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Immunology and Infection

感染 Ifnar1 小鼠 Immunoprivileged 器官寨卡病毒特异 T 细胞反应的评价

Published: October 17, 2018 doi: 10.3791/58110
Automatic Translation
*1,2, *2, *3, 1,2, 4, 2, 5, 6, 3, 1,2,4,6, 1,2
1School of Laboratory Medicine and Life Sciences, Wenzhou Medical University, 2NHC Key Laboratory of Medical Virology and Viral Diseases, National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, 3State Key Laboratory of Agrobiotechnology, College of Biological Sciences, China Agricultural University, 4Research Network of Immunity and Health (RNIH), Beijing Institutes of Life Science, Chinese Academy of Sciences, 5Laboratory Animal Center, Chinese Center for Disease Control and Prevention, 6CAS Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences
* These authors contributed equally

Summary

本文介绍了一种评估 Ifnar1-小鼠寨卡病毒 (ZIKV) 感染 immunoprivileged 器官抗原特异 T 细胞反应的协议。该方法对 ZIKV 疫苗的保护和免疫发病机制细胞机制的研究具有重要意义, 对其疗效评价也有参考价值。

Abstract

寨卡病毒 (ZIKV) 可以诱导 immunoprivileged 器官 (如大脑和睾丸) 发炎, 导致格林-–巴雷综合征和损害睾丸。在感染 ZIKV, 免疫细胞已经被证明渗入到组织。然而, 在 ZIKV 感染期间定义这些免疫细胞的保护和/或免疫发病机制的细胞机制仍在很大程度上是未知的。本文介绍了 ZIKV 感染小鼠 immunoprivileged 器官中病毒特异 T 细胞功能的评估方法。这些方法包括 a) ZIKV 感染和 Ifnar1 小鼠接种疫苗 ;b) 组织病理学、免疫荧光和免疫组化检测, 检测脑、睾丸和脾脏中的病毒感染和炎症;c) 四聚体 ZIKV T 细胞表位的制备;d) 检测从大脑、睾丸和脾脏分离的单核细胞中的 ZIKV 特异 T 细胞。使用这些方法, 可以检测到 immunoprivileged 器官中的抗原特异 t 细胞, 并评估这些 t 细胞在感染过程中的功能:通过病毒清除的潜在免疫保护和/或免疫发病机制加重炎症。这些发现也有助于澄清免疫对 ZIKV 的 T 细胞的贡献。

Introduction

ZIKV 是一种蚊媒黄病毒, 在1947年在乌干达从一只热猕猴中分离出来。最近, 由于其在美洲的迅速传播及其与小头症和格林-–巴雷综合征1、2、3的意外联系, ZIKV 已成为公共卫生紧急情况。从流行病学数据, ZIKV 被怀疑是格林-–巴雷综合征的原因在大约1每4000受感染的成人4。此外, ZIKV 与睾丸感染/损伤之间的相关性已被证明, 表明 ZIKV 感染, 在某些情况下, 可以绕过血睾丸屏障, 最终导致男性不育5.这些发现强调了完全理解在 ZIKV 感染期间诱导保护性或病理性免疫反应的重要性。

对 ZIKV 的细胞免疫反应还有很多要了解。CD4+和 CD8+ T 细胞对衣壳、包络和非结构蛋白 1 (NS1) 的反应在 ZIKV 感染的猴子和人类中观察到6,7,8。在小鼠中, 一些研究表明 CD8+ T 细胞在控制 ZIKV 复制9、10、11方面起着保护作用。重要的是, Jurado et 等表明, ZIKV 感染导致血脑屏障的击穿和 CD8+效应 T 细胞在 Ifnar1/小鼠睾丸内的血管周围浸润。此外, 他们表明, CD8+ T 细胞挑起 ZIKV 相关的瘫痪, 似乎在新生儿大脑免疫病理学发挥作用。在前一项研究中, 我们准备了 ZIKV294-302四聚体, 并表明 ZIKV 特定的 CD8+ T 细胞存在于 ZIKV 感染的 Ifnar1 小鼠的大脑和脊髓中, 这可能对设计有重要影响。和开发 ZIKV 疫苗10。

针对预防 ZIKV 感染的迫切需要, 一些疫苗处于开发的临床前阶段, 包括 RNA 疫苗、基于重组载体的疫苗和纯化的蛋白亚基疫苗。质粒 DNA 疫苗是在1阶段临床试验12。因此, 评估 ZIKV 疫苗的安全性和功效是非常重要的。疫苗的一个优点是它们能够诱发特定的 T 细胞反应, 这对于保护 ZIKV 是很重要的。利用 ZIKV 衍生的 t 细胞表位相关四聚体, 可在免疫小鼠中检测到腺病毒载体 ZIKV 疫苗诱导的 t 细胞免疫反应, 并显示 M 和 E 糖蛋白诱导出强健的抗原特异性 CD8+T 细胞免疫反应13。

在病毒感染过程中, 主要组织相容性复合物 (MHC) 分子对 t 细胞受体 (TCR) 的多肽抗原的识别是保护宿主14的重要 T 细胞介导机制。基于这一理论, 四聚体技术是一个独特的工具, 以阐明抗原特异 T 细胞在调节免疫反应中发挥的作用15。本协议描述了 ZIKV 感染的 Ifnar1小鼠模型的建立, 以及利用四聚体技术检测小鼠脾脏、脑和睾丸中的反应性 T 细胞。此外, 我们使用 ZIKV294-302四聚体检测和评价免疫小鼠 ZIKV 疫苗 (AdC7-M/E) 诱导的 T 细胞免疫反应。本研究为调查 immunoprivileged 器官中的 T 细胞反应提供指导, 并为胎盘或胎儿脑的潜在应用提供参考。

Protocol

动物实验由国家疾病控制与预防研究所机构动物护理和使用委员会批准, 中国疾控中心。所有实验都是在机构动物护理和使用委员会批准的动物协议之后进行的。

1. 病毒感染

  1. 保持成人 (6 到8周龄) Ifnar1 ( 50% 男性和50% 雌性) 小鼠在标准的特殊无菌 (SPF) 条件, 并允许他们定期获得食物和水。
  2. 通过在含有 1 x 104的病毒的聚焦形成单元 (FFUs) 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 缓冲液中,通过100 µL ZIKV 的复古轨道接种, 感染 ZIKV 的 Ifnar1 小鼠。同样, 提供具有相同体积 PBS 的控制小鼠。
    注意: 在 ABSL2 条件下感染小鼠, 并在生物安全柜中与病毒感染的老鼠一起执行这些步骤。
  3. 监测小鼠每天15天的体重和临床体征 (震颤、交错行进、双侧弛缓性后肢)。

2. ZIKV 疫苗的免疫接种

  1. 使用 Ifnar1 (50% 男性和50% 雌性) 小鼠在6和8周的年龄。保持小鼠在标准 SPF 条件下的18–29°c 和一个12小时的光/暗循环, 获得食物和水。
  2. 用 ZIKV 疫苗对 Ifnar1 小鼠进行免疫接种:通过肌内注射 (贝聿) 在 PBS 缓冲液中注射100µL AdC7-M/E [4 x 1010 (病毒微粒)], 使用1毫升注射器和 23 G 针。
  3. 同样, 注入具有相同体积 PBS 的控制小鼠。

3. 从脾脏中分离单核细胞

注意: 从脾脏的单核细胞的隔离被描述为前面提到的16。

  1. 麻醉免疫和 ZIKV 感染的小鼠 7 d 接种后, 使用5% 异氟醚 concentrationin 100% 氧气 (流速1升/分钟)。用颈椎脱位安乐死小鼠。然后, 立即将整个鼠标浸入75% 乙醇。
    注意: 从这一步起, 所有实验程序都应在生物安全柜中无菌执行。
  2. 使用针头, 固定在泡沫板上的 (安乐死, 以前受感染/免疫) 小鼠的四肢, 腹部朝上。
  3. 用无菌手术刀将腹部中线上的皮肤切开, 用剪刀切开腹部肌肉, 露出腹腔, 轻轻地取出肝脏。
    注意: 胃左侧的长而暗红色的器官是脾脏。
  4. 除去脾脏, 冲洗它3x 在 PBS 删除任何血液, 并将其放置在1.5 毫升冰冷的罗斯威尔公园纪念研究所中 (RPMI)。把脾脏放在冰上。
  5. 要从脾脏生成单细胞悬浮液, 请将器官放在50毫升管顶部的无菌40µm 网细胞过滤器上, 并添加2毫升冰冷 RPMI 培养基, 其中含有10% 胎牛血清 (FBS)。使用5毫升注射器的柱塞, 机械地捣碎器官并添加培养基, 直到器官完全地通过网格。
  6. 将细胞悬浮液转移至15毫升管, 在 600 x g处离心5分钟, 4 摄氏度。移除上清液。
  7. 用5毫升红细胞裂解缓冲液 (NH4Cl、Na2EDTA 和 KHCO3) 重悬细胞; 见材料表), 在室温下孵育裂解反应第5-6 分钟。
  8. 停止红细胞裂解与10毫升冰冷 RPMI/FBS 培养基和离心管在 600 x g 5 分钟在4摄氏度。移除上清液。
  9. 重悬细胞与10毫升完整的 RPMI 培养基 (RPMI 10% 卷/卷 FBS 和 100 U/毫升青霉素-链霉素)。将10µL 的细胞悬浮液转移到一个小管上, 将其与10µL 的 0.4% wt/卷盼蓝混合, 并使用血细胞计数器计数细胞数。

4. 从大脑和睾丸中分离单核细胞

  1. 麻醉 ZIKV 感染的雄性小鼠 7 d 接种后, 使用 5% isofluranein 100% 氧气 (流速为1升/分钟)。用颈椎脱位安乐死小鼠。然后, 立即将整个鼠标浸入75% 乙醇。
    注意: 从这一步起, 所有实验程序都必须在生物安全柜中无菌执行。从大脑和睾丸的单核细胞的分离被描述为前面提到的17。
  2. 在切割板上的容易位置固定 a (安乐死, 以前感染) 雄性老鼠。
  3. 用直 1 x 2 齿钳固定头皮, 并使用虹膜剪刀在头皮上进行中线切口以暴露头骨。
  4. 用锋利的镊子夹住轨道两侧, 修复大脑。将锋利的虹膜剪刀的一个尖端放进孔的万能, 并横向切入头骨。对另一侧重复此步骤。
  5. 使用锋利的虹膜剪刀小心地从同一个腔, 向上中线, 朝鼻子。尽量保持剪刀的末端尽可能肤浅, 以免伤害大脑。
  6. 用镊子抬起大脑, 用锋利的虹膜剪刀仔细解剖颅神经纤维。用镊子移除大脑, 将其放置在含有5毫升冰冷 RPMI/10%fbs 培养基的15毫升管内。
  7. 用镊子抓住腹部皮肤, 用锋利的虹膜剪刀, 通过珠被和腹壁进行纵向切口, 露出腹部最下部的部位。把睾丸推到切口上。用镊子轻轻拉脂肪层, 并在两侧露出球状睾丸。
  8. 用锋利的虹膜剪刀仔细解剖脂肪层和附睾。将睾丸放在含有5毫升冰冷 RPMI/10%fbs 培养基的15毫升管中, 用镊子。
  9. 要从大脑或睾丸生成单细胞悬浮液, 请将器官放在无菌细胞过滤器上, 在50毫升管顶部放置100µm 网格, 并添加2毫升冰冷 RPMI/10%fbs 培养基。使用5毫升注射器的柱塞, 捣碎器官并添加培养基, 直到器官完全地通过网格。
  10. 将细胞悬浮液转移至15毫升管, 在 600 x g处离心5分钟, 4 摄氏度。移除上清液。
  11. 用5毫升的30% 密度梯度培养基重悬细胞, 然后, 将它们非常缓慢地添加到2毫升70% 密度梯度培养基在15毫升管。
  12. 关闭制动器, 在4摄氏度的 800 x g处离心管, 30 分钟. 从中间层获得淋巴细胞。
  13. 将界面转移到一个新鲜的15毫升管, 加入10毫升冷 RPMI/10%fbs 培养基, 并离心管在 300 x g 10 分钟在4摄氏度。移除上清液。
  14. 用10毫升冰冷 RPMI/FBS 培养基重悬细胞, 并在 600 x g离心它们5分钟, 4 摄氏度。移除上清液。
  15. 用10毫升完整的 RPMI 培养基重悬细胞, 并计算像步骤3.9 中的细胞数量。

5. 四聚体准备

  1. 通过使用带有 NdeI 和 XohI 限制站点18的 pET28a 向量, 在α3域和β2m 的 C 端通过生物素化站点标记来表达 H-2Db的胞外域的质粒。
  2. 表达和准备 H-2Db和β2m 的包含体, 如前20所述。
  3. Renature 和纯化 MHC/肽复合物 H-2D294-302。
    1. 准备200毫升的复用溶液 [100 毫米三盐酸 (pH 8.0), 400 毫米 l-精氨酸, 2 毫米 EDTA Na, 5 毫米 GSG, 和0.5 毫米 GSSG]。添加蛋白酶抑制剂: 2 毫升 phenylmethylsulphonyl 氟 (PMSF, 库存100毫米), 100 µL 的 pepstatin (股票2毫克/毫升), 和100µL 亮 (股票2毫克/毫升)。在4摄氏度冷却缓冲器30分钟。
    2. 将 H-2Db、β2m 和肽添加到复用溶液中。
      1. 注射500µL β2m 溶解在胍溶液 (30 毫克/毫升库存) 使用注射器。为此, 使用 23 G 针与5毫升注射器和注入β2m 到复用溶液滴下降。保持溶液持续缓慢搅拌 150 rpm, 4 摄氏度。
      2. β2m 在复用溶液中溶解后, 在200µL DMSO 中解析2毫克 E294-302肽, 并使用移液器快速将其注入到复用溶液中。在4摄氏度下以 150 rpm 缓慢搅拌溶液15分钟。
      3. 注射1.5 毫升 H-2Db溶于胍溶液中。保持搅拌杆旋转 150 rpm 的 H-2Db的复性在4摄氏度为 8–10 H。
        注意: 该解决方案被放置在一个封闭的盒子在一个寒冷的房间。
    3. 用 10 kDa 膜将折叠蛋白浓缩在加压室中。将缓冲液 [20 mm 三盐酸 (pH8.0)、50 mm 氯化钠] 交换到腔室, 并将其浓缩到最终体积的30–50毫升。
    4. 将复用溶液转移到离心管上, 在 2500 x g处旋转15分钟, 4 摄氏度。
    5. 小心地将上清液转移到 10 kDa 离心过滤器, 并进一步集中到最终体积500µL 在 2500 x g 30 分钟。
    6. 将上清液转移到新鲜的管子, 并在 1.2万 x g旋转15分钟. 用 S200 10/300 GL 凝胶filtration 层析纯化蛋白质。
    7. 收集 MHC 复杂的峰值, 并将其集中到最终体积350µL。
  4. 要为生物素化生成 500-µL 反应体积, 请按以下顺序添加摄政: 100 µL 溶液 a [0.5M bicine (pH 8.3)], 100 µL 溶液 B (100 mm ATP, 100 mm MgOAc, 200 µΜ生物素), 100 µL 的额外 d-生物素 (500 µΜ生物素), 20 µL 芭堤雅比拉酶 (60 µg), 0.5 µL pepstatin (2 毫克/毫升), 0.5 µL 亮 (2 毫克/毫升)。在4摄氏度的夜间孵育反应管。
    注意: 不要在 biotinylating 反应中添加任何 EDTA。
  5. 使用 S200 10/300 GL 凝胶过滤柱纯化 MHC, 去除任何额外的生物素。
  6. 用链霉素移位法测定 biotinylating 效率18。
    1. 在冰上准备三个样品, a, B 和 C, 30 分钟。然后, 通过 10% SDS 页面分析结果。样本 A 由8µL 的生物素化 mhc 分子和2µL 的交换缓冲液组成, 样本 B 8 µL 的生物素化 mhc 分子和2µL 的链霉素 (20 毫克/毫升), 和2µL 的链霉素 (20 毫克/毫升) 和8µL 交换缓冲器的样本 C。
      注意: 不要煮沸样品。
  7. 形成生物素化 MHC 分子的多聚体。
    1. 通过将生物素化 E294-302肽 H2Db复合物与藻红蛋白标记的链霉素在摩尔比为 1:5, 以确保所有生物素化 MHC 分子的完全结合, 产生四聚体。
    2. 计算乙烯所需的链霉素-共轭量。
      1. 确定蛋白浓度和摩尔重量的 MHC/肽配合物的摩尔数 (例如: 总蛋白的1.8 毫克 = 40 nmol)。
      2. 通过将 MHC/肽的摩尔除以 5 (例如: 40/5 = 8 nmol 链霉素-共轭), 计算所需的链霉亲和素-共轭的摩尔。
      3. 根据链霉亲和素-共轭 (例如: 链霉亲和素-PE [30万克/米] → 8 nmol 需要 = 2400 g), 计算所需的链霉亲和量 (µg)。
    3. 将链霉素-藻红蛋白分为10个样本。将每个样品添加到含有生物素化 E294-302肽-H2Db复合物的试管中, 间隔20分钟。在加载最后一个样本后, 在黑暗中一夜之间孵育反应管4摄氏度。
  8. 将 multimerized 试剂应用于 100 kDa 离心管中, 在 2000 x g的离心时将其浓缩为4摄氏度至体积 < 100 µL。
  9. 使用 PBS (pH 8.0) 将离心管中的样品稀释至4毫升, 再将其浓缩为 < 100 µL。
  10. 在 PBS 中重复缓冲交换步骤 (pH 8.0) 4x。
  11. 使用 PBS (pH 8.0) 将总体积再次填充到500µL。将样品集中在 2000 x g的2–2.5 毫克/毫升的估计浓度4摄氏度。将样品存储在4摄氏度的黑暗中。

6. 流式细胞术

  1. 孵育细胞悬浮液 (从步骤3.9 和/或步骤 4.15) 在4摄氏度, 0.1 µL 抗鼠 CD16/CD32 Fc 受体阻断剂每20µL (稀释因子 1:200) 10 分钟, 以防止任何非特异性绑定。
  2. 离心四聚体管在 2万 x g至少15分钟在4摄氏度。
  3. 将细胞悬浮液的20µL 添加到96孔 platecontaining 1 x 106细胞中。
  4. 准备足够数量的 E294-302四聚体混合物来染色所有实验管。准备超过15% 的总体积的混合, 以考虑移液错误。稀释 e294-302四聚体 (2 毫克/毫升, 1 µL/测试) 在流化缓冲液 (PBS, 0.5% FBS), 使20µL 的 e294-302四聚体混合被添加到每个测试。
  5. 将 E294-302四聚体混合的20µL 添加到96孔板上。在这一步结束时, 每个井中的最终体积应为40µL. 室温下在黑暗中孵育板30分钟。
  6. 添加主要抗体 (FITC 共轭或 APC 共轭 anti-CD3 (0.2 毫克/毫升), PerCP 共轭 anti-CD8 (0.2 毫克/毫升)) 在1µL/测试到细胞悬浮液, 然后, 在4摄氏度孵育它在黑暗中30分钟。
  7. 用2毫升的流化缓冲液洗涤细胞 2x, 将其离心 600 x g , 5 分钟. 小心吸出上清液, 用200µL 的流化缓冲液重悬细胞。
  8. 将样品暂时储存在4摄氏度的黑暗中, 直到流式细胞术分析。
  9. 对流式细胞术分析使用以下浇口策略。
    1. 通过绘制正向散射 (FSC)与侧散点 (SSC) 区域, 在对角聚集汗衫上创建一个门。
    2. 然后, CD3+细胞通过侧散射 (SSC)与CD3 的门;其次, CD3+ CD8+细胞的门;最后, 大纲 CD8+四聚体+单元格19。

7. 组织病理学、免疫荧光和免疫组化检测

  1. 组织病理学检测
    1. 收集 ZIKV 感染的 Ifnar1 小鼠 7 d 接种后的脑和睾丸组织, 并在4% 个中性缓冲甲醛中修复它们。
      注意: 多聚甲醛是有毒的;穿戴适当的个人防护设备。
    2. 将组织嵌入石蜡中。
    3. 使用 vibratome 在 5 mm 处组织。
    4. 用苏木精和伊红 (H & E) 染色组织。
  2. 免疫组化检测
    1. 去除, 补充和抗原-检索组织切片, 根据前面描述的过程21。
    2. 治疗3% 小时2O2在 PBS (pH 7.6) 的组织切片10分钟和阻止它们与1% 牛血清白蛋白 (BSA) 10 分钟。
    3. 用大鼠抗小鼠 CD3 抗体 (稀释: 1/1000) 在室温下孵育组织切片, 然后在室温下孵育4摄氏度。
    4. 用 PBS 冲洗组织, 然后在室温下孵育3滴生物素二抗 (稀释: 1/1000) 2 h, 接着在室温下3滴亲和素-生物酶 (稀释: 1/200), 室温下30分钟。
    5. 绑定, 3 滴 30, 30-diaminobenzidine 四盐酸盐 (稀释: 1/1000), 如前22所述。
    6. 复与迈尔的苏木精的组织部分。
  3. 免疫荧光检测
    1. 在室温下风干冷冻睾丸部分 (6 毫米) 10 分钟。
    2. 用冰冷的丙酮修复它们10分钟。
    3. 用 PBS 洗涤切片 3x, 用阻塞缓冲液 (1% BSA, 0.3% 海卫, 1x PBS) 在37摄氏度进行30分钟的屏蔽。
    4. 在4摄氏度下, 用原发性抗体 (Z6) (20 µg/毫升) 孵育组织切片。
    5. 用 PBS 冲洗组织, 在37摄氏度下应用二抗 (稀释因子: 1/200) 1 h。
    6. 按照制造商的说明, 使用 PBS 洗涤组织切片并将其复为原子核, 采用 4 '、6-diamidino-2-苯基吲哚 (DAPI) (稀释因子: 1/1000)。

Representative Results

按照这些方法, 我们开发了 ZIKV 感染的小鼠模型。Ifnar1小鼠在6–8周的年龄被感染 1 x 104聚焦形成单位 (FFU) 的 ZIKV 由眶注射。病理症状和体征 (图 1A), 以及体重变化 (图 1B), 在感染 ZIKV 后 Ifnar1 小鼠观察。小鼠脑部表现出明显的水肿和充血 (图 1C)。同时, 睾丸逐渐萎缩 (图 1D)。此外, 在大脑和睾丸中发现了病理改变和组织的破坏 (图 2A)。我们进行了免疫荧光检测, 以检测大脑和睾丸中的 ZIKV (图 2B)。免疫染色在大脑和睾丸中检测到高病毒负荷 (图 2B)。免疫组化显示 CD3+ T 细胞在感染 ZIKV 后, 进入小鼠大脑的强大浸润 (图 2C)。

为了检测和评估 ZIKV 特异的 T 细胞反应, 我们制备了一只小鼠 MHC H-2D294-302四聚体。肽 E294-302可以帮助 H-2Db renature 正确, 并产生大量的可溶性 MHC i (图 3a)。在移位试验中, 可以观察到生物素化的高效率 (图 3B)。随后, 三链霉素荧光 (APC, PE 和 BV421) 标记 pMHC 四聚体被生产检测 ZIKV 特定 T 细胞 (图 3C)。与 APC 和 BV421-labeled 四聚体相比, PE 标记的四聚体检测到特定 CD8+ T 细胞的功效更高, 但差异没有统计学意义。

使用 E294-302四聚体, 我们通过流式细胞术在 7 d ZIKV (3.49 ± 0.45%) 接种后, 检测受感染小鼠脾脏 ZIKV 特异 T 淋巴细胞。此外, 与本议定书第3节所述的方法类似, 在 AdC7-M/E 疫苗免疫后4周, 脾脏中检测到 ZIKV 特异 T 淋巴细胞 (6.89 ± 1.36%)(图 4)。

此外, 我们检测到 ZIKV 感染后, 淋巴细胞渗入 immunoprivileged 器官, 如脑和睾丸。门被设置为 CD3+CD8+ T 细胞在大脑和睾丸的总淋巴细胞中选择。在大脑 (42.2% 在 CD3+CD8+ t 细胞) 和睾丸 (26.4% 在 CD3+CD8+ t 细胞) 淋巴细胞 (图 5) 中可以检测到 E294-302四聚体特定 T 细胞的高比例。

Figure 1
图 1: Ifnar1 小鼠 ZIKV 感染的表征 .Ifnar1小鼠在6–8周的年龄被感染 104聚焦形成单位 (FFU) 的 ZIKV 由眶注射, 和注射 PBS 的小鼠被用作未感染的控制。(A) 形态学和 (B) 受感染的 Ifnar1 小鼠的体重变化进行监测。红色箭头表示感染后 Ifnar1 小鼠 myeloparalysis 和运动轻截瘫。(C) 接种后 7 d 的脑部接种后和 (d) 睾丸的0、7、14和30天收获。从小鼠的大脑和睾丸的代表性图像显示与标尺, 以指示大小。误差线代表平均± SEM. n = 每组实验10只小鼠。请点击这里查看这个数字的更大版本.

Figure 2
图 2: 检测 ZIKV 感染 Ifnar1 小鼠脑和睾丸中的 ZIKV 和淋巴细胞. (A) 本小组显示 ZIKV 感染小鼠脑和睾丸组织病理学变化与 7 d 接种后的阴性对照。缩放栏 = 25 µm (左面板) 和50µm (右面板)。(B) 使用抗 ZIKV Z6 抗体 (绿色) 进行免疫荧光检测。在 7 d 接种后, 从 ZIKV 感染的小鼠身上收集所有组织样本。细胞核被 DAPI (蓝色) 染色。刻度条 = 50 µm. (C) 免疫组化显示 CD3+ T 细胞进入大脑和睾丸的强健浸润。缩放栏 = 25 µm (左面板) 和50µm (右面板)。紫色表示苏木精, 褐色代表 CD3 抗体。请点击这里查看这个数字的更大版本.

Figure 3
图 3: ZIKV 专用 pMHC 四聚体的制备.E294-302与 H-2Db的结合由体外复性阐明。蓝色表示 H-2D294-302蛋白.橙色代表无肽的阴性对照。(b) 该面板显示了 H-2D294-302移位测定法。(C) 模拟表示 PBS 控制。三链霉素荧光 (APC、PE 和 BV421)-标记 pMHC 四聚体用于检测 ZIKV 特定的 T 细胞。请点击这里查看这个数字的更大版本.

Figure 4
图 4:病毒特异 CD8 的流式细胞术分析+ZIKV 感染和疫苗免疫小鼠脾脏中的 T 细胞.Ifnar1小鼠在6-8 周的年龄要么感染 104聚焦形成单位 (FFU) 的 ZIKV 或接受单剂量 4 x 1010 AdC7-M/E 或 PBS 的病毒微粒作为一个阴性对照。7天后感染或4周后接种后, 小鼠脾细胞通过流式细胞仪采集和分析。数据显示为平均值± SD. 使用单向方差分析 (不显著: p > 0.05; *p < 0.05; **p < 0.01; *** p < 0.001; *** * p < 0.0001)进行了统计解析。请点击这里查看这个数字的更大版本. 

Figure 5
图 5: ZIKV 感染小鼠脑和睾丸病毒特异 CD8+ T 细胞的门控策略和代表性结果.在 (A) 大脑和 (B) 睾丸中显示浸润淋巴细胞的代表性图解。一系列的门被设置为选择淋巴散射+和 CD3+事件。其中, CD8+事件被门控用于分析特定的 T 细胞。请点击这里查看这个数字的更大版本.

Discussion

免疫原性 T 细胞表位在细胞免疫中起重要作用23。因此, 检测 immunoprivileged 器官中的 ZIKV 特异 t 细胞是了解 t 细胞对自然 ZIKV 感染的反应的关键方法。同时, T 细胞反应检测是研究病毒疫苗疗效的绝佳工具。在这里, 我们展示了一个全面的协议, 以可视化实验, 其中包括从脾脏, 大脑和睾丸的 ZIKV 感染小鼠的淋巴细胞的分离, 免疫显性表位 E294-302四聚体的制备和ZIKV 感染小鼠 immunoprivileged 器官中 ZIKV 特异 CD8+ T 细胞的识别。

前一项研究表明, 在男性患者的精子中可以检测到活体 ZIKV 或 RNA, 这表明 ZIKV 可以绕过血睾丸屏障, 并在生殖系统24中复制自身。之前, 我们还表明, ZIKV 可能导致睾丸损害, 导致男性不育的小鼠25。ZIKV 感染可导致恒河猴病毒血症, 病毒 RNA 可在中枢神经系统 (CNS) 以及内脏器官中检测到。免疫组化显示, ZIKV 特异抗原在中枢神经系统和多外周器官中呈现26。此外, 在小鼠模型中, ZIKV 感染可以诱导脾脏和中枢神经系统26中的抗病毒 CD8+ T 细胞反应。

与以前的工作相比, 本研究建立了系统的方法来检测 ZIKV 特异 CD8+ T 细胞反应在大脑和睾丸, 这是 immunoprivileged 的网站。评估 ZIKV 感染小鼠 immunoprivileged 器官中特定于病毒的 T 细胞的功能是非常重要的。使用四聚体检测 immunoprivileged 器官中 ZIKV 特异的 CD8+ T 细胞反应, 将大大提高我们对 ZIKV 感染及其宿主免疫反应的了解。使用 E294-302四聚体, 脑和睾丸中的病毒特异 T 细胞可以通过流式细胞术分离, 研究 ZIKV 感染期间保护和免疫发病机制的细胞机制。同时, 进一步深入研究 CD8+ T 细胞对 ZIKV 的控制作用, 或在 ZIKV 感染中增强免疫发病机制。

为了分析 immunoprivileged 器官中抗原特异的小鼠 CD8+ t 细胞反应, 我们制备了 H-2D294-302四聚体, 并通过流式细胞仪检测了 CD8+ t 细胞.四聚体是检测抗原特异 T 细胞的强大工具。在这里, 产生了三种类型的荧光染料共轭链霉素 (APC, PE 和 BV421)。虽然在检测抗原特异 T 细胞的 APC、BV421 和 pe 标记四聚体中没有统计学上的显著差异, 但 pe 标记的 pMHC 四聚体产生了最佳结果。因此, 在整个研究中使用了 PE 标记的四聚体。有趣的是, 基于 PE 标记的 H-2DbE294-302四聚体, 我们检测到在大脑和睾丸中抗原特异 t 细胞的高比例, 这表明病毒特异 t 细胞从血液的迁移能力immunoprivileged 器官。

但是, 该协议有一些限制。H-2D 294-302四聚体对人 T 细胞检测没有用处, 因为四聚体检测依赖 MHC 限制。免疫显性 HLA 限制性肽的筛选仍然需要。此外, 复古轨道感染是有效的 ZIKV 感染, 但可能不是一个方便的手术为一些调查人员。因此, 还建议其他感染途径, 包括腹膜、皮下或静脉注射。

在这里描述的协议中, 一个关键步骤是从大脑和睾丸中分离单核细胞。获得高质量的淋巴细胞是很重要的;因此, 重要的是要注意, 例如, 离心速度, 研磨组织的强度, 和大脑和睾丸组织的解剖。此外, 对于四聚体制剂, 蛋白酶抑制剂 (PMSF, pepstatin, 亮) 在保护蛋白质不被降解时很有帮助。因此, 将蛋白酶抑制剂添加到复用缓冲液中并在四聚体制备过程中交换缓冲液是有意义的。

最后, 我们提出了在 ZIKV 感染的 Ifnar1 小鼠模型 immunoprivileged 器官中检测抗原特异 T 细胞反应的方法。该平台可广泛应用于研究新出现的和重新出现的病毒的免疫机制, 可以绕过血液和 immunoprivileged 器官之间的屏障。此外, 这项研究可能为候选疫苗和免疫疗法的未来发展铺平道路。

Disclosures

作者没有任何声明。

Acknowledgments

作者感谢黄议员的英语修订。这项工作得到了中国国家重点研究和发展计划 (赠款 2017YFC1200202) 的支持, 这是中国传染性疾病研究的主要专项项目 (赠款 2016ZX10004222-003)。乔治 f. 高是中国创新研究集团国家自然科学基金 (赠款 81621091) 的主要研究员。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Z6 our lab Ma W, Li S, Ma S, et al. Zika virus causes testis damage and leads to male infertility in mice. Cell, 2016, 167: 1511-1524 e1510
CD3 Santa Cruz sc-1127; RRID: AB_631128
Fluorescein-Conjuated Affinipure Goat anti-human IgG(H+L) ZSGB-BIO ZF-0308
Rabbit Anti-Goat IgG, FITC Conjugated CWBIO CW0115
FITC anti-mouse CD3 Biolegend 17A2
APC anti-mouse CD3 Biolegend 100236
PerCP anti-mouse CD8a Biolegend 100732
Percoll GE Healthcare P8370
PMSF Ameresco 0754-5G Toxic and corrosive reagent.
Handle with care
Streptadivin BD S4762-FZ Gives a clear solution at 10mg/ml in PBS and  stored at -20 °C
Pepstatin Sigma P4265-5MG 5 mg in 2.5 mL DMSO, aliquots stored at -20 ºC
Leupeptin Sigma L8511 5 mg in 2.5 mL dH2O, aliquots stored at - 20 ºC
Peptides Scilight-peptide Must be resuspended in DMSO and stored at -20 °C
RPMI 1640 Hyclone SH30809.01 Must be stored at 4 °C
DMSO MP 219605590 Store at room temperature.
APC-Streptadivin BD 554067 Must be stored and maintained at
4 °C. Do not freeze.
FITC-Streptadivin BD 554060 Must be stored and maintained at
4 °C. Do not freeze.
PE-Streptadivin BD 554061 Must be stored and maintained at
4 °C. Do not freeze.
BV421-Streptadivin BD 563259 Must be stored and maintained at
4 °C. Do not freeze.
PageRuler Unstained Protein Ladder Thermo Fisher Scientific  26614 Must be stored at 4 °C
Cell Strainers BF BF10-5040 Store at room temperature.
Amicon Ultra 100 kDa Millipore UFC510024 Store at room temperature.
Ultracentrifuge Thermo Fisher Scientific 
FACS Cantol Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used.
Superdex 200 Increase 10/300 GL  GE healthcare 28990944
AKTA PURE GE healthcare
red blood cell lysis buffer Solarbio R1010 Store at 4 °C.

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References

  1. Dick, G. W., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), 509-520 (1952).
  2. Hazin, A. N., et al. Computed Tomographic Findings in Microcephaly Associated with Zika Virus. The New England Journal of Medicine. 374 (22), 2193-2195 (2016).
  3. Zhang, Y., et al. Highly diversified Zika viruses imported to China, 2016. Protein & Cell. 7 (6), 461-464 (2016).
  4. Cauchemez, S., et al. Association between Zika virus and microcephaly in French Polynesia, 2013-15: a retrospective study. The Lancet. 387 (10033), 2125-2132 (2016).
  5. Turtle, L., et al. Human T cell responses to Japanese encephalitis virus in health and disease. The Journal of Experimental Medicine. 213 (7), 1331-1352 (2016).
  6. Dudley, D. M., et al. A rhesus macaque model of Asian-lineage Zika virus infection. Nature Communications. 7, 12204 (2016).
  7. Osuna, C. E., et al. Zika viral dynamics and shedding in rhesus and cynomolgus macaques. Nature Medicine. 22 (12), 1448-1455 (2016).
  8. Stettler, K., et al. cross-reactivity, and function of antibodies elicited by Zika virus infection. Science. 353 (6301), 823-826 (2016).
  9. Zhao, M., Zhang, H., Liu, K., Gao, G. F., Liu, W. J. Human T-cell immunity against the emerging and re-emerging viruses. Science China Life Sciences. 60 (12), 1307-1316 (2017).
  10. Huang, H., et al. CD8+ T Cell Immune Response in Immunocompetent Mice during Zika Virus Infection. Journal of Virology. 91 (22), 00900-00917 (2017).
  11. Elong Ngono, A., et al. Mapping and Role of the CD8+ T Cell Response During Primary Zika Virus Infection in Mice. Cell Host & Microbe. 21 (1), 35-46 (2017).
  12. Marques, E. T. A., Burke, D. S. Tradition and innovation in development of a Zika vaccine. The Lancet. 391 (10120), 516-517 (2017).
  13. Xu, K., et al. Recombinant Chimpanzee Adenovirus Vaccine AdC7-M/E Protects against Zika Virus Infection and Testis Damage. Journal of Virology. , 01722-01817 (2018).
  14. Jama, B. P., Morris, G. P. Generation of human alloantigen-specific T cells from peripheral blood. Journal of Visualized Experiments. (93), e52257 (2014).
  15. Legoux, F. P., Moon, J. J. Peptide:MHC tetramer-based enrichment of epitope-specific T cells. Journal of Visualized Experiments. (68), e4420 (2012).
  16. Govindarajan, S., Elewaut, D., Drennan, M. An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen. Journal of Visualized Experiments. (105), e53256 (2015).
  17. Posel, C., Moller, K., Boltze, J., Wagner, D. C., Weise, G. Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain. Journal of Visualized Experiments. (108), e53658 (2016).
  18. Altman, J. ohnD., et al. Phenotypic Analysis of Antigen-Specific T Lymphocytes. Science. 274, 94-96 (1996).
  19. Li, H., Zhou, M., Han, J., Zhu, X., Dong, T., Gao, G. F., Tien, P. Generation of murine CTL by a hepatitis B virus-specific peptide and evaluation of the adjuvant effect of heat shock protein glycoprotein 96 and its terminal fragments. J Immunol. 174 (1), 195-204 (2005).
  20. Valkenburg, S. A., et al. Preemptive priming readily overcomes structure-based mechanisms of virus escape. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5570-5575 (2013).
  21. Shang, T., et al. Toll-like receptor-initiated testicular innate immune responses in mouse Leydig cells. Endocrinology. 152 (7), 2827-2836 (2011).
  22. Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons. Journal of Visualized Experiments. (99), e52293 (2015).
  23. Zhou, M., et al. Screening and identification of severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus-specific CTL epitopes. The Journal of Immunology. 177 (4), 2138-2145 (2006).
  24. Barzon, L., Lavezzo, E., Palu, G. Zika virus infection in semen: effect on human reproduction. The Lancet Infectious Diseases. 17 (11), 1107-1109 (2017).
  25. Ma, W., et al. Zika Virus Causes Testis Damage and Leads to Male Infertility in Mice. Cell. 167 (6), 1511-1524 (2016).
  26. Li, X. F., et al. Characterization of a 2016 Clinical Isolate of Zika Virus in Non-human Primates. EBioMedicine. 12, 170-177 (2016).

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免疫学和感染 问题 140 寨卡病毒 抗原特异 T 细胞 疫苗接种 immunoprivileged 器官 四聚体
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