Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Evaluering av Zika Virus-spesifikke T-celle svar i Immunoprivileged organer av infiserte Ifnar1- / - mus

Published: October 17, 2018 doi: 10.3791/58110
Automatic Translation
*1,2, *2, *3, 1,2, 4, 2, 5, 6, 3, 1,2,4,6, 1,2
1School of Laboratory Medicine and Life Sciences, Wenzhou Medical University, 2NHC Key Laboratory of Medical Virology and Viral Diseases, National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, 3State Key Laboratory of Agrobiotechnology, College of Biological Sciences, China Agricultural University, 4Research Network of Immunity and Health (RNIH), Beijing Institutes of Life Science, Chinese Academy of Sciences, 5Laboratory Animal Center, Chinese Center for Disease Control and Prevention, 6CAS Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences
* These authors contributed equally

Summary

En protokoll for å evaluere antigen-spesifikke T-celle svar i immunoprivileged organer i Ifnar1- / - murine modellen for Zika virusinfeksjonen (ZIKV) er beskrevet. Denne metoden er avgjørende for å undersøke mobilnettet mekanismer for beskyttelse og immunopathogenesis av ZIKV vaksiner og er også verdifull for deres effekt evaluering.

Abstract

Zika viruset (ZIKV) kan indusere betennelse i immunoprivileged organer (f.ekshjernen og testikkel), fører til Guillain-Barrés syndrom og skade testiklene. Under en infeksjon med ZIKV, har immunceller vist å infiltrere inn i vev. De cellulære mekanismene som definerer den beskyttelse og/eller immunopathogenesis av disse immunceller under en ZIKV infeksjon er imidlertid fortsatt hovedsakelig ubekjent. Her beskriver vi metoder for å evaluere funksjonen virus-spesifikke T-celle i disse immunoprivileged organer ZIKV-infiserte mus. Disse metodene omfatter en) en ZIKV infeksjon og vaksine inoculation i Ifnar1- / - mus; b) histopatologi, immunofluorescence og immunohistochemistry analyser å oppdage virusinfeksjon og betennelse i hjernen, testiklene og milt; c) utarbeidelse av en tetramer av ZIKV-avledet T-celle epitopes; d) oppdagelsen av ZIKV-spesifikke T celler i monocytter isolert fra hjernen, testiklene og milt. Bruke disse metodene, er det mulig å oppdage antigen-spesifikke T celler som har infiltrert i immunoprivileged organer og evaluere funksjonene til disse T-celler under infeksjon: potensielle immun beskyttelse via virus klarering og / eller immunopathogenesis til å forverre betennelse. Disse funnene kan også bidra til å avklare bidrag av T-celler av immunisering mot ZIKV.

Introduction

ZIKV er en mygg-borne flavivirus som først ble isolert i 1947 i Uganda fra en febril rhesus macaque. ZIKV har nylig blitt en public health emergency, på grunn av sin raske spredningen i Amerika og uventet koblingen microcephaly og Guillain-Barrés syndrom1,2,3. Fra epidemiologiske data, har ZIKV vært mistenkt å være årsaken til Guillain-Barrés syndrom i rundt 1 per 4000 infisert voksne4. Videre har en sammenheng mellom ZIKV og testiklene infeksjon/skaden i musemodell vist, antyder at ZIKV infeksjon, under visse omstendigheter, kan omgå blod-testikkel barriere og føre til mannlig infertilitet5 . Disse funnene markere betydningen av helt forstå induksjon av beskyttende eller patologisk immunreaksjoner under en ZIKV infeksjon.

Mye fortsatt for å lære om cellular immun svar i ZIKV. CD4+ og CD8+ T-celle svar til kapsid, konvolutt og nonstructural protein 1 (NS1) har blitt observert i ZIKV-infiserte aper og mennesker6,7,8. I mus, flere studier har indikert at CD8+ T celler spiller en beskyttende rolle i å kontrollere den ZIKV replikering9,10,11. Viktigere, Jurado et al. viste at en ZIKV infeksjon resulterer i nedbrytning av blod - hjerne barrieren og perivascular infiltrasjon av CD8+ effektor T celler i prøvene av Ifnar1- / - mus. Videre, de viste at CD8+ T celler egge ZIKV-assosiert lammelse og synes å spille en rolle i neonatal hjernen immunopathology. I en tidligere studie, vi forberedt ZIKV-E294-302 tetramer og viste at ZIKV-spesifikke CD8+ T celler finnes i hjernen og spinal snorer av ZIKV-infiserte Ifnar1- / - mus, som kan ha viktige implikasjoner for design og utvikling av ZIKV vaksiner10.

Svar på det presserende behovet for vaksinering å forebygge ZIKV infeksjon, er flere vaksiner i preklinisk stadier av utvikling, inkludert RNA vaksiner rekombinant vektorbasert vaksiner og renset protein delenhet vaksiner. Plasmider DNA vaksinen er i fase 1 kliniske studier12. Evalueringen av sikkerhet og effekt av ZIKV vaksiner er derfor viktig. En fordel av vaksiner er deres evne til å lokke fram bestemte T-celle svar, som kan være viktig for beskyttelse mot ZIKV. Ved å bruke ZIKV-avledet T-celle epitope-relaterte tetramers, T-celle immunoreactivity av en adenovirus-vektorbaserte ZIKV vaksine kan oppdages i vaksineres mus, og både M og E glykoproteiner ble vist å indusere robust antigen-spesifikke CD8+ T-celle immunoreactivity13.

Under en virusinfeksjon er anerkjennelse av peptid antigener presentert av store histocompatibility kompleks (MHC) molekyler til T-celle reseptor (TCR) en viktig T-celle-mediert mekanisme for å beskytte de vert14. Basert på denne teorien, er tetramer teknologi et unikt verktøy å belyse rollene som antigen-spesifikke T celler spille i å regulere immunreaksjoner15. Denne protokollen beskriver etableringen av Ifnar1- / - musemodell for ZIKV infeksjoner, og oppdaging av reaktive T celler i milten, hjernen og testiklene av mus ved hjelp tetramer teknologi. I tillegg har vi brukt ZIKV-E294-302 tetramer å finne og evaluere T-celle immunoreactivity av en ZIKV vaksine (AdC7-M/E) i vaksineres mus. Denne studien gir veiledning for å undersøke T-celle svar i immunoprivileged organer og gir en referanse for potensielle programmene i morkaken eller fosterets hjerne.

Protocol

Dyreforsøk ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen av National Institute for Viral Disease Control og Prevention, Kina CDC. Alle eksperimentene ble utført etter institusjonelle Animal Care og bruk komiteen godkjent dyr protokoller.

1. virusinfeksjon

  1. Holde voksen (6 til 8 uke-gamle) Ifnar1- / - (50% menn og 50% kvinnelige) mus i standard patogen-fri (SPF) betingelser, og la dem jevnlig tilgang til mat og vann.
  2. Infisere Ifnar1- / - mus med den ZIKV via en retro-orbital vaksinasjon av 100 µL av ZIKV i en fosfat-bufret saltvann (PBS) buffer som inneholder 1 x 104 fokus-forming enheter (FFUs) av viruset. På samme måte gir kontroll mus med en lik mengde PBS.
    FORSIKTIG: Infisere musene under ABSL2 forhold og utføre disse prosedyrer med virus-infiserte mus i biosikkerhet kabinett.
  3. Overvåke vekt og klinisk underskriver (rystelser, forskjøvet mars, bilaterale flaccid hind lem) av mus daglig for 15 dager.

2. immunisering med ZIKV vaksine

  1. Bruk Ifnar1- / - (50% menn og 50% kvinnelige) mus mellom 6 og 8 ukens av alderen. Holde musene i standard SPF forhold av 18-29 ° C og en 12 h lys/mørke syklus med tilgang til mat og vann.
  2. Immunize de Ifnar1- / - mus med ZIKV vaksine: injisere 100 µL av AdC7-M/E [4 x 1010 (viruspartikler)] i PBS buffer via intramuskulær injeksjon (im ruten) bruker en 1 mL sprøyte med en 23-G nål.
  3. Tilsvarende injisere kontroll mus med en lik mengde PBS.

3. isolering av monocytter fra milten

Merk: Isolering av monocytter fra milten er beskrevet som nevnt tidligere16.

  1. Bedøve vaksineres og ZIKV-infiserte mus 7 d etter inoculation, bruker en 5% isoflurane concentrationin 100% oksygen (med en strømningshastighet på 1 L/min). Euthanize musene av cervical forvridning. Deretter umiddelbart dyppe hele musen i 75% etanol.
    Advarsel: dette trinnet videre, bør alle eksperimentelle prosedyrer utføres tas aseptisk i en biosafety kabinett.
  2. Bruke nåler, fikse lemmer av mus (euthanized, tidligere infisert/vaksineres) på skum platen med magen grossist.
  3. Kuttet huden langs abdominal midtlinjen til thorax med sterilt skalpell, klippe magemusklene med saks, utsette bukhulen og fjern leveren.
    Merk: Lang, mørk-rød orgelet til venstre for magen er milten.
  4. Fjerne milten, skyll den 3 x i PBS fjerne alle blod, og plasser den i 1,5 mL av iskalde Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI). Holde milten på is.
  5. Generere en enkeltcelle suspensjon fra milten, plassere organ(s) på en steril 40 µm-mesh celle sil over en 50 mL tube og legge til 2 mL av iskalde RPMI middels inneholder 10% fosterets bovin serum (FBS). Bruker stempelet til en 5 mL sprøyte, mekanisk bland til organ(s) og legge medium til orgelet har blitt fullstendig bakken gjennom nettet.
  6. Overføre celle suspensjon slik 15 mL og sentrifuge det 600 x g i 5 min på 4 ° C. Fjerne nedbryting.
  7. Resuspend cellene med 5 mL av en røde blodlegemer (RBC) lyseringsbuffer (NH4Cl, Na2EDTA og KHCO3; se Tabellen for materiale) og Inkuber lysis reaksjonen ved romtemperatur for 5-6 minutter.
  8. Stoppe RBC lysis med 10 mL av iskalde RPMI/FBS medium og sentrifuge røret på 600 x g i 5 min på 4 ° C. Fjerne nedbryting.
  9. Resuspend cellene med 10 mL av komplett RPMI medium (RPMI med 10% vol/vol FBS og 100 U/mL penicillin-streptomycin). Overføre 10 µL av cellen suspensjon til en liten tube, bland det med 10 µL av 0,4% wt/vol trypan blå og telle antall celler ved hjelp av en hemocytometer.

4. isolering av monocytter fra hjernen og testikler

  1. Bedøve ZIKV-infiserte mannlige mus 7 d etter inoculation, bruker 5% isofluranein 100% oksygen (med en strømningshastighet på 1 L/min). Euthanize musene av cervical forvridning. Deretter umiddelbart dyppe hele musen i 75% etanol.
    Advarsel: Dette trinnet og utover, alle eksperimentelle prosedyrer må utføres tas aseptisk i en biosafety kabinett. Isolasjon av monocytter fra hjernen og testiklene er beskrevet som nevnt tidligere17.
  2. Nakkens (euthanized, tidligere infisert) mannlige mus i utsatt posisjon på et skjærebrett.
  3. Sikre hodebunnen med en rett 1 x 2 tenner tang, og bruker Iris saks for å gjøre en midtlinjen snitt på hodebunnen å utsette skallen.
  4. Klemme to sider av baner med skarpe pinsett og fastsette hjernen. Plasser ett tips skarpe Iris saks i foramen magnum og skjær sidelengs i skallen. Gjenta dette trinnet for den andre siden.
  5. Bruk skarpe Iris saks til å klippe fra samme hulrom, opp midtlinjen, mot nesen. Prøv å holde slutten av saksen som overfladisk som mulig for å unngå å skade hjernen.
  6. Løft hjernen med tang og bruk skarpe Iris saks å nøye analysere cranial nerve fiber. Fjern hjernen med tang og plasserer den i en 15 mL tube som inneholder 5 mL av iskalde RPMI/10% FBS medium.
  7. Grab abdominal huden med tang og bruk skarpe Iris saks å lage en langsgående snitt gjennom integument og bukveggen og avdekke den nederste delen av magen. Skyv testiklene til innsnitt. Forsiktig trekk fett laget med pinsett og utsette en globular testikkel på begge sider.
  8. Bruk skarpe Iris saks å nøye analysere fett laget og bitestikkel. Sett prøvene i en 15 mL tube med 5 mL av iskalde RPMI/10% FBS medium tang.
  9. Vil generere en enkeltcelle suspensjon fra hjernen eller testiklene, plassere orgelet på en steril celle sil med en 100 µm mesh på en 50 mL tube og legge 2 mL av iskalde RPMI/10% FBS medium. Bruker stempelet til en 5 mL sprøyte, bland orgel og legge medium til orgelet har blitt fullstendig bakken gjennom nettet.
  10. Overføre celle suspensjon slik 15 mL og sentrifuge det 600 x g i 5 min på 4 ° C. Fjerne nedbryting.
  11. Resuspend cellene med 5 mL av 30% tetthet gradert medium, og deretter legge veldig sakte til 2 mL 70% tetthet gradert medium i en 15 mL tube.
  12. Slå av bremsen og sentrifuge rørene på 4 ° C på 800 x g for 30 min. motta lymfocytter fra midten laget.
  13. Overføre interphase til en frisk 15-mL tube legge 10 mL kaldt RPMI/10% FBS middels og sentrifuge røret på 300 x g i 10 min på 4 ° C. Fjerne nedbryting.
  14. Resuspend cellene med 10 mL av iskalde RPMI/FBS medium og sentrifuge dem på 600 x g i 5 min på 4 ° C. Fjerne nedbryting.
  15. Resuspend cellene med 10 mL av komplett RPMI medium og telle antall celler som i trinn 3.9.

5. tetramer forberedelse

  1. Konstruere plasmider uttrykke ekstracellulære domener av H-2Db med et biotinylated område koden på C-terminus α3 domenet og β2m ved hjelp pET28a vektor med en NdeI og XohI begrensning området18.
  2. Express og forberede inkludering likene av H-2Db og β2m som beskrevet tidligere20.
  3. Renature og rense den MHC/peptide komplekse H-2Db-E294-302.
    1. Forberede 200 mL av en refolding løsning [100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 400 mM L-arginin, 2 mM EDTA-Na, 5 mM GSG og 0,5 mM GSSG]. Legge til proteasehemmere: 2 mL phenylmethylsulphonyl fluor (PMSF, lager 100 mM), 100 µL av pepstatin (lager 2 mg/mL) og 100 µL av leupeptin (lager 2 mg/mL). Cool bufferen på 4 ° C i 30 min.
    2. Legge til H-2Dbβ2m og peptid refolding løsningen.
      1. Injisere 500 µL av β2m oppløst i en guanidine løsning (30 mg/mL stock) bruker en sprøyte. For dette, bruk en 23 G nål med en 5 mL sprøyte og injisere β2m i den refolding løsningen dråpe for dråpe. Holde løsningen konstant og langsomt under omrøring på 150 rpm på 4 ° C.
      2. Etter β2m har blitt oppløst i refolding løsningen, løse 2 mg E294-302 peptid i 200 µL av DMSO og raskt injisere det i refolding løsningen bruker en pipette. Sakte røre løsningen på 150 rpm på 4 ° C i 15 min.
      3. Injisere 1,5 mL av H-2Db oppløst i en guanidine løsning. Holde rør bar rotere på 150 rpm for refolding av H-2Db ved 4 ° C i 8-10 h.
        Merk: Løsningen ble plassert i en lukket boks i et kaldt rom.
    3. Konsentrere seg refolded proteinet i en trykksatt kammer med en 10 kDa membran. Utveksle bufferen [20 mM Tris-HCl (pH8.0), 50 mM NaCl] til kammeret og konsentrere det til et endelig antall 30-50 mL.
    4. Overføre refolding løsningen til en sentrifuge rør og spinn på 2500 x g i 15 min på 4 ° C.
    5. Nøye overføre nedbryting til et 10 kDa sentrifugal filter og ytterligere konsentrere det til et endelig antall 500 µL 2500 x g i 30 min.
    6. Overføre nedbryting slik frisk og spinn på 12.000 x g i 15 min. rense protein med S200 10/300 GL gel filtration kromatografi.
    7. Samle MHC komplekse toppen og konsentrere det til et endelig antall 350 µL.
  4. Vil generere et 500-µL reaksjon volum for biotinylation, legge til regents i følgende rekkefølge: 100 µL løsning A [0.5M bicine (pH 8.3)], 100 µL løsning B (100 mM ATP, 100 mM MgOAc, 200 µΜ biotin), 100 µL av ekstra d-biotin (500 µΜ biotin) , 20 µL av BirA enzym (60 µg), 0,5 µL av pepstatin (2 mg/mL) og 0,5 µL av leupeptin (2 mg/mL). Inkuber reaksjon røret overnatting på 4 ° C.
    FORSIKTIG: Ikke legger til noen EDTA biotinylating reaksjonen.
  5. Rense MHC bruker en S200 10/300 GL gel filtrering-kolonnen for å fjerne alle ekstra biotin.
  6. Bestemme biotinylating effektiviteten med en streptavidin-Skift analysen18.
    1. Forberede tre prøvene, A, B og C, på is 30 min. Deretter analysere resultatene av 10% SDS-side. Eksempel A består av 8 µL biotinylated MHC molekyler og 2 µL av exchange buffer, prøve B av 8 µL biotinylated MHC molekyler og 2 µL streptavidin (20 mg/mL), og eksempel C 2 µL av streptavidin (20 mg/mL) og 8 µL exchange buffer.
      FORSIKTIG: Ikke koke prøven.
  7. Danner multimers av biotinylated MHC molekyler.
    1. Produsere tetramer ved å blande biotinylated E294-302 peptid-H2Db kompleks med phycoerythrin-merket streptavidin i muldvarp forholdet 1:5 for å sikre en komplett binding av alle biotinylated MHC molekyler.
    2. Beregn mengden av streptavidin-konjugert trengs for tetramerization.
      1. Finne muldvarpene av MHC/peptid komplekser regnskap for protein konsentrasjon og molar vekten (eksempel: 1,8 mg totale protein = 40 nmol).
      2. Beregne mol av streptavidin-konjugert nødvendig ved mol av MHC/peptid med 5 (eksempel: 40/5 = 8 nmol av streptavidin-konjugert).
      3. Beregne mengden streptavidin nødvendig (µg) avhengig av streptavidin-konjugert (eksempel: streptavidin-PE [300.000 g/M] → 8 nmol nødvendig = 2400 g).
    3. Del streptavidin-phycoerythrin i 10 prøver. Legge til hver prøve et rør som inneholder biotinylated E294-302 peptid-H2Db kompleks, med et intervall på 20 min. Etter lasting siste prøven, ruge reaksjon røret på 4 ° C over natten i mørket.
  8. Bruke multimerized reagenser i en 100 kDa spinn rør og konsentrere det med sentrifugering 2000 x g på 4 ° C til et volum på < 100 µL.
  9. Fortynne prøven i spin røret til 4 mL med PBS (pH 8.0) og konsentrere det igjen til < 100 µL.
  10. Gjenta buffer utveksling trinn i PBS (pH 8.0) 4 x.
  11. Fylle opp det totale volumet igjen til 500 µL bruker PBS (pH 8.0). Konsentrere prøven til en estimert konsentrasjonen av 2-2,5 mg/mL 2000 x g på 4 ° C. Lagre utvalget i mørket på 4 ° C.

6. flowcytometri

  1. Inkuber av cellen suspensjon (fra trinn 3.9 og/eller trinn 4.15) på 4 ° C med 0,1 µL av anti-murint CD16/CD32 Fc-reseptor blokkere reagensen per 20 µL (fortynning faktor 1:200) i 10 min, for å hindre en uspesifikke binding.
  2. Sentrifuge tetramer røret i 20.000 x g i minst 15 min på 4 ° C.
  3. Legge til 20 µL av cellen suspensjon i en 96-brønnen platecontaining 1 x 106 celler hver godt.
  4. Forberede en tilstrekkelig mengde E294-302 tetramer blandingen stain alle eksperimentelle rør. Forberede et overskudd av 15% av det totale volumet av denne blandingen kontoen pipettering feil. Fortynne de E294-302 tetramers (2 mg/mL, 1 µL/test) i FACS buffer (PBS, 0,5% FBS) slik at 20 µL av E294-302 tetramer blandingen er lagt til hver test.
  5. Legge til 20 µL av E294-302 tetramer blandingen i 96-brønnen platen. Ved slutten av dette trinnet skal det siste bindet i hver brønn 40 µL.Incubate platen i mørket ved romtemperatur i 30 min.
  6. Legg primære antistoffer (FITC-konjugerte eller APC-konjugerte anti-CD3 (0,2 mg/mL), PerCP-konjugerte anti-CD8 (0,2 mg/mL)) på 1 µL/test i cellen suspensjon og deretter ruge det på 4 ° C i 30 min i mørket.
  7. Vask cellene 2 x med 2 mL FACS buffer og sentrifuger på 600 x g for 5 min. nøye Sug opp nedbryting og resuspend cellene med 200 µL FACS bufferen.
  8. Lagre prøvene midlertidig på 4 ° C i mørket til flyt cytometric analysen.
  9. Bruk følgende gating strategien for flyt cytometric analyse.
    1. Opprette en gate på diagonalt gruppert singleter ved å plotte en frem xy (FSC) versus siden xy (SSC) området.
    2. Deretter gate på CD3+ cellene ved siden xy (SSC) versus CD3; deretter gate på CD3+ CD8+ celler; til slutt, skissere CD8+ tetramer+ celler19.

7. histopatologi, Immunofluorescence og Immunohistochemistry analysen

  1. Histopatologi analysen
    1. Samle hjernen og testikkel vev av ZIKV-infiserte Ifnar1- / - mus 7 d etter inoculation og løse dem i 4% nøytrale fullbufrede formaldehyd.
      FORSIKTIG: Paraformaldehyde er giftig; bruke riktig personlig verneutstyr.
    2. Bygge inn vevet i parafin.
    3. Delen vev på 5 mm ved hjelp av en vibratome.
    4. Stain vevet med hematoxylin og eosin (H & E).
  2. Immunohistochemistry analysen
    1. Deparaffinize, rehydrate og antigen-hente vevet deler, basert på prosedyrer beskrevet tidligere21.
    2. Behandle delene vev med 3% H2O2 i PBS (pH 7.6) på 10 min og blokkerer dem med 1% bovin serum albumin (BSA) i 10 min.
    3. Inkuber delene vev med rotte anti-musen CD3 antistoff (fortynning: 1/1000) 8 h ved romtemperatur og, deretter ruge dem på 4 ° C over natten.
    4. Skyll vev med PBS, og deretter ruge dem med 3 dråper biotinylated sekundære antistoff (fortynning: 1/1000) for 2 timer ved romtemperatur, fulgt av 3 dråper avidin-biotin-peroxidase (fortynning: 1/200) i romtemperatur i 30 min.
    5. Binde, med 3 dråper 30, 30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (fortynning: 1/1000), som beskrevet tidligere22.
    6. Counterstain vev avsnittene med Mayer's hematoxylin.
  3. Immunofluorescence analysen
    1. Air-Dry frosne testikkel delene (6 mm) i 10 min ved romtemperatur.
    2. Fikse dem med iskald aceton i 10 min.
    3. Vask delene med PBS 3 x og blokkerer dem med en blokkering buffer (1% BSA, 0,3% Triton, 1 x PBS) på 37 ° C i 30 min.
    4. Inkuber delene vev med primære antistoff (Z6) (20 µg/mL) på 4 ° C over natten.
    5. Skyll vev med PBS og bruke det sekundære antistoffet (fortynningsfaktoren: 1/200) 1t på 37 ° C.
    6. Vask delene vev med PBS og counterstain dem for kjerner bruker 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (fortynningsfaktoren: 1/1000), følg produsentens instruksjoner.

Representative Results

Etter disse metodene, har vi utviklet en murine modell for ZIKV infeksjoner. Ifnar1- / - mus for 6-8 ukens av alderen var infisert med 1 x 104 fokus-forming enheter (FFU) av ZIKV av retroorbital injeksjon. Patologisk symptomer og tegn (figur 1A), samt vekt endringer (figur 1B), ble observert i Ifnar1- / - mus etter en infeksjon med ZIKV. Murine hjernen viste åpenbare ødem og hyperemia (figur 1C). I mellomtiden testiklene krympet gradvis (figur 1D). Videre ble patologiske forandringer og ødeleggelsen av vev funnet i hjernen og testikler (figur 2A). Vi utførte en immunofluorescence analysen for å oppdage ZIKV i hjernen og testikler (figur 2B). Høy viral belastning ble oppdaget i hjernen og testikkel av immunostaining (figur 2B). Immunohistochemistry viste en robust infiltrasjon av CD3+ T celler i mus hjernen etter infeksjon med ZIKV (figur 2C).

For å finne og evaluere ZIKV-spesifikke T-celle svar, vi forberedt en mus MHC-jeg H-2Db-E294-302 tetramer. Peptid E294-302 kan hjelpe H-2Db renature riktig og gi en stor mengde av løselig MHC-jeg (Figur 3A). I Skift analysen, kunne en høy effektivitet i biotinylation observeres (Figur 3B). Deretter tre streptavidin fluorescens (APC, PE, og BV421) - merket pMHC - jeg tetramers ble produsert for å oppdage ZIKV-spesifikke T-celler (Figur 3C). Tetramer PE-merket hadde en høyere effekt å oppdage de bestemte CD8+ T celle forhold til APC - og BV421-merket tetramers, men forskjellen ikke var statistisk signifikant.

Vi oppdaget bruker E294-302 tetramer, ZIKV-spesifikke T-lymfocytter i milten av infiserte mus av flowcytometri på 7 d etter vaksinasjon av ZIKV (3.49 ± 0.45%). Også ligner på metoden beskrevet i del 3 av denne protokollen, med 4 uker etter immunisering av AdC7-M/E vaksine, ZIKV-spesifikke T-lymfocytter ble oppdaget i milten (6.89 ± 1,36%) (Figur 4).

Videre oppdaget vi lymfocytter infiltrert i immunoprivileged organer, som hjernen og testiklene, etter ZIKV infeksjon. Portene ble satt til å velge for CD3+CD8+ T celler i total lymfocytter av hjernen og testiklene. En høy andel av E294-302 tetramer-spesifikke T celler ble oppdaget i hjernen (42.2% i CD3+CD8+ T celler) og i testicular (26,4% i CD3+CD8+ T celler) lymfocytter (figur 5).

Figure 1
Figur 1 : Karakterisering av ZIKV infeksjon i Ifnar1- / - mus. Ifnar1- / - mus for 6-8 ukens av alderen var infisert med 104 fokus-forming enheter (FFU) av ZIKV ved retroorbital injeksjon, og mus injisert med PBS ble brukt som infisert kontroller. (A) morfologi og (B) vekt endringer av infiserte Ifnar1- / - mus ble overvåket. Røde piler indikerer Ifnar1- / - mus presenteres med myeloparalysis og motor paraparesis etter smitte. (C) hjerner på 7 d etter vaksinering og (D) testiklene på 0, 7, 14 og 30 dager etter vaksinering ble høstet. Representant bilder av hjernen og testiklene fra mus vises med en linjal å angi størrelsene. Feilfeltene representerer gjennomsnittlig ± SEM. n = 10 mus per gruppe per forsøk. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Gjenkjenning av ZIKV og lymfocytter i hjernen og testikkel ZIKV-infiserte Ifnar1- / - mus. (A) dette panelet viser histopathological endringer i hjernen og testiklene fra ZIKV-infiserte mus sammenlignet med negative kontroller på 7 d etter vaksinering. Skala bar = 25 µm (venstre panel) og 50 µm (høyre panel). (B) en immunofluorescence analysen ble utført med anti-ZIKV Z6 antistoffer (grønn). Alle vevsprøver ble Hentet fra ZIKV-infiserte mus på 7 d etter vaksinering. Kjerner var farget med DAPI (blå). Skala bar = 50 µm. (C) Immunohistochemistry viser en robust infiltrasjon av CD3+ T celler i hjernen og testikkel. Skala bar = 25 µm (venstre panel) og 50 µm (høyre panel). Lilla indikerer hematoxylin, brown representerer CD3 antistoffer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Utarbeidelse av ZIKV-spesifikke pMHC-jeg tetramers. (A) binding av E294-302 H-2Db er belyst av i vitro en refolding. Blått angir H-2Db-E294-302 protein. Orange representerer kontrollen negative uten peptid. (B) dette panelet viser H-2Db-E294-302 Skift analysen. (C) falske representerer en PBS kontroll. Tre streptavidin fluorescens (APC, PE, og BV421) - merket pMHC - jeg tetramers ble brukt til å oppdage ZIKV-spesifikke T celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Flow cytometric analyse av virus-spesifikke CD8 + T-celler i milten ZIKV-infiserte og vaksine-vaksineres mus. Ifnar1- / - mus for 6-8 ukens av alderen var enten infisert med 104 fokus-forming enheter (FFU) av ZIKV eller mottatt en enkelt dose 4 x 1010 virus partikler av AdC7-M/E eller PBS som en negativ kontroll. Etter 7 dager etter smitte eller 4 ukene etter vaksinasjon, ble mus splenocytes høstet og analysert av flowcytometri. Dataene vises som gjennomsnittlig ± SD. statistisk analyse ble utført veis VARIANSANALYSE (ikke signifikant: P > 0,05; *P < 0,05; **P < 0.01; ***P < 0,001; ***P < 0,0001). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 5
Figur 5 : Gating strategi og representant resultatene av virus-spesifikke CD8+ T celler i hjernen og prøvene av ZIKV-infiserte mus. Representant tomter vises for infiltrere lymfocytter i (A) hjernen og (B) testikkel. En rekke porter er satt til å velge lymfoid-scatter+ og CD3+ hendelser. Av disse, CD8+ hendelser er gated for analyse av epitope-spesifikke T-celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Discussion

Immunogenic T-celle epitope spiller en betydelig rolle i cellulære immunitet mot patogener23. Dermed er gjenkjenning av ZIKV-spesifikke T celler i immunoprivileged organer en viktig metode for å forstå T-celle svar mot infeksjon naturlig ZIKV. I mellomtiden er T-celle respons oppdagelsen et utmerket verktøy for å undersøke effekten av viral vaksinen. Her viser vi en omfattende protokoll for å visualisere eksperimenter, som omfatter isolering av lymfocytter fra milt, hjernen og prøvene av ZIKV-infiserte mus, utarbeidelse av immunodominant epitope E294-302 tetramer, og anerkjennelse av ZIKV-spesifikke CD8+ T celler i immunoprivileged organer ZIKV-infiserte mus.

En tidligere studie viste at en live ZIKV eller dens RNA kan påvises i sæd av mannlig pasienter, som indikerer at ZIKV kan omgå blod-testikkel barrieren og formere seg i reproduksjonssystemet24. Tidligere viste vi også at ZIKV kan skade testiklene og føre til mannlig infertilitet i mus25. ZIKV infeksjon kan føre til viremia i rhesus aper og viral RNA kan oppdages i sentralnervesystemet (CNS) og visceral organer. Immunohistochemistry viste at ZIKV-spesifikke antigener ble presentert i CNS og flere eksterne organer26. Også i murine modeller, ZIKV infeksjon kan indusere en robust antiviral CD8+ T-celle respons i milten og CNS26.

Sammenlignet med tidligere arbeid, denne studien etablerer systematisk metoder for å oppdage ZIKV-spesifikke CD8+ T-celle svar i hjernen og testiklene, som er immunoprivileged. Det er viktig å vurdere funksjonaliteten til virus-spesifikke T celler i det immunoprivileged organer av ZIKV-infiserte mus. Bruk av tetramers å oppdage ZIKV-spesifikke CD8+ T-celle svar i immunoprivileged organer vil kraftig forbedre vår forståelse av ZIKV infeksjoner og deres vert immunreaksjoner. Bruker E294-302 tetramer, kan virus-spesifikke T celler i hjernen og testikkel være isolert av flowcytometri, for å undersøke mobilnettet mekanismer for beskyttelse og immunopathogenesis under en ZIKV infeksjon. I mellomtiden er det nyttig for forskere å undersøke ytterligere funksjoner i CD8+ T celler til å kontrollere ZIKV eller å forbedre immunopathogenesis i disse organene under ZIKV infeksjon.

Analysere antigen-spesifikke murine CD8+ T-celle svar immunoprivileged organer, vi forberedt H-2Db-E294-302 tetramer og oppdaget CD8+ T celler av flowcytometri. Tetramers er et kraftig verktøy for å oppdage antigen-spesifikke T-celler. Her ble tre typer fluorochrome-konjugerte streptavidin (APC, PE, og BV421) generert. Selv om det er ingen statistisk signifikante forskjeller i APC-, BV421- og PE-merket tetramers for å oppdage antigen-spesifikke T-celler, PE-merket pMHC-jeg tetramers ga best resultat. Derfor ble tetramer PE-merket brukt i denne studien. Interessant, basert på PE-merket H-2Db-E294-302 tetramer, vi har oppdaget høye prosenter av antigen-spesifikke T-celler både i hjernen og testiklene, som indikerer migrasjon muligheten for virus-spesifikke T-celler fra blodet immunoprivileged organer.

Det er imidlertid noen begrensninger for protokollen. H-2Db-E294-302 tetramer er ikke nyttig for menneskelige T-celle gjenkjenning, fordi tetramer påvisning er avhengig av MHC begrensning. Screening av immunodominant HLA-begrenset peptider er fortsatt behov. Dessuten retro-orbital infeksjon er effektive for en ZIKV infeksjon, men kan være ikke en praktisk drift for noen etterforskere. Dermed anbefales andre ruter på infeksjon, inkludert peritoneal, subkutan eller intravenøs, også.

I protokoll beskrevet her, er en avgjørende skritt isolering av monocytter fra hjernen og testikkel. Det er viktig å få høy kvalitet lymfocytter; Derfor er det viktig å ta hensyn til, for eksempel sentrifugal hastighet, styrke sliping vevet og Disseksjon av hjernen og testikkel vev. Dessuten på tetramer forberedelser er proteasehemmere (PMSF, pepstatin, leupeptin) nyttig når beskytte et protein blir dårligere. Derfor er det fornuftig å legge til en protease hemmer refolding bufferen og bytte bufferen under prosessen med tetramer utarbeidelse.

I konklusjonen, presenterer vi metoder av oppdager antigen-spesifikke T-celle svar i immunoprivileged organer i Ifnar1- / - musemodell for en ZIKV infeksjon. Denne plattformen kan bli mye brukt for å undersøke immun mekanismer for nye og gjenoppstå virus som kan omgå barrierene mellom blod og immunoprivileged organer. Videre, denne studien kan bane vei for den fremtidige utviklingen av kandidaten vaksiner og immunotherapies.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å fortolle.

Acknowledgments

Forfatterne takker Gary Wong for engelsk revisjon. Dette arbeidet ble støttet av National nøkkelen forskning og utvikling Program i Kina (grant 2017YFC1200202), den store spesielle prosjekter for smittsomme sykdommer forskning i Kina (grant 2016ZX10004222-003). George F. Gao er en ledende viktigste etterforsker National Natural Science Foundation av Kina nyskapende forskningsgruppe (grant 81621091).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Z6 our lab Ma W, Li S, Ma S, et al. Zika virus causes testis damage and leads to male infertility in mice. Cell, 2016, 167: 1511-1524 e1510
CD3 Santa Cruz sc-1127; RRID: AB_631128
Fluorescein-Conjuated Affinipure Goat anti-human IgG(H+L) ZSGB-BIO ZF-0308
Rabbit Anti-Goat IgG, FITC Conjugated CWBIO CW0115
FITC anti-mouse CD3 Biolegend 17A2
APC anti-mouse CD3 Biolegend 100236
PerCP anti-mouse CD8a Biolegend 100732
Percoll GE Healthcare P8370
PMSF Ameresco 0754-5G Toxic and corrosive reagent.
Handle with care
Streptadivin BD S4762-FZ Gives a clear solution at 10mg/ml in PBS and  stored at -20 °C
Pepstatin Sigma P4265-5MG 5 mg in 2.5 mL DMSO, aliquots stored at -20 ºC
Leupeptin Sigma L8511 5 mg in 2.5 mL dH2O, aliquots stored at - 20 ºC
Peptides Scilight-peptide Must be resuspended in DMSO and stored at -20 °C
RPMI 1640 Hyclone SH30809.01 Must be stored at 4 °C
DMSO MP 219605590 Store at room temperature.
APC-Streptadivin BD 554067 Must be stored and maintained at
4 °C. Do not freeze.
FITC-Streptadivin BD 554060 Must be stored and maintained at
4 °C. Do not freeze.
PE-Streptadivin BD 554061 Must be stored and maintained at
4 °C. Do not freeze.
BV421-Streptadivin BD 563259 Must be stored and maintained at
4 °C. Do not freeze.
PageRuler Unstained Protein Ladder Thermo Fisher Scientific  26614 Must be stored at 4 °C
Cell Strainers BF BF10-5040 Store at room temperature.
Amicon Ultra 100 kDa Millipore UFC510024 Store at room temperature.
Ultracentrifuge Thermo Fisher Scientific 
FACS Cantol Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used.
Superdex 200 Increase 10/300 GL  GE healthcare 28990944
AKTA PURE GE healthcare
red blood cell lysis buffer Solarbio R1010 Store at 4 °C.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dick, G. W., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), 509-520 (1952).
  2. Hazin, A. N., et al. Computed Tomographic Findings in Microcephaly Associated with Zika Virus. The New England Journal of Medicine. 374 (22), 2193-2195 (2016).
  3. Zhang, Y., et al. Highly diversified Zika viruses imported to China, 2016. Protein & Cell. 7 (6), 461-464 (2016).
  4. Cauchemez, S., et al. Association between Zika virus and microcephaly in French Polynesia, 2013-15: a retrospective study. The Lancet. 387 (10033), 2125-2132 (2016).
  5. Turtle, L., et al. Human T cell responses to Japanese encephalitis virus in health and disease. The Journal of Experimental Medicine. 213 (7), 1331-1352 (2016).
  6. Dudley, D. M., et al. A rhesus macaque model of Asian-lineage Zika virus infection. Nature Communications. 7, 12204 (2016).
  7. Osuna, C. E., et al. Zika viral dynamics and shedding in rhesus and cynomolgus macaques. Nature Medicine. 22 (12), 1448-1455 (2016).
  8. Stettler, K., et al. cross-reactivity, and function of antibodies elicited by Zika virus infection. Science. 353 (6301), 823-826 (2016).
  9. Zhao, M., Zhang, H., Liu, K., Gao, G. F., Liu, W. J. Human T-cell immunity against the emerging and re-emerging viruses. Science China Life Sciences. 60 (12), 1307-1316 (2017).
  10. Huang, H., et al. CD8+ T Cell Immune Response in Immunocompetent Mice during Zika Virus Infection. Journal of Virology. 91 (22), 00900-00917 (2017).
  11. Elong Ngono, A., et al. Mapping and Role of the CD8+ T Cell Response During Primary Zika Virus Infection in Mice. Cell Host & Microbe. 21 (1), 35-46 (2017).
  12. Marques, E. T. A., Burke, D. S. Tradition and innovation in development of a Zika vaccine. The Lancet. 391 (10120), 516-517 (2017).
  13. Xu, K., et al. Recombinant Chimpanzee Adenovirus Vaccine AdC7-M/E Protects against Zika Virus Infection and Testis Damage. Journal of Virology. , 01722-01817 (2018).
  14. Jama, B. P., Morris, G. P. Generation of human alloantigen-specific T cells from peripheral blood. Journal of Visualized Experiments. (93), e52257 (2014).
  15. Legoux, F. P., Moon, J. J. Peptide:MHC tetramer-based enrichment of epitope-specific T cells. Journal of Visualized Experiments. (68), e4420 (2012).
  16. Govindarajan, S., Elewaut, D., Drennan, M. An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen. Journal of Visualized Experiments. (105), e53256 (2015).
  17. Posel, C., Moller, K., Boltze, J., Wagner, D. C., Weise, G. Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain. Journal of Visualized Experiments. (108), e53658 (2016).
  18. Altman, J. ohnD., et al. Phenotypic Analysis of Antigen-Specific T Lymphocytes. Science. 274, 94-96 (1996).
  19. Li, H., Zhou, M., Han, J., Zhu, X., Dong, T., Gao, G. F., Tien, P. Generation of murine CTL by a hepatitis B virus-specific peptide and evaluation of the adjuvant effect of heat shock protein glycoprotein 96 and its terminal fragments. J Immunol. 174 (1), 195-204 (2005).
  20. Valkenburg, S. A., et al. Preemptive priming readily overcomes structure-based mechanisms of virus escape. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5570-5575 (2013).
  21. Shang, T., et al. Toll-like receptor-initiated testicular innate immune responses in mouse Leydig cells. Endocrinology. 152 (7), 2827-2836 (2011).
  22. Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons. Journal of Visualized Experiments. (99), e52293 (2015).
  23. Zhou, M., et al. Screening and identification of severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus-specific CTL epitopes. The Journal of Immunology. 177 (4), 2138-2145 (2006).
  24. Barzon, L., Lavezzo, E., Palu, G. Zika virus infection in semen: effect on human reproduction. The Lancet Infectious Diseases. 17 (11), 1107-1109 (2017).
  25. Ma, W., et al. Zika Virus Causes Testis Damage and Leads to Male Infertility in Mice. Cell. 167 (6), 1511-1524 (2016).
  26. Li, X. F., et al. Characterization of a 2016 Clinical Isolate of Zika Virus in Non-human Primates. EBioMedicine. 12, 170-177 (2016).

Tags

Immunologi og infeksjon problemet 140 Zika virus antigen-spesifikke T celle vaksinasjon immunoprivileged organer tetramer
Evaluering av Zika Virus-spesifikke T-celle svar i Immunoprivileged organer av infiserte Ifnar1<sup>- / -</sup> mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Y., Zhang, H., Ma, W., Liu,… More

Zhang, Y., Zhang, H., Ma, W., Liu, K., Zhao, M., Zhao, Y., Lu, X., Zhang, F., Li, X., Gao, G. F., Liu, W. J. Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice. J. Vis. Exp. (140), e58110, doi:10.3791/58110 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter