Ортотопическая трансплантация клеток аденокарциномы сингенных легкого учиться выражение PD-L1

Summary

Здесь мы описываем минимально инвазивной сингенных ортотопическая модель трансплантации клеток аденокарциномы легкого мыши как сокращение времени и стоимости модель для изучения немелкоклеточного рака легкого.

Abstract

Использование мыши модели необходимы для изучения патофизиологии различных заболеваний. Что касается рака легких несколько моделей доступны, включая генетически engineered моделей, а также трансплантация модели. Однако генетически модифицированные мыши модели являются длительным и дорогостоящим, тогда как некоторые модели трансплантации ортотопическая трудно воспроизвести. Здесь описан метод доставки неинвазивные трахею клеток опухоли легкого как альтернативного ортотопическая трансплантации модель. Использование мыши клеток аденокарциномы легкого и сингенных трансплантата получателей позволяет изучать tumorigenesis под наличие полностью активной иммунной системы. Кроме того генетические манипуляции опухолевых клеток до трансплантации делает эту модель привлекательной экономии времени подход для изучения влияния генетических факторов на рост опухоли и опухоли экспрессии генов в клетки профилей в физиологических условиях. С помощью этой модели, мы показываем, что легких аденокарциномы клетки Экспресс повышенного уровня Т-клеток супрессоров запрограммированных смерти лиганд 1 (PD-L1) при выращивании в их естественной среде по сравнению с выращиванием в пробирке.

Introduction

Рак легких является еще далеко большой связанных с раком убийца в¹как мужчин, так и женщин. Действительно по данным американского общества рака, каждый год больше людей умирают от рака легких, чем груди, простаты и толстой кишки рак вместе¹. До недавнего времени, большинство пациентов, страдающих от не-немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ), который является наиболее распространенным подтипа немелкоклеточного рака, лечили химиотерапии на основе платины в обстановке первой линии, главным образом с добавлением ангиогенеза Ингибиторы². Только подмножество пациентов гаваней онкогенных мутаций в рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), Анапластическая лимфомы киназы (АЛК), или в ROS1 и можно лечить с помощью доступных таргетинга наркотиков^3,4. С появлением ингибиторов иммунных контрольно-пропускной пункт возникла новая надежда для больных раком легкого, хотя до сих пор, только 20 – 40% пациентов реагировать иммунной терапии⁵. Таким образом дальнейшие исследования требуется улучшить этот результат доработки терапии иммунных контрольно-пропускной пункт и изучая комбинаторной лечения.

Для изучения рака легкого, широкий спектр доклинических моделей доступны, включая спонтанное модели вызваны химических веществ и канцерогенов и генетически модифицированные мыши модели (ГЭММ) где автохтонные опухоли возникают после условного активации Онкогены и/или инактивации опухолевые супрессоры гены^6,7,8. Эти модели имеют особое значение для изучения основных процессов развития опухоли легких, но они также требуют обширной мышей разведения, и эксперименты времени. Таким образом многие исследования, оценку потенциальных ингибиторов воспользоваться подкожной Ксенотрансплантат (пациент производных) моделей где человеческих легких рак клеточных линий подкожно вводят в иммунодефицитных мышей⁹.

В этих моделях micromilieu опухоли не представлены соответственно; Таким образом исследователи также использовать модели ортотопическая трансплантации, где опухолевые клетки вводят внутривенно, intrabronchially или непосредственно в легких паренхимы^{10,11,12,13, 14,,1516,,1718,19,20}. Некоторые из этих методов являются технически сложным, трудно быть воспроизведены и требуют интенсивной подготовки исследователей. ²¹ здесь мы адаптировали неинвазивной ортотопическая, метод трансплантации трахею иммунокомпетентных мышей, где опухоли развиваться в течение 3-5 недель и демонстрируют значительное сходство человека опухоли, чтобы побудить выражение Т-клеток подавитель запрограммированных смерти лиганд 1 (PD-L1) на опухолевые клетки. ^{11 , 12 , 20} использование мыши опухолевых клеток, полученных от ГЭММ модели и мышь сингенных получателей позволяет надлежащее изучение микроокружения опухоли, включая иммунные клетки. Кроме того гена, инструменты как ТРИФОСФАТЫ/Cas9 технологии²² редактирования может использоваться в лабораторных условиях до трансплантации, который облегчает изучение влияния генетических факторов в опухолей легких.

Protocol

Все экспериментальные протоколы изложенные ниже следовать этическим принципам и были одобрены австрийское федеральное министерство науки, исследований и экономики. Примечание: Протокол описывает модель ортотопическая трансплантации клеток аденокарциномы л…

Representative Results

Мы использовали модель трансплантации ортотопическая через трахею опухолевых клеток доставки для проверки ли микроокружения опухоли стимулирует выражение PD-L1. Таким образом мы изолированные клетки легких AC мыши из автохтонных модели КП (КП клетки), 10 недель после ин?…

Discussion

Для изучения легких физиологические и патологические события в легких, трахею инвазивные и неинвазивные методы интубации для инстилляций различных реагентов, широко используемых в^{26,27,28,29 ,30,</sup…}

Materials

mouse lung adenocarcinoma cell line			isolated in house
C57Bl/6 mice			F1 of the cross of the two backgrounds may be used (8-12 weeks)
129S mice
RPMI 1640 Medium	Life Technologies	11544446
Fetal Calf Serum	Life Technologies	11573397
Penicillin/Streptomycin Solution	Life Technologies	11548876
L-Glutamine	Life Technologies	11539876
Trypsin, 0.25% (1X) with EDTA	Life Technologies	11560626
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0	Thermo Fisher Scientific	15575020
Ketasol (100 mg/ml Ketamine)	Ogris Pharma	8-00173
Xylasol (20 mg/ml Xylazine)	Ogris Pharma	8-00178
BD Insyste (22GA 1.00 IN)	BD	381223
Blunt forceps	Roboz	RS8260
Leica CLS150 LED	Leica	30250004	Fibre Light Illuminator
Student Iris Scissors	Fine Science Tools	91460-11
DNase I (RNase-Free)	New England Biolabs	M0303S
Collagenase Type I	Life Technologies	17100017
ACK Lysing Buffer	Lonza	10-548E
CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7	eBioscience	25-5982-82
Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7	eBioscience	25-4321-82