Summary

Ортотопическая трансплантация клеток аденокарциномы сингенных легкого учиться выражение PD-L1

Published: January 19, 2019
doi:

Summary

Здесь мы описываем минимально инвазивной сингенных ортотопическая модель трансплантации клеток аденокарциномы легкого мыши как сокращение времени и стоимости модель для изучения немелкоклеточного рака легкого.

Abstract

Использование мыши модели необходимы для изучения патофизиологии различных заболеваний. Что касается рака легких несколько моделей доступны, включая генетически engineered моделей, а также трансплантация модели. Однако генетически модифицированные мыши модели являются длительным и дорогостоящим, тогда как некоторые модели трансплантации ортотопическая трудно воспроизвести. Здесь описан метод доставки неинвазивные трахею клеток опухоли легкого как альтернативного ортотопическая трансплантации модель. Использование мыши клеток аденокарциномы легкого и сингенных трансплантата получателей позволяет изучать tumorigenesis под наличие полностью активной иммунной системы. Кроме того генетические манипуляции опухолевых клеток до трансплантации делает эту модель привлекательной экономии времени подход для изучения влияния генетических факторов на рост опухоли и опухоли экспрессии генов в клетки профилей в физиологических условиях. С помощью этой модели, мы показываем, что легких аденокарциномы клетки Экспресс повышенного уровня Т-клеток супрессоров запрограммированных смерти лиганд 1 (PD-L1) при выращивании в их естественной среде по сравнению с выращиванием в пробирке.

Introduction

Рак легких является еще далеко большой связанных с раком убийца в1как мужчин, так и женщин. Действительно по данным американского общества рака, каждый год больше людей умирают от рака легких, чем груди, простаты и толстой кишки рак вместе1. До недавнего времени, большинство пациентов, страдающих от не-немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ), который является наиболее распространенным подтипа немелкоклеточного рака, лечили химиотерапии на основе платины в обстановке первой линии, главным образом с добавлением ангиогенеза Ингибиторы2. Только подмножество пациентов гаваней онкогенных мутаций в рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), Анапластическая лимфомы киназы (АЛК), или в ROS1 и можно лечить с помощью доступных таргетинга наркотиков3,4. С появлением ингибиторов иммунных контрольно-пропускной пункт возникла новая надежда для больных раком легкого, хотя до сих пор, только 20 – 40% пациентов реагировать иммунной терапии5. Таким образом дальнейшие исследования требуется улучшить этот результат доработки терапии иммунных контрольно-пропускной пункт и изучая комбинаторной лечения.

Для изучения рака легкого, широкий спектр доклинических моделей доступны, включая спонтанное модели вызваны химических веществ и канцерогенов и генетически модифицированные мыши модели (ГЭММ) где автохтонные опухоли возникают после условного активации Онкогены и/или инактивации опухолевые супрессоры гены6,7,8. Эти модели имеют особое значение для изучения основных процессов развития опухоли легких, но они также требуют обширной мышей разведения, и эксперименты времени. Таким образом многие исследования, оценку потенциальных ингибиторов воспользоваться подкожной Ксенотрансплантат (пациент производных) моделей где человеческих легких рак клеточных линий подкожно вводят в иммунодефицитных мышей9.

В этих моделях micromilieu опухоли не представлены соответственно; Таким образом исследователи также использовать модели ортотопическая трансплантации, где опухолевые клетки вводят внутривенно, intrabronchially или непосредственно в легких паренхимы10,11,12,13, 14,,1516,,1718,19,20. Некоторые из этих методов являются технически сложным, трудно быть воспроизведены и требуют интенсивной подготовки исследователей. 21 здесь мы адаптировали неинвазивной ортотопическая, метод трансплантации трахею иммунокомпетентных мышей, где опухоли развиваться в течение 3-5 недель и демонстрируют значительное сходство человека опухоли, чтобы побудить выражение Т-клеток подавитель запрограммированных смерти лиганд 1 (PD-L1) на опухолевые клетки. 11 , 12 , 20 использование мыши опухолевых клеток, полученных от ГЭММ модели и мышь сингенных получателей позволяет надлежащее изучение микроокружения опухоли, включая иммунные клетки. Кроме того гена, инструменты как ТРИФОСФАТЫ/Cas9 технологии22 редактирования может использоваться в лабораторных условиях до трансплантации, который облегчает изучение влияния генетических факторов в опухолей легких.

Protocol

Все экспериментальные протоколы изложенные ниже следовать этическим принципам и были одобрены австрийское федеральное министерство науки, исследований и экономики. Примечание: Протокол описывает модель ортотопическая трансплантации клеток аденокарциномы л…

Representative Results

Мы использовали модель трансплантации ортотопическая через трахею опухолевых клеток доставки для проверки ли микроокружения опухоли стимулирует выражение PD-L1. Таким образом мы изолированные клетки легких AC мыши из автохтонных модели КП (КП клетки), 10 недель после ин?…

Discussion

Для изучения легких физиологические и патологические события в легких, трахею инвазивные и неинвазивные методы интубации для инстилляций различных реагентов, широко используемых в26,27,28,29 ,30,</sup…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотели бы поблагодарить Сафии Zahma за помощь в подготовке разделов ткани.

Materials

mouse lung adenocarcinoma cell line isolated in house
C57Bl/6 mice F1 of the cross of the two backgrounds may be used (8-12 weeks)
129S mice
RPMI 1640 Medium Life Technologies 11544446
Fetal Calf Serum Life Technologies 11573397
Penicillin/Streptomycin Solution Life Technologies 11548876
L-Glutamine Life Technologies 11539876
Trypsin, 0.25% (1X) with EDTA Life Technologies 11560626
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific 15575020
Ketasol (100 mg/ml Ketamine) Ogris Pharma 8-00173
Xylasol (20 mg/ml Xylazine) Ogris Pharma 8-00178
BD Insyste (22GA 1.00 IN) BD 381223
Blunt forceps Roboz RS8260
Leica CLS150 LED Leica 30250004 Fibre Light Illuminator
Student Iris Scissors Fine Science Tools 91460-11
DNase I (RNase-Free) New England Biolabs M0303S
Collagenase Type I Life Technologies 17100017
ACK Lysing Buffer Lonza 10-548E
CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 eBioscience 25-5982-82
Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 eBioscience 25-4321-82

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
  2. Zappa, C., Mousa, S. A. Non-small cell lung cancer: current treatment and future advances. Translational Lung Cancer Research. 5 (3), 288-300 (2016).
  3. Dolly, S. O., Collins, D. C., Sundar, R., Popat, S., Yap, T. A. Advances in the Development of Molecularly Targeted Agents in Non-Small-Cell Lung. Drugs. 77 (8), 813-827 (2017).
  4. Stinchcombe, T. E. Targeted Therapies for Lung Cancer. Cancer Treatment Research. 170, 165-182 (2016).
  5. Brody, R., et al. PD-L1 expression in advanced NSCLC: Insights into risk stratification and treatment selection from a systematic literature review. Lung Cancer. 112, 200-215 (2017).
  6. Safari, R., Meuwissen, R. Practical use of advanced mouse models for lung cancer. Methods in Molecular Biology. 1267, 93-124 (2015).
  7. DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nature Protocols. 4 (7), 1064-1072 (2009).
  8. Kwon, M. C., Berns, A. Mouse models for lung cancer. Molecular Oncology. 7 (2), 165-177 (2013).
  9. Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
  10. Chen, X., et al. An orthotopic model of lung cancer to analyze primary and metastatic NSCLC growth in integrin alpha1-null mice. Clinical & Experiment Metastasis. 22 (2), 185-193 (2005).
  11. Kang, Y., et al. Development of an orthotopic transplantation model in nude mice that simulates the clinical features of human lung cancer. Cancer Science. 97 (10), 996-1001 (2006).
  12. Kang, Y., et al. Proliferation of human lung cancer in an orthotopic transplantation mouse model. Experimental and Therapeutic. 1 (3), 471-475 (2010).
  13. Kuo, T. H., et al. Orthotopic reconstitution of human small-cell lung carcinoma after intravenous transplantation in SCID mice. Anticancer Research. 12 (5), 1407-1410 (1992).
  14. Li, B., et al. A novel bioluminescence orthotopic mouse model for advanced lung cancer. Radiation Research. 176 (4), 486-493 (2011).
  15. Mase, K., et al. Intrabronchial orthotopic propagation of human lung adenocarcinoma–characterizations of tumorigenicity, invasion and metastasis. Lung Cancer. 36 (3), 271-276 (2002).
  16. McLemore, T. L., et al. Novel intrapulmonary model for orthotopic propagation of human lung cancers in athymic nude mice. Cancer Research. 47 (19), 5132-5140 (1987).
  17. Tsai, L. H., et al. The MZF1/c-MYC axis mediates lung adenocarcinoma progression caused by wild-type lkb1 loss. Oncogene. 34 (13), 1641-1649 (2015).
  18. Winslow, M. M., et al. Suppression of lung adenocarcinoma progression by Nkx2-1. Nature. 473 (7345), 101-104 (2011).
  19. Zou, Y., Fu, H., Ghosh, S., Farquhar, D., Klostergaard, J. Antitumor activity of hydrophilic Paclitaxel copolymer prodrug using locoregional delivery in human orthotopic non-small cell lung cancer xenograft models. Clinical Cancer Research. 10 (21), 7382-7391 (2004).
  20. Buckle, T., van Leeuwen, F. W. Validation of intratracheal instillation of lung tumour cells in mice using single photon emission computed tomography/computed tomography imaging. Lab Animal. 44 (1), 40-45 (2010).
  21. Berry-Pusey, B. N., et al. A semi-automated vascular access system for preclinical models. Physics in Medicine & Biology. 58 (16), 5351-5362 (2013).
  22. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  23. Singer, B. D., et al. Flow-cytometric method for simultaneous analysis of mouse lung epithelial, endothelial, and hematopoietic lineage cells. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (9), L796-L801 (2016).
  24. Moll, H. P., et al. Afatinib restrains K-RAS-driven lung tumorigenesis. Science Translational Medicine. 10 (446), (2018).
  25. Campeau, E., et al. A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells. PLoS One. 4 (8), e6529 (2009).
  26. Gui, L., Qian, H., Rocco, K. A., Grecu, L., Niklason, L. E. Efficient intratracheal delivery of airway epithelial cells in mice and pigs. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 308 (2), L221-L228 (2015).
  27. Helms, M. N., Torres-Gonzalez, E., Goodson, P., Rojas, M. Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (42), e1941 (2010).
  28. Lin, Y. W., et al. Pharmacokinetics/Pharmacodynamics of Pulmonary Delivery of Colistin against Pseudomonas aeruginosa in a Mouse Lung Infection Model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (3), (2017).
  29. Wegesser, T. C., Last, J. A. Lung response to coarse PM: bioassay in mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 230 (2), 159-166 (2008).
  30. Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (81), e50601 (2013).
  31. Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation: a noninvasive, lung-specific delivery system. Journal of Visualized Experiments. (93), e52261 (2014).
  32. Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), e53771 (2016).

Play Video

Cite This Article
Moll, H. P., Mohrherr, J., Breitenecker, K., Haber, M., Voronin, V., Casanova, E. Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression. J. Vis. Exp. (143), e58101, doi:10.3791/58101 (2019).

View Video