Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Utvärdering av Zika Virus-specifika T-cell svar i Immunoprivileged organ av infekterade Ifnar1- / - möss

Published: October 17, 2018 doi: 10.3791/58110
Automatic Translation
*1,2, *2, *3, 1,2, 4, 2, 5, 6, 3, 1,2,4,6, 1,2
1School of Laboratory Medicine and Life Sciences, Wenzhou Medical University, 2NHC Key Laboratory of Medical Virology and Viral Diseases, National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, 3State Key Laboratory of Agrobiotechnology, College of Biological Sciences, China Agricultural University, 4Research Network of Immunity and Health (RNIH), Beijing Institutes of Life Science, Chinese Academy of Sciences, 5Laboratory Animal Center, Chinese Center for Disease Control and Prevention, 6CAS Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences
* These authors contributed equally

Summary

Ett protokoll för att utvärdera antigen-specifika T-cell svar i immunoprivileged organ Ifnar1- / - murina modellen för Zika virus (ZIKV) infektionen beskrivs. Denna metod är avgörande för att utreda de cellulära mekanismerna för skydd och immunpatogenes ZIKV vacciner och är också värdefull för deras effekt utvärdering.

Abstract

Zikaviruset (ZIKV) kan framkalla inflammation i immunoprivileged organ (t.ex., hjärnan och testiklarna), leder till Guillain-Barrés syndrom och skada testiklarna. Under en infektion med ZIKV, har immunceller visat att infiltrera i vävnaderna. De cellulära mekanismer som definierar den skydd eller immunpatogenes av dessa immunceller under en ZIKV infektion är dock fortfarande till stor del okända. Häri, beskriver vi metoder för att utvärdera funktionen virus-specifika T-celler i dessa immunoprivileged organ ZIKV-infekterade möss. Dessa metoder inkluderar en) en ZIKV infektion och vaccin-inympningen i Ifnar1- / - möss; (b) histopatologi, immunofluorescens och immunohistokemi analyser att upptäcka virusinfektion och inflammation i hjärnan, testiklarna och mjälte; (c) utarbetande av en tetramer av ZIKV-derived T-cell epitoper; (d) detektion av ZIKV-specifika T-celler i de monocyter som isolerats från hjärnan, testiklarna och mjälte. Med dessa metoder, är det möjligt att upptäcka de antigen-specifika T-celler som har infiltrerat i immunoprivileged organ och utvärdera funktionerna av dessa T-celler under infektionen: potentiella immun skydd via virus clearance och / eller immunpatogenes förvärra inflammationen. Dessa fynd kan också hjälpa för att klargöra bidrag av T-celler som induceras av immunisering mot ZIKV.

Introduction

ZIKV är en moskitburen flavivirus som isolerades första gången 1947 i Uganda från en febril rhesus makaker. Nyligen, ZIKV har blivit en folkhälsa nödsituation, på grund av dess snabba spridning i Amerika och dess oväntade koppling till mikrocefali och Guillain-Barrés syndrom1,2,3. Från epidemiologiska data, har ZIKV misstänkts vara orsaken av Guillain-Barrés syndrom i omkring 1 per 4 000 smittade vuxna4. Dessutom har en korrelation mellan ZIKV och testiklarna infektion/skadan i musmodell påvisats, tyder på att ZIKV smitta, under vissa omständigheter kan kringgå den blod-testis-barriären och så småningom leda till manlig infertilitet5 . Dessa fynd belysa vikten av att helt förstå induktion av skyddande eller patologisk immunsvar under en ZIKV infektion.

Mycket återstår läras om cellulära immunsvaret till ZIKV. CD4+ och CD8+ T-cell svar till kapsid, kuvert och ickestrukturella protein 1 (NS1) har observerats hos ZIKV-infekterade apor och människor6,7,8. Hos möss, flera studier har visat att CD8+ T celler spelar en skyddande roll i kontrollen av ZIKV replikering9,10,11. Ännu viktigare, Jurado et al. visade att en ZIKV infektion resulterar i nedbrytning av den blod - hjärnbarriären och perivaskulär infiltration av CD8+ effektor T-celler i testiklarna av Ifnar1- / - möss. Dessutom visade de att CD8+ T celler inleda ZIKV-associerade förlamning och verkar spela en roll i den neonatala hjärnan immunopathology. I en tidigare studie har vi förberett de ZIKV-E294-302 tetramer och visade att ZIKV-specifika CD8+ T celler finns i hjärna och ryggmärg ZIKV-infekterade Ifnar1- / - möss, som kan ha stor betydelse för utformningen och utveckling av ZIKV vacciner10.

Svar på brådskande behovet av vaccination att förhindra ZIKV infektioner, är flera vacciner i de prekliniska utvecklingsfaserna, inklusive RNA vacciner, rekombinant vektor-baserade vacciner och renat protein subenhet vacciner. Plasmid DNA vaccinet är i fas 1 kliniska prövningar12. Utvärderingen av säkerhet och effekt för ZIKV vacciner är därför viktig. En fördel med vacciner är deras förmåga att framkalla specifika T-cell svar, som kan vara viktiga för skydd mot ZIKV. Genom att använda ZIKV-derived T-cells epitop-relaterade tetramers, den T-cell immunoreaktivitet induceras av ett adenovirus-vektor-baserade ZIKV vaccin kunde detekteras i immuniserade mössen, och både M och E glykoproteiner visades att inducera robust antigen-specifika CD8+ T-cell immunoreaktivitet13.

Under en virusinfektion är erkännandet av peptid antigener presenteras av stora histocompatibility komplex (MHC) molekyler till T-cells receptor (TCR) en viktig T-cell-medierad mekanism för att skydda den värd14. Utifrån denna teori, är tetramer teknik ett unikt verktyg för att belysa de roller som antigen-specifika T-celler spelar i reglering av immunsvar15. Det här protokollet beskriver upprättandet av Ifnar1- / - musmodell för ZIKV infektioner, och upptäckt av reaktiva T-celler i mjälte, hjärna och testiklarna hos möss genom att använda tetramer teknik. Dessutom använde vi den ZIKV-E294-302 tetramer att identifiera och utvärdera T-cell immunoreaktivitet inducerad av ZIKV vaccin (AdC7-M/E) i immuniserade mössen. Denna studie ger vägledning för att utreda T-cell svar i immunoprivileged organ och ger en referens för de potentiella tillämpningar i moderkakan eller fostrets hjärna.

Protocol

Djurförsök godkändes av institutionella djur vård och användning kommittén av medborgareinstitutet för Viral Disease Control and Prevention, Kina CDC. Alla experimenten utfördes efter de institutionella djur vård och användning kommittén-godkända djur protokoll.

1. infektion

  1. Håll vuxen (6 till 8 veckor gamla) Ifnar1- / - (50% män och 50% kvinnliga) möss i särskilda patogenfria (SPF) standardvillkor, och låta dem regelbunden tillgång till mat och vatten.
  2. Infektera Ifnar1- / - möss med den ZIKV via en retro-orbital inokulering av 100 µL av ZIKV i en fosfatbuffrad saltlösning (PBS) buffert innehållande 1 x 104 fokus-bilda enheter (FFUs) av viruset. Likaså ge kontroll möss med en lika stor volym av PBS.
    FÖRSIKTIGHET: Infektera möss under ABSL2 förhållanden och utföra dessa procedurer med virus-infekterade möss i biosäkerhet skåp.
  3. Övervaka vikt och kliniska tecken (skakningar, vacklade mars, bilaterala slapp bakbenen) på möss dagligen i 15 dagar.

2. immunisering med ZIKV vaccin

  1. Använd Ifnar1- / - (50% män och 50% kvinnliga) möss mellan 6 och 8 veckors ålder. Hålla mössen i SPF standardvillkor för 18 – 29 ° C och en 12 h ljus/mörk cykel med tillgång till mat och vatten.
  2. Vaccinera Ifnar1- / - möss med ZIKV vaccinet: Injicera 100 µL av AdC7-M/E [4 x 1010 (viruspartiklar)] i PBS buffert via en intramuskulär injektion (i.m. rutten) med en 1 mL spruta med en 23-G nål.
  3. På samma sätt injicera kontroll möss med en lika stor volym av PBS.

3. isolering av monocyter från mjälte

Obs: Isolering av monocyter från mjälten beskrivs som tidigare nämnts16.

  1. Söva immuniserade och ZIKV-infekterade möss 7 d efter inympningen, använder en 5% isofluran concentrationin 100% syrgas (med en flödeshastighet av 1 L/min). Euthanize möss av cervikal dislokation. Sedan, genast doppa hela musen till 75% etanol.
    FÖRSIKTIGHET: från detta steg framåt, alla experimentella rutiner bör utföras aseptiskt i en biosäkerhet skåp.
  2. Med nålar, fixa lemmar (euthanized, tidigare infekterade/immuniserats) möss på skum plattan med buken uppåt.
  3. Skära huden längs buken mittlinjen till bröstkorgen med en steril skalpell, klippa magmusklerna med sax, exponera bukhålan och ta försiktigt bort levern.
    Obs: Lång, mörk-röd orgeln till vänster om magen är mjälten.
  4. Ta bort mjälten, skölj den 3 x i PBS ta bort blod och placera den i 1,5 mL iskallt Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI). Hålla mjälten på is.
  5. Att generera en encellig suspension från mjälte, placera organ(med) på en steril 40 µm-mesh cell SIL ovanpå en 50 mL tub och tillsätt 2 mL av iskall RPMI medium innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS). Hjälp kolven i en 5 mL spruta, mekaniskt mosa organ(med) och tillsätt medium tills orgeln har varit fullt marken genom maskan.
  6. Överföra cellsuspensionen till en 15 mL rör och centrifugera det 600 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Ta bort supernatanten.
  7. Återsuspendera cellerna med 5 mL av en röda blodkroppar (RBC) lyseringsbuffert (NH4Cl, Na2EDTA och KHCO3; se Tabell av material) och ruva Lysering reaktionen vid rumstemperatur i 5 – 6 min.
  8. Stoppa RBC Lys med 10 mL iskallt RPMI/FBS medium och centrifugera röret vid 600 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Ta bort supernatanten.
  9. Att resuspendera cellerna med 10 mL komplett RPMI medium (RPMI med 10% vol/vol FBS och 100 U/mL penicillin-streptomycin). Överföra 10 µL cellsuspension till ett litet rör, blanda det med 10 µL 0,4% wt/vol trypan blå och räkna antalet celler med hjälp av en hemocytometer.

4. isolering av monocyter från hjärnan och testiklarna

  1. Söva ZIKV-infekterade hanmöss 7 d efter inympningen, använder 5% isofluranein 100% syrgas (med en flödeshastighet av 1 L/min). Euthanize möss av cervikal dislokation. Sedan, genast doppa hela musen till 75% etanol.
    FÖRSIKTIGHET: Från detta steg framåt, alla experimentella procedurer måste utföras aseptiskt i en biosäkerhet skåp. Isolering av monocyter från hjärnan och testiklarna beskrivs som tidigare nämnts17.
  2. Immobilisera (euthanized, tidigare smittade) manliga musen i liggande position på en skärbräda.
  3. Säkra hårbotten med en rak 1 x 2 tänder-pincett, och använda Iris sax göra ett mittlinjen snitt i hårbotten att exponera skallen.
  4. Klämma de två sidorna av banor med sharp pincett och fixa hjärnan. Placera ett tips av vass Iris sax i den foramen magnum och skär sidled i skallen. Upprepa detta steg för andra sidan.
  5. Använd skarpa Iris sax för att försiktigt skära från samma hålighet, upp mittlinjen, mot näsan. Försök att hålla i slutet av saxen så ytligt som möjligt för att undvika skada hjärnan.
  6. Lyft hjärnan med pincett och använda vass Iris sax att noggrant dissekera kranialnerven fibrerna. Ta bort hjärnan med pincett och placera den i en 15 mL tub innehållande 5 mL iskallt RPMI/10% FBS medium.
  7. Ta magen huden med pincett och använda vass Iris sax göra ett längsgående snitt genom integument och bukväggen och exponera den nedersta delen av buken. Tryck testiklarna upp till snittet. Försiktigt dra fett lager med pincett och exponera en klotformig testiklarna på båda sidor.
  8. Använd skarpa Iris sax för att noggrant dissekera de fettlager och bitestiklarna. Placera testiklarna i en 15 mL tub innehållande 5 mL iskallt RPMI/10% FBS medium med pincett.
  9. Generera en encellig suspension från hjärnan eller testiklar, placera orgel på en steril cell SIL med en 100 µm mesh ovanpå en 50 mL tub och tillsätt 2 mL av iskall RPMI/10% FBS medium. Hjälp kolven i en 5 mL spruta, mosa orgeln och tillsätt medium tills orgeln har varit fullt marken genom maskan.
  10. Överföra cellsuspensionen till en 15 mL rör och centrifugera det 600 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Ta bort supernatanten.
  11. Återsuspendera cellerna med 5 mL 30% täthet lutning medium och sedan lägger du till dem mycket långsamt 2 mL 70% täthet lutning medium i en 15 mL tub.
  12. Stäng av bromsen och centrifugera rören vid 4 ° C vid 800 x g i 30 min. Erhåll lymfocyterna från mellanskiktet.
  13. Överföra interphasen till en färsk 15-mL tub, tillsätt 10 mL av kalla RPMI/10% FBS medium och centrifugera röret vid 300 x g under 10 minuter vid 4 ° C. Ta bort supernatanten.
  14. Omsuspendera cellerna med 10 mL iskallt RPMI/FBS medium och centrifugera dem 600 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Ta bort supernatanten.
  15. Omsuspendera cellerna med 10 mL komplett RPMI medium och räkna antalet celler som i steg 3,9.

5. tetramer förberedelse

  1. Konstruera plasmider uttrycker de extracellulära domänerna av H-2Db med en biotinylerade webbplats tagg på C-terminus av domänen α3 och β2m med pET28a vector med en NdeI och XohI begränsning plats18.
  2. Express och förbereda för H-2Db och β2m som tidigare beskrivits20organ på inkludering.
  3. Renature och rena den MHC/peptid komplex H-2Db-E294-302.
    1. Förbereda 200 mL av en refolding lösning [100 mM Tris-HCl (pH 8,0), 400 mM L-arginin, 2 mM EDTA-Na, 5 GSG, och 0,5 mM GSSG]. Lägg till proteashämmare: 2 mL fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF, lager 100 mM), 100 µL av pepstatin (lager 2 mg/mL) och 100 µL av leupeptin (lager 2 mg/mL). Cool bufferten vid 4 ° C i 30 min.
    2. Lägga till H-2Dbβ2m och peptid till refolding lösning.
      1. Injicera 500 µL β2m upplöst i en guanidin lösning (30 mg/mL lager) med hjälp av en spruta. För detta, använda en 23-G nål med en 5 mL spruta och injicera den β2m i refolding lösningen droppe för droppe. Förvara lösningen ständigt och långsamt under omrörning på 150 rpm vid 4 ° C.
      2. Efter β2m har upplösts i den refolding lösningen, lösa 2 mg E294-302 peptid i 200 µL av DMSO och snabbt injicera det refolding lösningen med pipett. Långsamt rör lösningen på 150 rpm vid 4 ° C i 15 min.
      3. Injicera 1,5 mL H-2Db upplöst i en guanidin-lösning. Håll den rör bar roterande på 150 rpm för att vika av H-2Db vid 4 ° C för 8 – 10 h.
        Obs: Lösningen placerades i en sluten låda i ett kallt rum.
    3. Koncentrat av refolded protein i en trycksatt kammare med 10 kDa membran. Utbyta bufferten [20 mM Tris-HCl (pH8.0), 50 mM NaCl] till kammaren och koncentrera den till en slutlig volym av 30 – 50 mL.
    4. Överför refolding lösningen till ett centrifugrör och spinna vid 2500 x g i 15 minuter vid 4 ° C.
    5. Försiktigt överför supernatanten till ett 10 kDa centrifugal filter och ytterligare koncentrera den till en slutlig volym av 500 µL vid 2500 x g i 30 min.
    6. Överför supernatanten till en frisk slang och spinna vid 12 000 x g i 15 min. rena proteinet med S200 10/300 GL gel filtrering kromatografi.
    7. Samla MHC komplex toppen och koncentrera den till en slutlig volym av 350 µL.
  4. Generera en 500-µL reaktionsvolym för biotinylation, lägga till regenterna i följande ordning: 100 µL av lösning A [0.5M bicine (pH 8,3)], 100 µL av lösning B (100 mM ATP, 100 mM MgOAc, 200 µΜ biotin), 100 µL av extra d-biotin (500 µΜ biotin) , 20 µL av BirA enzym (60 µg), 0,5 µL av pepstatin (2 mg/mL) och 0,5 µL av leupeptin (2 mg/mL). Inkubera reaktionsröret över natten vid 4 ° C.
    FÖRSIKTIGHET: Lägg inte någon EDTA biotinylating reaktionen.
  5. Rena de MHC använder en S200 10/300 GL gel filtrering kolumn att ta bort eventuella extra biotin.
  6. Bestämma biotinylating effektivitet med en streptividin-shift assay18.
    1. Förbered tre prover, A, B och C, på is i 30 min. Sedan analysera resultaten med 10% SDS-PAGE. Prov A består av 8 µL biotinylerade MHC molekyler och 2 µL av exchange buffert, prov B av 8 µL av biotinylerade MHC molekyler och 2 µL av streptividin (20 mg/mL), och prov C på 2 µL av streptividin (20 mg/mL) och 8 µL exchange buffert.
      FÖRSIKTIGHET: Koka inte provet.
  7. Bildar multimers av biotinylerade MHC molekyler.
    1. Producera tetramer genom att blanda de biotinylerade E294-302 peptid-H2Db komplex med fykoerytrin-märkt streptividin i mole förhållandet 1:5 för att säkerställa en komplett bindning av alla biotinylerade MHC molekyler.
    2. Beräkna mängden streptividin-conjugate behövs för tetramerization.
      1. Bestämma mol av MHC/peptid komplex redovisning av protein koncentrationen och molar vikt (exempel: 1,8 mg totalprotein = 40 nmol).
      2. Beräkna mol av streptividin-konjugatet behövs genom divideras 5 mol av MHC/peptiden (exempel: 40/5 = 8 nmol för streptividin-conjugate).
      3. Beräkna mängden streptividin behövs (i µg) beroende på streptividin-konjugat (exempel: streptividin-PE [300.000 g/M] → 8 nmol behövs = 2400 g).
    3. Dela streptividin-fykoerytrin i 10 prover. Lägga till varje prov i en tub innehållande biotinylerade E294-302 peptid-H2Db komplex, med ett intervall på 20 min. Efter lastning det sista provet, inkubera reaktionsröret vid 4 ° C över natten i mörkret.
  8. Tillämpa de multimerized reagenserna i ett 100 kDa spin rör och koncentrera den genom centrifugering vid 2000 x g vid 4 ° C till en volym av < 100 µL.
  9. Späd provet i rör till 4 mL använder PBS (pH 8,0) och koncentrera den igen till < 100 µL.
  10. Upprepa buffert utbyte steg i PBS (pH 8,0) 4 x.
  11. Fylla upp den totala volymen igen till 500 µL använder PBS (pH 8,0). Koncentrera sig provet till en uppskattade koncentrationen 2 – 2,5 mg/ml vid 2000 x g vid 4 ° C. Förvara provet mörkt vid 4 ° C.

6. flödescytometri

  1. Inkubera i cellsuspensioner (från steg 3,9 och/eller steg 4.15) vid 4 ° C med 0.1 µL mot murint CD16/CD32 Fc-Receptor-blockerande reagens per 20 µL (utspädning faktor 1: 200) i 10 minuter för att förhindra eventuella ospecifik bindning.
  2. Centrifugera tetramer röret vid 20 000 x g under minst 15 minuter vid 4 ° C.
  3. Tillsätt 20 µL av cellsuspensionen i en 96-väl platecontaining 1 x 106 celler varje brunn.
  4. Förbereda en tillräcklig volym E294-302 tetramer mixen att färga alla experimentella rör. Förbereda ett överskott på 15% av den totala volymen av denna blandning till konto för pipettering fel. Späd de E294-302 tetramers (2 mg/mL, 1 µL per prov) i FACS buffert (PBS, 0,5% FBS) så att 20 µL av E294-302 tetramer mixen läggs till varje test.
  5. Tillsätt 20 µL av E294-302 tetramer mixen i plattan med 96 brunnar. I slutet av detta steg bör den avslutande volymen i varje brunn 40 µL.Incubate plattan i mörker vid rumstemperatur i 30 min.
  6. Lägg till primära antikroppar (FITC-konjugerad eller APC-konjugerad anti-CD3 (0,2 mg/mL), PerCP-konjugerad anti-CD8 (0,2 mg/mL)) med 1 µL per prov att cellsuspensionen och, sedan, inkubera det vid 4 ° C i 30 min i mörker.
  7. Tvätta cellerna 2 x med 2 mL FACS buffert och centrifugera dem på 600 x g för 5 min. noggrant Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna med 200 µL FACS buffert.
  8. Lagra proverna tillfälligt vid 4 ° C i mörker tills flödet flödescytometrisk analys.
  9. Använd följande Usenets strategi för flöde flödescytometrisk analys.
    1. Skapa en grind på diagonalt klustrade undertröjor genom att rita ett framåt scatter (FSC) kontra side scatter (SSC) område.
    2. Sedan, gate på CD3+ celler av side scatter (SSC) kontra CD3; Nästa, gate på CD3+ CD8+ celler; Slutligen beskriver CD8+ tetramer+ celler19.

7. histopatologi, immunofluorescens och immunohistokemi Assay

  1. Histopatologi assay
    1. Samla ZIKV-infekterade Ifnar1- / - möss 7 d efter inympningen hjärnan och testiklarna vävnader och fixa dem i 4% neutral buffrad formaldehyd.
      FÖRSIKTIGHET: PARAFORMALDEHYD är giftigt; Använd lämplig personlig skyddsutrustning.
    2. Bädda in vävnaden i paraffin.
    3. Avsnitt vävnaden på 5 mm med en vibratome.
    4. Fläcken vävnaden med hematoxylin och eosin (H & E).
  2. Immunohistokemi assay
    1. Deparaffinize, rehydrera och antigen-Hämta vävnaden sektioner, baserat på förfaranden beskrivs tidigare21.
    2. Behandla avsnitten vävnad med 3% H2O2 i PBS (pH 7,6) i 10 min och blockera dem med 1% bovint serumalbumin (BSA) i 10 min.
    3. Inkubera i vävnaden avsnitt med råtta antimus CD3 antikropp (utspädning: 1/1 000) för 8 h i rumstemperatur och, sedan, inkubera dem vid 4 ° C över natten.
    4. Skölj vävnader med PBS och, sedan, inkubera dem med 3 droppar av biotinylerade sekundär antikropp (utspädning: 1/1 000) för 2 h i rumstemperatur, följt av 3 droppar avidinen-biotin-peroxidas (utspädning: 1/200) i rumstemperatur i 30 min.
    5. Binda, med 3 droppar av 30, 30-Diaminobenzidin tetrahydrochloride (utspädning: 1/1 000), som tidigare beskrivits22.
    6. Counterstain avsnitten vävnad med Mayers hematoxylin.
  3. Immunofluorescens assay
    1. Lufttorka avsnitten frysta testiklarna (6 mm) under 10 minuter vid rumstemperatur.
    2. Fixera dem med iskall aceton i 10 min.
    3. Tvätta avsnitten med PBS 3 x och blockera dem med en blockerande buffert (1% BSA, 0,3% Triton, 1 x PBS) vid 37 ° C i 30 min.
    4. Inkubera i vävnaden avsnitt med primär antikropp (Z6) (20 µg/mL) vid 4 ° C över natten.
    5. Skölj vävnader med PBS och applicera den sekundära antikroppen (utspädningsfaktorn: 1/200) för 1 h vid 37 ° C.
    6. Tvätta vävnadssnitt med PBS och counterstain dem för kärnor med 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) (utspädningsfaktorn: 1/1 000), följa tillverkarens instruktioner.

Representative Results

Efter dessa metoder, har vi utvecklat en murin modell för ZIKV infektioner. Ifnar1- / - möss på 6 – 8 veckors ålder var infekterade med 1 x 104 fokus-bilda enheter (FFU) av ZIKV av retroorbital injektion. Patologiska symtom och tecken (figur 1A), samt viktförändringar (figur 1B), observerades i Ifnar1- / - möss efter en infektion med ZIKV. Murina hjärnor visade uppenbara ödem och hyperemia (figur 1C). Under tiden, testiklarna krympte gradvis (figur 1D). Dessutom hittades patologiska förändringar och förstörelsen av vävnad i hjärnan och testiklar (figur 2A). Vi genomförde ett immunofluorescens test för att upptäcka ZIKV i hjärnan och testiklar (figur 2B). Hög virusbelastning upptäcktes i hjärnan och testiklarna genom immunfärgning (figur 2B). Immunohistokemi visade en robust infiltration av CD3+ T celler in i möss hjärnan efter infektion med ZIKV (figur 2C).

För att identifiera och utvärdera ZIKV-specifika T-cell svar, vi förberett en mus MHC-jag H-2Db-E294-302 tetramer. Den peptid E294-302 kan hjälpa den H-2Db renature ordentligt och ge en hög mängd den lösliga MHC-jag (figur 3A). I skift analysen, kunde en hög effektivitet i biotinylation observeras (figur 3B). Därefter tre streptividin fluorescens (APC, PE, och BV421) - märkta pMHC - jag tetramers producerades för att upptäcka ZIKV-specifika T-celler (figur 3C). Den PE-märkt tetramer hade en högre effekt att upptäcka den specifika CD8+ T cell jämfört de APC - och BV421-märkt tetramers, men skillnaden inte var statistiskt signifikant.

Använder den E294-302 tetramer, upptäckt vi ZIKV-specifika T-lymfocyter i mjälten hos infekterade möss av flödescytometri på 7 d efter inokulering av ZIKV (3.49 ± 0,45%). Också, liknar den metod som beskrivs i avsnitt 3 i detta protokoll, med 4 veckor efter immunisering av AdC7-M/E vaccin, ZIKV-specifika T-lymfocyter upptäcktes i mjälten (6.89 ± 1,36%) (Figur 4).

Dessutom upptäckte vi de lymfocyter som infiltreras i immunoprivileged organ, såsom hjärnan och testiklarna, efter den ZIKV infektionen. Grindarna var inställd att välja för CD3+CD8+ T celler i totala lymfocyter i hjärnan och testiklarna. En hög andel av de E294-302 tetramer-specifika T-cellerna kunde detekteras i hjärnan (42,2% i CD3+CD8+ T celler) och den testikel (26,4% i CD3+CD8+ T celler) lymfocyter (figur 5).

Figure 1
Figur 1 : Karakterisering av ZIKV infektion i Ifnar1- / - möss. Ifnar1- / - möss på 6 – 8 veckors ålder var infekterade med 104 fokus-bilda enheter (FFU) av ZIKV av retroorbital injektion, och möss som injicerats med PBS användes som oinfekterade kontroller. (A) morfologin och (B) viktförändringar av infekterade Ifnar1- / - möss övervakades. De röda pilarna visar Ifnar1- / - möss presenteras med myeloparalysis och motor parapares efter infektionen. (C) hjärnor på 7 d efter inympningen och (D) testiklarna vid 0, 7, 14 och 30 dagar efter inympningen skördades. Representativa bilder av hjärnan och testiklarna från mössen visas med en linjal att ange storlekarna. Felstaplar representera medelvärde ± SEM n = 10 möss per grupp per experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Upptäckten av ZIKV och lymfocyter i hjärnan och testiklarna av ZIKV-infekterade Ifnar1- / - möss. (A) denna panel visar histopatologiska förändringar i hjärnan och testiklarna från ZIKV-infekterade möss jämfört med negativa kontroller på 7 d efter inympningen. Skalstapeln = 25 µm (till vänster) och 50 µm (höger panel). (B) ett immunofluorescens-analysen utfördes med anti-ZIKV Z6 antikroppen (grön). Alla vävnadsprover samlades in från ZIKV-infekterade möss på 7 d efter inympningen. Atomkärnor var fläckade av DAPI (blå). Skalstapeln = 50 µm. (C) immunohistokemi visar en robust infiltration av CD3+ T celler in i hjärnan och testiklarna. Skalstapeln = 25 µm (till vänster) och 50 µm (höger panel). Lila anger hematoxylin, brun representerar de CD3 antikroppen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Beredning av ZIKV-specifika pMHC-jag tetramers. (A), bindningen av E294-302 till H-2Db är klarlagd av ett in vitro- vika. Blått anger H-2Db-E294-302 proteinet. Orange representerar den negativa kontrollen utan peptid. (B) denna panel visar H-2Db-E294-302 Skift analysen. (C) mock representerar en PBS-kontroll. Tre streptividin fluorescens (APC, PE, och BV421) - märkta pMHC - jag tetramers användes för att upptäcka ZIKV-specifika T-celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Flow flödescytometrisk analys av virus-specifika CD8 + T-celler i mjälten hos ZIKV-infekterade och vaccin-immuniserade mössen. Ifnar1- / - möss vid 6-8 veckors ålder var antingen infekterade med 104 fokus-bilda enheter (FFU) av ZIKV eller fått en engångsdos på 4 x 1010 viruspartiklar AdC7-M/E eller PBS som en negativ kontroll. Efter 7 dagar efter infektion eller 4 veckor efter vaccination, var musen splenocytes skördas och analyseras med flödescytometri. Uppgifterna presenteras som medelvärde ± SD. statistisk analys utfördes med envägs ANOVA (inte betydande: P > 0,05; *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ***P < 0,0001). Klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Figure 5
Figur 5 : Gating strategi och representativa resultat av virus-specifika CD8+ T celler i hjärnan och testiklarna hos ZIKV-infekterade möss. Representativa tomter visas för infiltrerade lymfocyter i (A) hjärnan och (B), testiklarna. En följd av gates är inställd att välja lymfoida-scatter+ och CD3+ händelser. Av dessa, CD8+ händelser är gated för analys av epitop-specifika T-celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Discussion

Immunogent T-cells epitop spelar en betydande roll i cellulär immunitet mot patogener23. Påvisande av ZIKV-specifika T-celler i immunoprivileged organ är alltså en kritisk metod att förstå T-cell svar mot den naturliga ZIKV-infektionen. Under tiden är T-cell svar upptäckt ett utmärkt verktyg för att undersöka effekten av den virala vaccin. Här visar vi ett omfattande protokoll att visualisera de experiment, som inkluderar isolering av lymfocyter från mjälte, hjärna och testiklarna hos ZIKV-infekterade möss, utarbetandet av den immundominant epitop E294-302 tetramer, och den erkännande av ZIKV-specifika CD8+ T celler i immunoprivileged organ ZIKV-infekterade möss.

En tidigare studie visade att en levande ZIKV eller dess RNA kan påvisas i sperma från manliga patienter, vilket indikerar att ZIKV kan kringgå den blod-testis-barriären och replikera sig själv i det reproduktiva system24. Tidigare visade vi också att ZIKV kan skada testiklarna och leda till manlig infertilitet i möss25. ZIKV infektion kan leda till viremi hos rhesusapor och den virus-RNA kan påvisas i det centrala nervsystemet (CNS), liksom i de viscerala organ. Immunohistokemi avslöjade att ZIKV-specifika antigener presenterades i CNS och flera perifera organ26. Också, i murina modeller, ZIKV infektion kan inducera en robust antivirala CD8+ T-cellssvar i mjälte och CNS26.

Denna studie jämfört med tidigare arbete, och upprättar systematiska metoder för att upptäcka ZIKV-specifika CD8+ T-cell svar i hjärnan och testiklarna, som är immunoprivileged platser. Det är viktigt att utvärdera funktionaliteten i virus-specifika T-celler i immunoprivileged organ ZIKV-infekterade möss. Användningen av tetramers att upptäcka ZIKV-specifika CD8+ T-cell svar i immunoprivileged organ skulle kraftigt öka vår förståelse av ZIKV infektioner och deras värd immunsvar. Använda E294-302 tetramer, kan virus-specifika T-celler i hjärnan och testiklarna vara isolerat av flödescytometri, för att undersöka de cellulära mekanismerna för skydd och immunpatogenes under en ZIKV infektion. Samtidigt är det bra för forskare att undersöka ytterligare funktioner i CD8+ T celler att styra ZIKV, eller för att förbättra immunpatogenes i dessa organ under ZIKV infektion.

Att analysera de antigen-specifika murina CD8+ T-cell svar i immunoprivileged organ, vi förberedda H-2Db-E294-302 tetramer och upptäckt CD8+ T celler av flödescytometri. Tetramers är ett kraftfullt verktyg att upptäcka antigen-specifika T-celler. Här, genererades tre typer av fluorokrom-konjugerad streptividin (APC, PE, och BV421). Även om det finns inga statistiskt signifikanta skillnader i APC-, BV421- och PE-märkt tetramers för påvisande av antigen-specifika T-celler, PE-märkt pMHC-jag tetramers gav bästa resultat. Därför användes den PE-märkt tetramer under hela studien. Intressant, upptäckt baserat på den PE-märkt H-2Db-E294-302 tetramer, vi höga nyckeltal av antigen-specifika T-celler i både hjärnan och testiklarna, som indikerar de virus-specifika T-cellerna från blodet att migration förmåga immunoprivileged organ.

Det finns dock vissa begränsningar i protokollet. Den H-2Db-E294-302 tetramer är inte användbart för humant T-cell upptäckt, eftersom tetramer upptäckt är beroende av MHC begränsning. Screening av immundominant HLA-begränsad peptider krävs fortfarande. Förutom, retro-orbital infektion är effektiv för en ZIKV infektion men kan inte vara en bekväm manövrering för vissa utredare. Således, andra vägar på infektion, inklusive peritonealdialys, subkutan eller intravenös, rekommenderas också.

I protokollet som beskrivs här, är ett avgörande steg isoleringen av monocyter från hjärnan och testiklarna. Det är viktigt att förvärva hög kvalitet lymfocyter; Det är därför viktigt att uppmärksamma, exempelvis centrifugal hastigheten, styrkan av slipning vävnad och dissektion av hjärnan och testiklarna vävnaden. Dessutom för tetramer förberedelse är proteashämmare (PMSF, pepstatin, leupeptin) användbara när du skyddar ett protein från att degraderas. Därför är det vettigt att lägga till en proteashämmare refolding bufferten och byta bufferten under processen av tetramer preparatet.

Avslutningsvis presenterar vi metoder för att påvisa antigen-specifika T-cell svar i immunoprivileged organ Ifnar1- / - musmodell för en ZIKV infektion. Denna plattform kan i stor utsträckning för att undersöka de immunologiska mekanismerna framväxande och åter framväxande virus som kan kringgå hindren mellan blodet och de immunoprivileged organen. Dessutom kan denna studie bana väg för den framtida utvecklingen av kandidat vaccin och immunterapier.

Disclosures

Författarna har inget att deklarera.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Gary Wong för den engelska revision. Detta arbete var stöds av nationella nyckel forskning och utveckling Program i Kina (grant 2017YFC1200202), den större särskilda projekt för infektiös sjukdom forskning i Kina (grant 2016ZX10004222-003). George F. Gao är en ledande projektledare i nationella naturvetenskap Foundation av Kina innovativa forskargruppen (grant 81621091).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Z6 our lab Ma W, Li S, Ma S, et al. Zika virus causes testis damage and leads to male infertility in mice. Cell, 2016, 167: 1511-1524 e1510
CD3 Santa Cruz sc-1127; RRID: AB_631128
Fluorescein-Conjuated Affinipure Goat anti-human IgG(H+L) ZSGB-BIO ZF-0308
Rabbit Anti-Goat IgG, FITC Conjugated CWBIO CW0115
FITC anti-mouse CD3 Biolegend 17A2
APC anti-mouse CD3 Biolegend 100236
PerCP anti-mouse CD8a Biolegend 100732
Percoll GE Healthcare P8370
PMSF Ameresco 0754-5G Toxic and corrosive reagent.
Handle with care
Streptadivin BD S4762-FZ Gives a clear solution at 10mg/ml in PBS and  stored at -20 °C
Pepstatin Sigma P4265-5MG 5 mg in 2.5 mL DMSO, aliquots stored at -20 ºC
Leupeptin Sigma L8511 5 mg in 2.5 mL dH2O, aliquots stored at - 20 ºC
Peptides Scilight-peptide Must be resuspended in DMSO and stored at -20 °C
RPMI 1640 Hyclone SH30809.01 Must be stored at 4 °C
DMSO MP 219605590 Store at room temperature.
APC-Streptadivin BD 554067 Must be stored and maintained at
4 °C. Do not freeze.
FITC-Streptadivin BD 554060 Must be stored and maintained at
4 °C. Do not freeze.
PE-Streptadivin BD 554061 Must be stored and maintained at
4 °C. Do not freeze.
BV421-Streptadivin BD 563259 Must be stored and maintained at
4 °C. Do not freeze.
PageRuler Unstained Protein Ladder Thermo Fisher Scientific  26614 Must be stored at 4 °C
Cell Strainers BF BF10-5040 Store at room temperature.
Amicon Ultra 100 kDa Millipore UFC510024 Store at room temperature.
Ultracentrifuge Thermo Fisher Scientific 
FACS Cantol Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used.
Superdex 200 Increase 10/300 GL  GE healthcare 28990944
AKTA PURE GE healthcare
red blood cell lysis buffer Solarbio R1010 Store at 4 °C.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dick, G. W., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), 509-520 (1952).
  2. Hazin, A. N., et al. Computed Tomographic Findings in Microcephaly Associated with Zika Virus. The New England Journal of Medicine. 374 (22), 2193-2195 (2016).
  3. Zhang, Y., et al. Highly diversified Zika viruses imported to China, 2016. Protein & Cell. 7 (6), 461-464 (2016).
  4. Cauchemez, S., et al. Association between Zika virus and microcephaly in French Polynesia, 2013-15: a retrospective study. The Lancet. 387 (10033), 2125-2132 (2016).
  5. Turtle, L., et al. Human T cell responses to Japanese encephalitis virus in health and disease. The Journal of Experimental Medicine. 213 (7), 1331-1352 (2016).
  6. Dudley, D. M., et al. A rhesus macaque model of Asian-lineage Zika virus infection. Nature Communications. 7, 12204 (2016).
  7. Osuna, C. E., et al. Zika viral dynamics and shedding in rhesus and cynomolgus macaques. Nature Medicine. 22 (12), 1448-1455 (2016).
  8. Stettler, K., et al. cross-reactivity, and function of antibodies elicited by Zika virus infection. Science. 353 (6301), 823-826 (2016).
  9. Zhao, M., Zhang, H., Liu, K., Gao, G. F., Liu, W. J. Human T-cell immunity against the emerging and re-emerging viruses. Science China Life Sciences. 60 (12), 1307-1316 (2017).
  10. Huang, H., et al. CD8+ T Cell Immune Response in Immunocompetent Mice during Zika Virus Infection. Journal of Virology. 91 (22), 00900-00917 (2017).
  11. Elong Ngono, A., et al. Mapping and Role of the CD8+ T Cell Response During Primary Zika Virus Infection in Mice. Cell Host & Microbe. 21 (1), 35-46 (2017).
  12. Marques, E. T. A., Burke, D. S. Tradition and innovation in development of a Zika vaccine. The Lancet. 391 (10120), 516-517 (2017).
  13. Xu, K., et al. Recombinant Chimpanzee Adenovirus Vaccine AdC7-M/E Protects against Zika Virus Infection and Testis Damage. Journal of Virology. , 01722-01817 (2018).
  14. Jama, B. P., Morris, G. P. Generation of human alloantigen-specific T cells from peripheral blood. Journal of Visualized Experiments. (93), e52257 (2014).
  15. Legoux, F. P., Moon, J. J. Peptide:MHC tetramer-based enrichment of epitope-specific T cells. Journal of Visualized Experiments. (68), e4420 (2012).
  16. Govindarajan, S., Elewaut, D., Drennan, M. An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen. Journal of Visualized Experiments. (105), e53256 (2015).
  17. Posel, C., Moller, K., Boltze, J., Wagner, D. C., Weise, G. Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain. Journal of Visualized Experiments. (108), e53658 (2016).
  18. Altman, J. ohnD., et al. Phenotypic Analysis of Antigen-Specific T Lymphocytes. Science. 274, 94-96 (1996).
  19. Li, H., Zhou, M., Han, J., Zhu, X., Dong, T., Gao, G. F., Tien, P. Generation of murine CTL by a hepatitis B virus-specific peptide and evaluation of the adjuvant effect of heat shock protein glycoprotein 96 and its terminal fragments. J Immunol. 174 (1), 195-204 (2005).
  20. Valkenburg, S. A., et al. Preemptive priming readily overcomes structure-based mechanisms of virus escape. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5570-5575 (2013).
  21. Shang, T., et al. Toll-like receptor-initiated testicular innate immune responses in mouse Leydig cells. Endocrinology. 152 (7), 2827-2836 (2011).
  22. Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons. Journal of Visualized Experiments. (99), e52293 (2015).
  23. Zhou, M., et al. Screening and identification of severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus-specific CTL epitopes. The Journal of Immunology. 177 (4), 2138-2145 (2006).
  24. Barzon, L., Lavezzo, E., Palu, G. Zika virus infection in semen: effect on human reproduction. The Lancet Infectious Diseases. 17 (11), 1107-1109 (2017).
  25. Ma, W., et al. Zika Virus Causes Testis Damage and Leads to Male Infertility in Mice. Cell. 167 (6), 1511-1524 (2016).
  26. Li, X. F., et al. Characterization of a 2016 Clinical Isolate of Zika Virus in Non-human Primates. EBioMedicine. 12, 170-177 (2016).

Tags

Immunologi och infektion fråga 140 zikavirus antigen-specifika T-cell vaccination immunoprivileged organ tetramer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Y., Zhang, H., Ma, W., Liu,… More

Zhang, Y., Zhang, H., Ma, W., Liu, K., Zhao, M., Zhao, Y., Lu, X., Zhang, F., Li, X., Gao, G. F., Liu, W. J. Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice. J. Vis. Exp. (140), e58110, doi:10.3791/58110 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter