Ortotop Transplantation av syngena lunga adenokarcinom celler att studera PD-L1-uttryck
Summary
Här beskriver vi en minimalinvasiv syngena ortotop transplantation modell mus lunga adenokarcinom celler som tid – och kostnadsbesparande modell att studera icke-småcellig lungcancer.
Abstract
Användningen av musmodeller är oumbärlig för att studera patofysiologin av olika sjukdomar. När det gäller lungcancer, flera modeller finns tillgängliga, inklusive genetiskt modifierade modeller samt transplantation modeller. Genetiskt modifierade musmodeller är dock tidskrävande och dyrt, medan vissa ortotop transplantation modeller är svårt att reproducera. Här är en icke-invasiv intratrakeal leveransmetod lung tumörceller som en alternativ ortotop transplantation modell beskrivs. Användningen av musen lunga adenokarcinom celler och syngena transplantat mottagare kan studera uppkomst under närvaro av en fullt aktiv immunförsvar. Dessutom genetiska manipulationer av tumör celler före transplantation gör denna modell en attraktiv tidsbesparande metod att studera inverkan av genetiska faktorer på tumörtillväxt och tumör cell genuttryck profiler under fysiologiska betingelser. Med denna modell, vi visar det lungan adenocarcinom celler programmerad express ökade nivåer av den T-cell UNDERTRYCKARE död-ligand 1 (PD-L1) när den odlas i deras naturliga miljö jämfört med odling in vitro.
Introduction
Lungcancer är fortfarande den överlägset den största cancerrelaterade dödsorsaken i både män och kvinnor1. Faktiskt, enligt American Cancer Society, varje år fler människor dör av lungcancer än bröst-, prostata och kolon cancer grupp1. Tills nyligen har behandlades flesta patienter som lider av icke-småcellig lungcancer (NSCLC), som är den vanligast förekommande subtypen av lungcancer, med platinabaserad kemoterapi i en första linjens miljö, mestadels med tillägg av angiogenes hämmare2. Endast en delmängd av patienter hamnar onkogena mutationer i den epidermal tillväxtfaktor (EGFR), anaplastiskt lymfomkinas (ALK) eller ROS1, och kan behandlas med tillgängliga inriktning narkotika3,4. Med tillkomsten av immun checkpoint-hämmare, har nytt hopp för lungcancerpatienter uppstått, även om förrän nu, bara 20 – 40% av patienterna svarar på immun terapi5. Därmed ytterligare krävs forskning för att förbättra detta resultat genom finjustering immun checkpoint terapi och undersöker combinatory behandlingsalternativ.
För att studera lungcancer, en mängd olika prekliniska modeller finns tillgängliga, inklusive spontana modeller utlöses av kemikalier och cancerframkallande ämnen och genmodifierade mus modeller (GEMM) där autoktont tumörer uppstår efter villkorlig aktivering av onkogener och/eller inaktivering av tumör suppressor gener6,7,8. Dessa modeller är särskilt värdefullt att undersöka grundläggande processer i lungan tumörutveckling, men de kräver också omfattande möss avel och experiment är tidskrävande. Därför, många studier utvärdera potentiella inhibitorer utnyttja subkutan (patientderiverade) xenograft-modeller där mänskliga lung cancer cell linjer subkutant injiceras i nedsatt immunförsvar möss9.
Dessa modeller, är micromilieu av tumörer inte representerad med detta; Därför använder forskare också ortotop transplantation modeller, där tumörceller injiceras intravenöst, intrabronchially eller direkt i lungan parenkymet10,11,12,13, 14,15,16,17,18,19,20. Några av dessa metoder är tekniskt utmanande, svårt att reproduceras och kräver intensiv träning av forskarna. 21 här vi anpassat en icke-invasiv ortotop, intratrakeal transplantation metod hos immunkompetenta möss, där tumörer utvecklas inom 3-5 veckor och uppvisar betydande likheter med mänskliga tumörer, att framkalla uttryck för T-cellen suppressor programmerad död-ligand 1 (PD-L1) på tumörceller. 11 , 12 , 20 användning av musen tumörceller härrör från GEMM modeller och syngena mottagarens möss tillåter ordentlig studera den tumör mikromiljö inklusive immunceller. Gen redigeringsverktyg som CRISPR/Cas9-teknik22 kan dessutom användas in vitro före transplantation som underlättar utredningen av inverkan av genetiska faktorer i lungan uppkomst.
Protocol
Representative Results
Discussion
För att studera lungcancer fysiologiska och patologiska händelser i lungan, är invasiv och noninvasiv intratrakeal intubation metoder för instillationen av olika reagenser utbredda26,27,28,29 ,30,31,32. I fältet cancer forskare använder intratrakeal (och intranasalt) instillation av C…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Safia Zahma för hennes hjälp med förberedelserna av vävnadssnitt.
Materials
| mouse lung adenocarcinoma cell line | isolated in house | ||
| C57Bl/6 mice | F1 of the cross of the two backgrounds may be used (8-12 weeks) | ||
| 129S mice | |||
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11544446 | |
| Fetal Calf Serum | Life Technologies | 11573397 | |
| Penicillin/Streptomycin Solution | Life Technologies | 11548876 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 11539876 | |
| Trypsin, 0.25% (1X) with EDTA | Life Technologies | 11560626 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
| Ketasol (100 mg/ml Ketamine) | Ogris Pharma | 8-00173 | |
| Xylasol (20 mg/ml Xylazine) | Ogris Pharma | 8-00178 | |
| BD Insyste (22GA 1.00 IN) | BD | 381223 | |
| Blunt forceps | Roboz | RS8260 | |
| Leica CLS150 LED | Leica | 30250004 | Fibre Light Illuminator |
| Student Iris Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| DNase I (RNase-Free) | New England Biolabs | M0303S | |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100017 | |
| ACK Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | |
| CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-5982-82 | |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4321-82 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
- Zappa, C., Mousa, S. A. Non-small cell lung cancer: current treatment and future advances. Translational Lung Cancer Research. 5 (3), 288-300 (2016).
- Dolly, S. O., Collins, D. C., Sundar, R., Popat, S., Yap, T. A. Advances in the Development of Molecularly Targeted Agents in Non-Small-Cell Lung. Drugs. 77 (8), 813-827 (2017).
- Stinchcombe, T. E. Targeted Therapies for Lung Cancer. Cancer Treatment Research. 170, 165-182 (2016).
- Brody, R., et al. PD-L1 expression in advanced NSCLC: Insights into risk stratification and treatment selection from a systematic literature review. Lung Cancer. 112, 200-215 (2017).
- Safari, R., Meuwissen, R. Practical use of advanced mouse models for lung cancer. Methods in Molecular Biology. 1267, 93-124 (2015).
- DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nature Protocols. 4 (7), 1064-1072 (2009).
- Kwon, M. C., Berns, A. Mouse models for lung cancer. Molecular Oncology. 7 (2), 165-177 (2013).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Chen, X., et al. An orthotopic model of lung cancer to analyze primary and metastatic NSCLC growth in integrin alpha1-null mice. Clinical & Experiment Metastasis. 22 (2), 185-193 (2005).
- Kang, Y., et al. Development of an orthotopic transplantation model in nude mice that simulates the clinical features of human lung cancer. Cancer Science. 97 (10), 996-1001 (2006).
- Kang, Y., et al. Proliferation of human lung cancer in an orthotopic transplantation mouse model. Experimental and Therapeutic. 1 (3), 471-475 (2010).
- Kuo, T. H., et al. Orthotopic reconstitution of human small-cell lung carcinoma after intravenous transplantation in SCID mice. Anticancer Research. 12 (5), 1407-1410 (1992).
- Li, B., et al. A novel bioluminescence orthotopic mouse model for advanced lung cancer. Radiation Research. 176 (4), 486-493 (2011).
- Mase, K., et al. Intrabronchial orthotopic propagation of human lung adenocarcinoma–characterizations of tumorigenicity, invasion and metastasis. Lung Cancer. 36 (3), 271-276 (2002).
- McLemore, T. L., et al. Novel intrapulmonary model for orthotopic propagation of human lung cancers in athymic nude mice. Cancer Research. 47 (19), 5132-5140 (1987).
- Tsai, L. H., et al. The MZF1/c-MYC axis mediates lung adenocarcinoma progression caused by wild-type lkb1 loss. Oncogene. 34 (13), 1641-1649 (2015).
- Winslow, M. M., et al. Suppression of lung adenocarcinoma progression by Nkx2-1. Nature. 473 (7345), 101-104 (2011).
- Zou, Y., Fu, H., Ghosh, S., Farquhar, D., Klostergaard, J. Antitumor activity of hydrophilic Paclitaxel copolymer prodrug using locoregional delivery in human orthotopic non-small cell lung cancer xenograft models. Clinical Cancer Research. 10 (21), 7382-7391 (2004).
- Buckle, T., van Leeuwen, F. W. Validation of intratracheal instillation of lung tumour cells in mice using single photon emission computed tomography/computed tomography imaging. Lab Animal. 44 (1), 40-45 (2010).
- Berry-Pusey, B. N., et al. A semi-automated vascular access system for preclinical models. Physics in Medicine & Biology. 58 (16), 5351-5362 (2013).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Singer, B. D., et al. Flow-cytometric method for simultaneous analysis of mouse lung epithelial, endothelial, and hematopoietic lineage cells. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (9), L796-L801 (2016).
- Moll, H. P., et al. Afatinib restrains K-RAS-driven lung tumorigenesis. Science Translational Medicine. 10 (446), (2018).
- Campeau, E., et al. A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells. PLoS One. 4 (8), e6529 (2009).
- Gui, L., Qian, H., Rocco, K. A., Grecu, L., Niklason, L. E. Efficient intratracheal delivery of airway epithelial cells in mice and pigs. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 308 (2), L221-L228 (2015).
- Helms, M. N., Torres-Gonzalez, E., Goodson, P., Rojas, M. Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (42), e1941 (2010).
- Lin, Y. W., et al. Pharmacokinetics/Pharmacodynamics of Pulmonary Delivery of Colistin against Pseudomonas aeruginosa in a Mouse Lung Infection Model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (3), (2017).
- Wegesser, T. C., Last, J. A. Lung response to coarse PM: bioassay in mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 230 (2), 159-166 (2008).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (81), e50601 (2013).
- Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation: a noninvasive, lung-specific delivery system. Journal of Visualized Experiments. (93), e52261 (2014).
- Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), e53771 (2016).
