإزالة الماوس من منصة تنبيب ووضعه على لوح حرارة حتى أنه يتعافى من التخدير.

3-الرئة التحضير للتدفق الخلوي

  1. في النهاية التجريبية المطلوبة ورصانة الماوس الحقن تحت الجلد من خليط من الكيتامين (100 مغ/كغ وزن الجسم) وإكسيلازيني (10 مغ/كغ وزن الجسم) و euthanize عليه بخلع عنق الرحم.
  2. نقع الذبيحة في الإيثانول 70% وتأمين الماوس على لوحة تشريح باستخدام الشريط.
  3. جعل شق خط الوسط البطني وعكس بلطف الجلد لفضح عضلات جدار الصدر والبطن الأجهزة. ثقب الحجاب الحاجز وقطع الأضلاع مع مقص لفضح تجويف الصدر.
  4. نتخلل الرئتين 3 x مع مل 6-8 من برنامج تلفزيوني المثلج من خلال البطين الأيمن باستخدام إبرة ز 27 بعد قطع فتحه صغيرة في البطين الأيسر للسماح للدم بمغادرة. ينبغي إزالة الرئتين الدم ودورة بيضاء تماما.
  5. تأخذ بها الرئتين وتخطر الفصوص إلى قطع صغيرة باستخدام مقص. نقل القطع الرئة إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 2 مل واحتضان ذلك في 1.5 مل من الرئة الهضم المخزن المؤقت (ربمي، 5 ٪ السفح، 150 يو/مليلتر كولاجيناز الأول، و 50 يو/مليلتر الدناز أنا).
  6. احتضان الرئة القطع 30-60 دقيقة عند 37 درجة مئوية ومع الرج المستمر.
  7. نقل تعليق خلية الرئة من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب 50 مل. واضحة في المصفاة مع الجزء الخلفي من حقنه 10 مل العقيمة وشطف المصفاة مع 15 مل من برنامج تلفزيوني مع FCS 2%.
  8. الطرد المركزي الخلايا في 300 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية ونضح المادة طافية. ريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل من كلوريد الأمونيوم-البوتاسيوم (ACK) العازلة ليسينج واحتضانها لهم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتحلل من الكريات الحمراء المتبقية.
  9. الطرد المركزي الخلايا في 300 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل من برنامج تلفزيوني مع FCS 2% والمضي قدما في البروتوكول المصبوغة المطلوب للتدفق الخلوي23.
    ملاحظة: بدلاً من ذلك، قد يكون حراكه الخلايا في ربمي التي تحتوي على 30% FCS و 10% [دمس] وتجميد استخدام حاوية تجميد لتحليلها في وقت لاحق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

أننا باستخدام طراز زرع أورثوتوبيك عن طريق إعطاء إيصال خلية الورم لاختبار ما إذا كان ورم المكروية يحفز التعبير PD-L1. ولذلك، نحن عزل خلايا الرئة AC الماوس من طراز KP أصلي (KP الخلايا)، 10 أسابيع عقب التعريفي الورم عن طريق لجنة المساواة العرقية-ريكومبيناسي-وإذ يعرب عن تسليم إتش (Ad.Cre)24. في وقت لاحق، ونحن المسمى الرئة خلايا AC تستخدم بروتين فلوري أخضر (التجارة والنقل)-التعبير عن لينتيفيروس25 وأورثوتوبيكالي انجرافتيد لهم في الفئران الأشخاص، سينجينيك عن طريق إعطاء إيصال. للتحقق من صحة النموذج، زرع كميات مختلفة من الخلايا السرطانية، وإجراء تحليل البقاء على قيد الحياة. كما هو متوقع، كان يرتبط بقاء الفئران المستفيدة إلى عدد الخلايا انجرافتيد، وكان الوقت البقاء على قيد الحياة بين 2 أسابيع للمستفيدين من 2 × 106 خلايا وحوالي 10 أسابيع بالنسبة للمستفيدين 2.5 × 105 الخلايا (الشكل 2A). عندما تم تشريح الرئتين بعد وفاة الفئران المستخدمة لتحليل البقاء على قيد الحياة، فقد لاحظنا توزيع حتى العقيدات الورم في جميع أنحاء جميع الفصوص في الرئتين (الشكل 2). فيما يتعلق بالتشكل الأورام، قارنا الأورام المزروعة مع أصلي كراسG12D-مدفوعة الأورام7 ولم تلاحظ أي فرق واضح (الشكل 2).

دراسة التعبير PD-L1 الخلايا السرطانية المزروعة ونحن euthanized الفئران المستفيدة بعد زرع الخلايا6 1 × 10 3 أسابيع والرئتين على استعداد لتحليل تدفق سيتوميتريك. التدقيق في التعبير PD-L1 والنابضة للتجارة والنقل+ الخلايا، وقد حددنا تحولاً هاما في خلايا PD-L1+ الإيجابية بالمقارنة مع الخلايا المزروعة في المختبر (الشكل 2D). ومن ثم فإننا في التحقق من هذا النموذج كنموذج توفير الوقت لاختبار التعديلات التعبير الجيني في الخلايا السرطانية في ظل الظروف الفسيولوجية، التي، على سبيل المثال، يمكن أن تستخدم للتحقيق في آثار التعديلات الوراثية أو العلاجات الدوائية في PD-L1 التعبير في خلايا الرئة التيار المتردد.

Figure 1
الشكل 1 : إعطاء زرع خلية ورم الرئة. (أ) هذا الفريق يظهر الصنع التنبيب منهاج باستخدام غطاء البوليستيرين وانبوبين 15 مل خياطة حرير 6.0. (ب) سلك الألياف البصرية تتجه إلى صدره الماوس و (ج) بعد سحب بلطف اللسان، يمكن رؤية الضوء الأبيض المنبعث من فتح القصبة الهوائية. تتم الإشارة إلى الموضع الصحيح (د وه) من الماوس بضوء ساطع من خلال القسطرة ويمكن التحقق من الحركة صعودا ونزولاً من المياه (و) وضع في حقنه 1 مل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : مورفولوجية الماوس الرئتين بعد سينجينيك، إعطاء زرع خلايا الرئة AC. (أ) هذا الفريق تعرض تحليل "كابلان ماير" للفئران المستفيدة بعد زرع أورثوتوبيك كميات مختلفة من الخلايا السرطانية. وترد المبالغ من ورم الخلايا المستخدمة لإعطاء إيصال في أسطورة. (ب) هذه صورة تمثيلية من الرئة بالماوس ورم الخلايا المتلقية. يظهر هو الرئة بالماوس التي تلقت الخلايا 5 × 105 والمتوفى 43 يوما بعد زرع الأعضاء. (ج) هذا الفريق يظهر توضع وتلطيخ ويوزين قسم أصلي أورام الرئة 10 أسابيع عقب تسليم Ad.Cre (اللوحة اليسرى) و 6 أسابيع بعد زرع الخلايا السرطانية5 5 × 10 (اللوحة اليمنى)، أورثوتوبيك بما في ذلك تكبير أعلى من المجالات المشار إليها (أسفل). (د) PD-L1 التعبير تم قياسه بواسطة التدفق الخلوي في التجارة والنقل+ KP الخلايا بعد زراعة في المختبر تحت شروط قياسية (قبل الزرع، أحمر) وبعد زرع أورثوتوبيك والعزلة من الماوس الرئتين 3 أسابيع انجرافتمينت التالية (بعد زرع الأعضاء، الأزرق). فأر IgG2a PE-Cyanine7 كعنصر تحكم ايستب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

دراسة الأحداث الرئة الفسيولوجية ومرضية في الرئة وهي أساليب تنبيب إعطاء الغازية وغير الغازية لتقطير الكواشف المختلفة المستخدمة على نطاق واسع26،،من2728،29 ،30،،من3132. استخدم الباحثون في مجال السرطان، إعطاء (وداخل الآنف) تقطير Cre-ريكومبيناسي-وإذ يعرب عن الفيروسات لإدخال طفرات جسدية في الخلايا الظهارية الرئة. الإدارة Ad.Cre أو لينتيفيروس يسمح التنشيط الشرطي من رأس ك النمطان في الفئران كراس-LSL-G12D، متزامنا مع خروج المغلوب p53 في الخلايا ترانسدوسيد، عند الفئران التي ولدت مع الفئران p53-فلوكسيد7. إمكانية دراسة الرئة توموريجينيسيس من أول مرحلة حتى وفاة الحيوان، فضلا عن تشابه عالية في الماوس الأورام والأورام البشرية، يجعل هذه النماذج شعبية للغاية. ومع ذلك، من وجهة نظر عملية، هذا النموذج يتطلب تربية الماوس مستفيضة لدراسة الأنماط الجينية المختلفة، وفي بعض الأنماط الجينية، التجارب قد يستغرق سنة من تحريض الورم حتى نقطة النهاية التجريبية. وهذا يتطلب مساحة الماوس زيادة، ومن ثم الماوس تكاليف الإسكان.

يجعل إمكانية بسهولة التعامل مع الخلايا السرطانية في المختبر باستخدام تكنولوجيا كريسبر-Cas922 أورثوتوبيك زرع نماذج بديلاً سريعة لدراسة تأثير الجينات المحددة على نمو الورم والورم التعبير التشكيلات الجانبية. يمكن استخدام وضع علامات الخلايا السرطانية للرصد في الوقت الحقيقي لنمو الأورام باستخدام التصوير خلية حية أو لفرز الخلايا السرطانية وفقا لتلك العلامات. كما يسمح هذا التحديد الكمي سهل من الخلايا السرطانية (أي عبء الورم) حسب تسمياتها. وبمجرد إنشاء، هذا الأسلوب لإيصال خلية الورم استنساخه بدرجة عالية. بالمقارنة بزرع أورثوتوبيك عن طريق الذيل الوريد التسليم، والخلايا السرطانية مباشرة يتم تسليمها إلى بيئتها الطبيعية في الرئتين، بينما التعرض للدم ومكوناته قد تغير خصائص خلية الورم. علاوة على ذلك، آثار التلاعب الجينات على بقاء خلية الورم في مجرى الدم والتسرب إلى الرئتين غير واضحة، وقد ينتج عن التعديلات المعتمدة على النمط الوراثي في الكمية الخلايا إلى الرئتين.

في نموذج الموضحة هنا، انتشار الأورام شكل متناظر في جميع أنحاء الرئة. وهذا ما يسمح بالحصاد وتحليل مختلف الآفات منفصلة، على سبيل المثال، يمكن أن تخضع فلقة واحدة للتدفق الخلوي التحليل كما هو موضح أعلاه، بينما الفص أخرى يمكن أن تستخدم لتحليل المناعي، إعداد ليساتي الرئة، إلخ. تزايد نتيجة أورام في وفاة الماوس المستفيدة خلال 3-10 أسابيع بعد إعطاء التسليم، اعتماداً على عدد الخلايا المستخدمة. يسمح هذا الباحث تكييف عدد الخلايا المزروعة لتلبية الاحتياجات الفردية، وتسمح أرقام الخلية أصغر أطول نمو الورم والورم خلية التعرض المكروية. من ناحية أخرى، قد رغبت عدد خلايا أعلى لدراسات دوائية لتقصير فترة تسليم المخدرات.

وبمجرد إنشاء، الإدارة إعطاء الخلايا السرطانية استنساخه بدرجة عالية. ومع ذلك، قد بعض النقاط الحرجة أخذها في الاعتبار عند تنفيذ هذا الإجراء. أولاً، ينبغي توخي الحذر لتجنب تلف الأنسجة عند تشريد اللسان مع الملقط، وبخاصة عندما يتم إدخال القسطرة. ولوضع القسطرة، من الضروري أن الباحث يمكن أن نرى بوضوح الضوء الأبيض لتحديد موقع فتح القصبة الهوائية. ومع ذلك، عن طريق الخطأ، القسطرة يمكن بسهولة إدراجها في المريء جوكستابوسيد. ولذلك، نوصي بالتحقق دائماً من الموضع الصحيح من القسطرة في القصبة الهوائية كما هو موضح أعلاه. من الضروري أيضا تجنب وضع القسطرة إلى أعماق (أي، القسطرة يجب إلا توضع أدناه التشعب الشعب الهوائية). وهذا يضمن توزيعاً حتى من خلايا الرئة، ومن ثم، الأورام في جميع أنحاء الرئتين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

المؤلف يود أن يشكر زاما صفية لمساعدتها بإعداد أقسام الأنسجة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
mouse lung adenocarcinoma cell line isolated in house
C57Bl/6 mice F1 of the cross of the two backgrounds may be used (8-12 weeks)
129S mice
RPMI 1640 Medium Life Technologies 11544446
Fetal Calf Serum Life Technologies 11573397
Penicillin/Streptomycin Solution Life Technologies 11548876
L-Glutamine Life Technologies 11539876
Trypsin, 0.25% (1x) with EDTA Life Technologies 11560626
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific 15575020
Ketasol (100 mg/mL Ketamine) Ogris Pharma 8-00173
Xylasol (20 mg/mL Xylazine) Ogris Pharma 8-00178
BD Insyste (22 GA 1.00 IN) BD 381223
Blunt forceps Roboz RS8260
Leica CLS150 LED Leica 30250004 Fibre Light Illuminator
Student Iris Scissors Fine Science Tools 91460-11
DNase I (RNase-Free) New England Biolabs M0303S
Collagenase Type I Life Technologies 17100017
ACK Lysing Buffer Lonza 10-548E
CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 eBioscience 25-5982-82
Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 eBioscience 25-4321-82

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
  2. Zappa, C., Mousa, S. A. Non-small cell lung cancer: current treatment and future advances. Translational Lung Cancer Research. 5 (3), 288-300 (2016).
  3. Dolly, S. O., Collins, D. C., Sundar, R., Popat, S., Yap, T. A. Advances in the Development of Molecularly Targeted Agents in Non-Small-Cell Lung. Drugs. 77 (8), 813-827 (2017).
  4. Stinchcombe, T. E. Targeted Therapies for Lung Cancer. Cancer Treatment Research. 170, 165-182 (2016).
  5. Brody, R., et al. PD-L1 expression in advanced NSCLC: Insights into risk stratification and treatment selection from a systematic literature review. Lung Cancer. 112, 200-215 (2017).
  6. Safari, R., Meuwissen, R. Practical use of advanced mouse models for lung cancer. Methods in Molecular Biology. 1267, 93-124 (2015).
  7. DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nature Protocols. 4 (7), 1064-1072 (2009).
  8. Kwon, M. C., Berns, A. Mouse models for lung cancer. Molecular Oncology. 7 (2), 165-177 (2013).
  9. Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
  10. Chen, X., et al. An orthotopic model of lung cancer to analyze primary and metastatic NSCLC growth in integrin alpha1-null mice. Clinical & Experiment Metastasis. 22 (2), 185-193 (2005).
  11. Kang, Y., et al. Development of an orthotopic transplantation model in nude mice that simulates the clinical features of human lung cancer. Cancer Science. 97 (10), 996-1001 (2006).
  12. Kang, Y., et al. Proliferation of human lung cancer in an orthotopic transplantation mouse model. Experimental and Therapeutic. 1 (3), 471-475 (2010).
  13. Kuo, T. H., et al. Orthotopic reconstitution of human small-cell lung carcinoma after intravenous transplantation in SCID mice. Anticancer Research. 12 (5), 1407-1410 (1992).
  14. Li, B., et al. A novel bioluminescence orthotopic mouse model for advanced lung cancer. Radiation Research. 176 (4), 486-493 (2011).
  15. Mase, K., et al. Intrabronchial orthotopic propagation of human lung adenocarcinoma--characterizations of tumorigenicity, invasion and metastasis. Lung Cancer. 36 (3), 271-276 (2002).
  16. McLemore, T. L., et al. Novel intrapulmonary model for orthotopic propagation of human lung cancers in athymic nude mice. Cancer Research. 47 (19), 5132-5140 (1987).
  17. Tsai, L. H., et al. The MZF1/c-MYC axis mediates lung adenocarcinoma progression caused by wild-type lkb1 loss. Oncogene. 34 (13), 1641-1649 (2015).
  18. Winslow, M. M., et al. Suppression of lung adenocarcinoma progression by Nkx2-1. Nature. 473 (7345), 101-104 (2011).
  19. Zou, Y., Fu, H., Ghosh, S., Farquhar, D., Klostergaard, J. Antitumor activity of hydrophilic Paclitaxel copolymer prodrug using locoregional delivery in human orthotopic non-small cell lung cancer xenograft models. Clinical Cancer Research. 10 (21), 7382-7391 (2004).
  20. Buckle, T., van Leeuwen, F. W. Validation of intratracheal instillation of lung tumour cells in mice using single photon emission computed tomography/computed tomography imaging. Lab Animal. 44 (1), 40-45 (2010).
  21. Berry-Pusey, B. N., et al. A semi-automated vascular access system for preclinical models. Physics in Medicine & Biology. 58 (16), 5351-5362 (2013).
  22. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  23. Singer, B. D., et al. Flow-cytometric method for simultaneous analysis of mouse lung epithelial, endothelial, and hematopoietic lineage cells. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (9), L796-L801 (2016).
  24. Moll, H. P., et al. Afatinib restrains K-RAS-driven lung tumorigenesis. Science Translational Medicine. 10 (446), (2018).
  25. Campeau, E., et al. A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells. PLoS One. 4 (8), e6529 (2009).
  26. Gui, L., Qian, H., Rocco, K. A., Grecu, L., Niklason, L. E. Efficient intratracheal delivery of airway epithelial cells in mice and pigs. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 308 (2), L221-L228 (2015).
  27. Helms, M. N., Torres-Gonzalez, E., Goodson, P., Rojas, M. Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (42), e1941 (2010).
  28. Lin, Y. W., et al. Pharmacokinetics/Pharmacodynamics of Pulmonary Delivery of Colistin against Pseudomonas aeruginosa in a Mouse Lung Infection Model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (3), (2017).
  29. Wegesser, T. C., Last, J. A. Lung response to coarse PM: bioassay in mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 230 (2), 159-166 (2008).
  30. Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (81), e50601 (2013).
  31. Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation: a noninvasive, lung-specific delivery system. Journal of Visualized Experiments. (93), e52261 (2014).
  32. Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), e53771 (2016).

Tags

أبحاث السرطان، العدد 143، عدم الصغيرة سرطان الرئة، زرع أورثوتوبيك، مينيملي، سينجينيك، PD-L1، إعطاء إيصال
أورثوتوبيك زرع الخلايا غدية الرئة سينجينيك لدراسة التعبير PD-L1
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Moll, H. P., Mohrherr, J.,… More

Moll, H. P., Mohrherr, J., Breitenecker, K., Haber, M., Voronin, V., Casanova, E. Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression. J. Vis. Exp. (143), e58101, doi:10.3791/58101 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter