Orthotopic transplantasjon av Syngeneic lunge Adenocarcinoma celler å studere PD-L1 uttrykk
Summary
Her beskriver vi en minimal invasiv syngeneic orthotopic transplantasjon modell av musen lunge adenocarcinoma celler som tid – og å redusere kostnaden modell å studere ikke-småcellet lungekreft.
Abstract
Bruk av musen modeller er uunnværlig for å studere i Patofysiologien ved ulike sykdommer. Når det gjelder lungekreft, flere modeller er tilgjengelige, inkludert genetisk konstruert modeller samt transplantasjon modeller. Imidlertid, genmodifisert musen modeller er tidkrevende og kostbare, mens noen orthotopic transplantasjon modeller er vanskelig å gjengi. Her, er en ikke-invasiv intratracheal leveringsmetode av lunge kreftceller som en alternativ orthotopic transplantasjon modell beskrevet. Bruk av mus lunge adenocarcinoma celler og syngeneic pode mottakere kan studere tumorigenesis under tilstedeværelsen av en fullt aktivt immunforsvar. Videre genetisk manipulasjon av svulst cellene før transplantasjon gjør denne modellen en attraktiv tidsbesparende tilnærming for å studere virkningen av genetiske faktorer på tumor vekst og svulst celle genuttrykk profiler under fysiologiske forhold. Med denne modellen, viser vi at lunge adenocarcinoma celler programmert uttrykke økte nivåer av T-celle suppressor død-ligand 1 (PD-L1) når dyrket i sitt naturlige miljø i forhold til dyrking i vitro.
Introduction
Lungekreft er fortsatt den langt største kreft relatert morderen i både menn og kvinner1. Faktisk, ifølge American Cancer Society, hvert år mer mennesker dø av lungekreft enn bryst og prostata kolon kreft sammen1. Inntil nylig ble fleste pasienter som lider av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), som er den rikeste undertypen av lungekreft, behandlet med platina-baserte kjemoterapi i en første-linje, med tillegg av angiogenese hemmere2. Bare et delsett av pasienter havner kreftfremkallende mutasjoner i epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR), anaplastisk lymfom kinase (ALK) eller ROS1, og kan behandles med tilgjengelig målretting narkotika3,4. Med ankomsten av immun checkpoint hemmere, har nytt håp for lunge kreftpasienter oppstått, men til nå, bare 20-40% av pasientene svare immun terapi5. Derfor, videre forskning er nødvendig å forbedre dette resultatet ved å finjustere immun checkpoint terapi og undersøker combinatory behandlingstilbud.
For å studere lungekreft, et stort utvalg av prekliniske modeller er tilgjengelige, inkludert spontan modeller utløst av kjemikalier og kreftfremkallende og genmodifiserte musen modeller (GEMM) der autochtonous svulster oppstår etter betinget aktivering av oncogenes og/eller inaktivering av tumor suppressor gener6,7,8. Disse modellene er av spesiell verdi å undersøke grunnleggende prosesser i lunge svulst utvikling, men de krever også omfattende mus avl, og eksperimenter er tidkrevende. Derfor dra mange studier vurdere potensielle hemmere nytte av subkutan (pasient-avledede) xenograft modeller hvor menneskelige lunge kreftcelle linjer er subcutaneously injiseres i immunodeficient mus9.
I disse modellene, er micromilieu av svulster ikke representert tilsvarende; derfor bruke forskere også orthotopic transplantasjon modeller, hvor kreftceller som injiseres intravenøst, intrabronchially eller direkte i lunge parenchyma10,11,12,13, 14,15,16,17,18,19,20. Noen av disse metodene er teknisk utfordrende, vanskelig å reproduseres, og krever intensiv trening av forskerne. 21 her vi tilpasset en ikke-invasiv orthotopic, intratracheal transplantasjon metoden i immunkompetente mus, hvor svulster utvikle innen 3-5 uker og viser betydelige likheter til menneskelig svulster, til induserer uttrykk for T-celle Suppressor programmert død-ligand 1 (PD-L1) på kreftceller. 11 , 12 , 20 bruk av mus kreftceller avledet fra GEMM modeller og syngeneic mottaker mus gir riktig studere svulst microenvironment inkludert immunceller. Gene redigeringsverktøy som CRISPR/Cas9 teknologi22 kan dessuten brukes i vitro før transplantasjon som muliggjør etterforskningen av virkningen av genetiske faktorer i lunge tumorigenesis.
Protocol
Representative Results
Discussion
For å studere lunge fysiologiske og patologisk hendelser i lungene, er invasive og ikke-invasive intratracheal intubasjon metoder for instillasjon ulike reagenser brukte26,27,28,29 ,30,31,32. I feltet kreft forskere bruker intratracheal (og intranasal) instillasjon grobunn-recombinase-uttr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke Safia Zahma for hennes hjelp med utarbeidelse av vev.
Materials
| mouse lung adenocarcinoma cell line | isolated in house | ||
| C57Bl/6 mice | F1 of the cross of the two backgrounds may be used (8-12 weeks) | ||
| 129S mice | |||
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11544446 | |
| Fetal Calf Serum | Life Technologies | 11573397 | |
| Penicillin/Streptomycin Solution | Life Technologies | 11548876 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 11539876 | |
| Trypsin, 0.25% (1X) with EDTA | Life Technologies | 11560626 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
| Ketasol (100 mg/ml Ketamine) | Ogris Pharma | 8-00173 | |
| Xylasol (20 mg/ml Xylazine) | Ogris Pharma | 8-00178 | |
| BD Insyste (22GA 1.00 IN) | BD | 381223 | |
| Blunt forceps | Roboz | RS8260 | |
| Leica CLS150 LED | Leica | 30250004 | Fibre Light Illuminator |
| Student Iris Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| DNase I (RNase-Free) | New England Biolabs | M0303S | |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100017 | |
| ACK Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | |
| CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-5982-82 | |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4321-82 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
- Zappa, C., Mousa, S. A. Non-small cell lung cancer: current treatment and future advances. Translational Lung Cancer Research. 5 (3), 288-300 (2016).
- Dolly, S. O., Collins, D. C., Sundar, R., Popat, S., Yap, T. A. Advances in the Development of Molecularly Targeted Agents in Non-Small-Cell Lung. Drugs. 77 (8), 813-827 (2017).
- Stinchcombe, T. E. Targeted Therapies for Lung Cancer. Cancer Treatment Research. 170, 165-182 (2016).
- Brody, R., et al. PD-L1 expression in advanced NSCLC: Insights into risk stratification and treatment selection from a systematic literature review. Lung Cancer. 112, 200-215 (2017).
- Safari, R., Meuwissen, R. Practical use of advanced mouse models for lung cancer. Methods in Molecular Biology. 1267, 93-124 (2015).
- DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nature Protocols. 4 (7), 1064-1072 (2009).
- Kwon, M. C., Berns, A. Mouse models for lung cancer. Molecular Oncology. 7 (2), 165-177 (2013).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Chen, X., et al. An orthotopic model of lung cancer to analyze primary and metastatic NSCLC growth in integrin alpha1-null mice. Clinical & Experiment Metastasis. 22 (2), 185-193 (2005).
- Kang, Y., et al. Development of an orthotopic transplantation model in nude mice that simulates the clinical features of human lung cancer. Cancer Science. 97 (10), 996-1001 (2006).
- Kang, Y., et al. Proliferation of human lung cancer in an orthotopic transplantation mouse model. Experimental and Therapeutic. 1 (3), 471-475 (2010).
- Kuo, T. H., et al. Orthotopic reconstitution of human small-cell lung carcinoma after intravenous transplantation in SCID mice. Anticancer Research. 12 (5), 1407-1410 (1992).
- Li, B., et al. A novel bioluminescence orthotopic mouse model for advanced lung cancer. Radiation Research. 176 (4), 486-493 (2011).
- Mase, K., et al. Intrabronchial orthotopic propagation of human lung adenocarcinoma–characterizations of tumorigenicity, invasion and metastasis. Lung Cancer. 36 (3), 271-276 (2002).
- McLemore, T. L., et al. Novel intrapulmonary model for orthotopic propagation of human lung cancers in athymic nude mice. Cancer Research. 47 (19), 5132-5140 (1987).
- Tsai, L. H., et al. The MZF1/c-MYC axis mediates lung adenocarcinoma progression caused by wild-type lkb1 loss. Oncogene. 34 (13), 1641-1649 (2015).
- Winslow, M. M., et al. Suppression of lung adenocarcinoma progression by Nkx2-1. Nature. 473 (7345), 101-104 (2011).
- Zou, Y., Fu, H., Ghosh, S., Farquhar, D., Klostergaard, J. Antitumor activity of hydrophilic Paclitaxel copolymer prodrug using locoregional delivery in human orthotopic non-small cell lung cancer xenograft models. Clinical Cancer Research. 10 (21), 7382-7391 (2004).
- Buckle, T., van Leeuwen, F. W. Validation of intratracheal instillation of lung tumour cells in mice using single photon emission computed tomography/computed tomography imaging. Lab Animal. 44 (1), 40-45 (2010).
- Berry-Pusey, B. N., et al. A semi-automated vascular access system for preclinical models. Physics in Medicine & Biology. 58 (16), 5351-5362 (2013).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Singer, B. D., et al. Flow-cytometric method for simultaneous analysis of mouse lung epithelial, endothelial, and hematopoietic lineage cells. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (9), L796-L801 (2016).
- Moll, H. P., et al. Afatinib restrains K-RAS-driven lung tumorigenesis. Science Translational Medicine. 10 (446), (2018).
- Campeau, E., et al. A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells. PLoS One. 4 (8), e6529 (2009).
- Gui, L., Qian, H., Rocco, K. A., Grecu, L., Niklason, L. E. Efficient intratracheal delivery of airway epithelial cells in mice and pigs. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 308 (2), L221-L228 (2015).
- Helms, M. N., Torres-Gonzalez, E., Goodson, P., Rojas, M. Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (42), e1941 (2010).
- Lin, Y. W., et al. Pharmacokinetics/Pharmacodynamics of Pulmonary Delivery of Colistin against Pseudomonas aeruginosa in a Mouse Lung Infection Model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (3), (2017).
- Wegesser, T. C., Last, J. A. Lung response to coarse PM: bioassay in mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 230 (2), 159-166 (2008).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (81), e50601 (2013).
- Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation: a noninvasive, lung-specific delivery system. Journal of Visualized Experiments. (93), e52261 (2014).
- Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), e53771 (2016).
