Summary
इस प्रोटोकॉल को अलग करने के लिए एक सरल और कुशल विधि प्रस्तुत करता है, की पहचान और स्थिर राज्य या सूजन के दौरान चूहों के मायोकार्डियम में रहने वाले प्रतिरक्षा कोशिकाओं को बढ़ाता है. प्रोटोकॉल एंजाइमी और यांत्रिक पाचन एक एकल सेल निलंबन है कि आगे प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है की पीढ़ी के लिए जोड़ती है ।
Abstract
प्रतिरक्षा प्रणाली एक स्वस्थ दिल का एक आवश्यक घटक है । मायोकार्डियम दोनों स्थिर राज्य के दौरान और सूजन के विभिंन रूपों के दौरान कार्यात्मक compartmentalization के साथ अलग प्रतिरक्षा सेल सबसेट के एक अमीर आबादी के लिए घर है । हाल ही में जब तक, दिल में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अध्ययन के उपयोग की आवश्यकता माइक्रोस्कोपी या खराब पाचन प्रोटोकॉल, जो गंभीर सूजन के दौरान पर्याप्त संवेदनशीलता प्रदान की है लेकिन विश्वास करने में असमर्थ थे की पहचान करने के लिए छोटे-लेकिन कुंजी-की आबादी स्थिर अवस्था के दौरान कक्ष । यहां, हम एक सरल एंजाइमी संयोजन विधि चर्चा (collagenase, hyaluronidase और DNAse) और murine दिल के यांत्रिक पाचन फ्लोरोसेंट-बला एंटीबॉडी के intravascular प्रशासन से पहले छोटे लेकिन अपरिहार्य अंतर intravascular कोशिका दूषित होते. इस विधि अलग व्यवहार्य कोशिकाओं है कि पहचान, phenotyping और ठहराव, या आगे प्रतिदीप्ति के साथ शुद्ध-सक्रिय कोशिका छंटाई या चुंबकीय मनका जुदाई के लिए के लिए प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है की एक निलंबन उत्पंन transcriptional एनालिसिस या इन विट्रो स्टडीज । हम दिल की कुंजी मैक्रोफेज और वृक्ष कोशिका आबादी अंतर करने के लिए एक कदम दर कदम प्रवाह cytometric विश्लेषण का एक उदाहरण शामिल हैं । एक मध्यम आकार के प्रयोग के लिए (10 दिलों) प्रक्रिया के पूरा होने की आवश्यकता है 2 – 3 h.
Introduction
कोरोनर (ischemia reperfusion या रोधगलन) और गैर-कोरोनरी (उच्च रक्तचाप या मायोकार्डिटिस) सहित रोधगलन तनाव या चोट के विभिन्न रूपों, प्रतिकारक और सुरक्षात्मक के साथ भड़काऊ कोशिकाओं की भर्ती को बढ़ावा देने, लेकिन यह भी रोगजनक गुण । १८९१ के रूप में जल्दी के रूप में, Romberg पहले सेलुलर की उपस्थिति का वर्णन सन्निपात और लाल रंग बुखार से संक्रमित रोगियों की मायोकार्डियम में घुसपैठ1। तथापि, हृदय प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विस्तृत अध्ययन और अधिक उन्नत immunophenotyping तकनीकों के विकास की आवश्यकता. एक परिणाम के रूप में, केवल हाल ही में हम समझते है कि स्थिर राज्य के दौरान आवश्यक रखरखाव भूमिकाओं के साथ प्रतिरक्षा कोशिकाओं की एक विविध जनसंख्या मायोकार्डियम के भीतर रहता शुरू कर दिया है ।
प्रोटोकॉल गया है, और अभी भी है, सबसे आम विधि सूजन के दौरान हृदय प्रतिरक्षा कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए । हालांकि, जबकि प्रोटोकॉल एक मूल्यवान नैदानिक उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है, हृदय प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अध्ययन में इसके उपयोग की महत्वपूर्ण सीमाएं हैं । मायोकार्डियम में रहने वाले प्रतिरक्षा कोशिकाओं कुल कोशिकाओं के एक बहुत छोटे अनुपात का प्रतिनिधित्व करते हैं और अधिक या कम समान रूप से एक आनुपातिक अपार अंतरिक्ष में वितरित कर रहे हैं. इसी तरह, वायरल मायोकार्डिटिस के रूप में हृदय शोथ, के कई रूपों, सूजन के फोकल पैटर्न दिखाते हैं । इसका मतलब यह है कि दिल की प्रतिरक्षा प्रणाली के सटीक विश्लेषण अक्सर ऊतकवैज्ञानिक नमूना की उच्च डिग्री की आवश्यकता होती है, पूर्वाग्रह को कम करने के लिए लागत में वृद्धि. इसके अलावा, प्रोटोकॉल सेल पहचान में प्रयोग करने योग्य जानकारी का एक बहुत ही सीमित मात्रा प्रदान करता है (पैरामीटर की संख्याउदा ) । सेल उपसमुच्चय है कि कई अभिव्यक्ति मार्करों (सतह मार्कर, प्रतिलेखन कारकों या गुप्त अणुओं सहित) के उपयोग की आवश्यकता होती है की एक बढ़ती संख्या के साथ, प्रवाह cytometry खुद immunophenotyping के लिए सबसे शक्तिशाली उपकरण के रूप में स्थापित किया गया है, कम लागत और उच्च प्रवाह के कारण ।
immunophenotyping तकनीक का उपयोग कुशल पाचन प्रोटोकॉल है कि कोशिकाओं की बड़ी संख्या के एकल कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए अनुमति के विकास पर बारीकी से निर्भर है । कोशिका निष्कर्षण के संपूर्ण प्रोटोकॉल के विकास कार्डियक इम्यूनोलॉजी के अध्ययन में अवसरों की एक नई विंडो खोला । पाचन, प्रवाह cytometry और transcriptomics के संयोजन के माध्यम से, दिल में रहने वाले मैक्रोफेज और वृक्ष कोशिकाओं की प्रमुख आबादी2,3विशेषता है । स्थिर राज्य के दौरान हृदय प्रतिरक्षा कोशिकाओं की सबसे प्रचुर जनसंख्या CD64+MerTK+ मैक्रोफेज, जो आगे CCR2 या CD11c2की अपनी अभिव्यक्ति के आधार पर विभाजित किया जा सकता है । CCR2+ मैक्रोफेज वयस्क अस्थि मज्जा hematopoiesis से उत्पंन, CCR2 के बहुमत- मैक्रोफेज, जो MHC के उच्च या निंन स्तर-द्वितीय व्यक्त कर सकते हैं, जंम के पूर्व मूल के मुख्य रूप से कर रहे हैं । मैक्रोफेज की मरंमत4 और चोट के दौरान5 मलबे को हटाने या स्थिर राज्य में बिजली कनेक्टिविटी6 का समर्थन करने के रूप में महत्वपूर्ण कार्य करते हैं । सूजन के विभिन्न रूपों के दौरान Ly6Chi MHC-IIlo CD64int monocytes की एक महत्वपूर्ण आमद होती है, जो बाद में अंतर Ly6Chi CCR2+ मैक्रोफेज2,7 . एक काफी छोटे, लेकिन महत्वपूर्ण, स्वस्थ व्यक्तियों के मायोकार्डियम में रहने वाले कोशिकाओं की जनसंख्या वृक्ष कोशिकाओं8,9से बना है । कार्डिएक पारंपरिक dc (cDCs) के दो प्रमुख सबसेट हाल ही में विशेषता की गई है: cDC1 (CD103+ dc) और cDC2 (CD11b+ dc) । dc संक्रमण के खिलाफ रक्षा में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं8 लेकिन यह भी सूजन के दौरान आत्म चोट को बढ़ावा देने कर सकते हैं, विशेष रूप से रोधगलन9के दौरान.
यहां, हम माउस मायोकार्डियम से व्यवहार्य हृदय प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक सरल विधि का वर्णन । विधि एंजाइमी और यांत्रिक पाचन एक सेल के साथ जोड़ती है-छलनी निस्पंदन क्रम में एक एकल सेल निलंबन है कि विश्लेषण किया जा सकता है प्राप्त करने के लिए, या आगे शुद्ध, प्रवाह cytometry छंटाई या चुंबकीय मनका संवर्धन द्वारा । extravascular रोधगलन की सटीक माप कार्डियक microvasculature के खून से संभावित दूषित पदार्थों को दूर करने के क्रम में हृदय छिड़काव की आवश्यकता होती है । इसके अलावा, हम प्रतिरक्षा कोशिकाओं के intravascular लेबलिंग का एक वैकल्पिक कदम है कि आगे intravascular दूषित पदार्थों से रोधगलन, Galkina एट अल. प्रोटोकॉल पर आधारित में अंतर करने के लिए इस्तेमाल कियाजा सकता वर्तमान । अंत में, हम प्रमुख मैक्रोफेज और सीडीसी उपआबादी की पहचान करने के लिए एक बुनियादी प्रवाह cytometry विश्लेषण प्रस्तुत करते हैं ।
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Protocol
नैतिकता वक्तव्य: इस प्रोटोकॉल की समीक्षा की है और विश्वविद्यालय स्वास्थ्य नेटवर्क (टोरंटो, कनाडा) में पशु देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित और पशु देखभाल पर कनाडा परिषद के साथ अनुपालन में है ।
1. बफर तैयारी
- तैयार HBB बफर (है हांक संतुलित नमक समाधान (HBSS), 2% गर्मी निष्क्रिय गोजातीय सीरम, ०.२% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन) । HBSS की ५०० मिलीलीटर गर्मी निष्क्रिय गोजातीय सीरम और गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन के 1 ग्राम के 10 मिलीलीटर जोड़ें । एक ०.२ µm फिल्टर और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान के माध्यम से फ़िल्टर निष्फल ।
- FACS बफर तैयार (फास्फेट खारा (पंजाबियों), 2% गर्मी निष्क्रिय गोजातीय सीरम, 1 मिमी Ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA, पीएच ८.०)) । 10 मिलीलीटर गर्मी निष्क्रिय गोजातीय सीरम और ०.५ एम EDTA के 1 मिलीलीटर के लिए पंजाब के ५०० मिलीलीटर जोड़ें । एक ०.२ µm फिल्टर और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान के माध्यम से फ़िल्टर निष्फल ।
नोट: समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 महीने के लिए संग्रहित किया जा सकता है ।
2. परिसंचारी ल्यूकोसाइट्स की ्र
- Aseptically तैयार एंटी-माउस CD45 इंजेक्शन के साथ 1 µ जी के एंटीबॉडी में पतला बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के लिए एक अंतिम इंजेक्शन की मात्रा के लिए २०० µ l/ एक 28.5 जी इंसुलिन सिरिंज में मात्रा लोड और प्रकाश से दूर रखना.
नोट: intracardiac धुंधला (पाचन के बाद दाग से i.v. प्रशासन के माध्यम से दाग) intravascular अंतर करने के क्रम में दो अलग fluorochrome-बला विरोधी CD45 एंटीबॉडी का उपयोग करें, चरण 4 देखें । -
पूर्व गर्म चूहों (8-12 सप्ताह पुरानी) 5 मिनट के लिए एक लाल गर्मी चिराग को पूंछ को उजागर करके ।
चेतावनी: जानवर से ज़्यादा गरम न करें । एक सुरक्षित दूरी पर दीपक रखें (> 30 सेमी) ।- एक उपयुक्त डिवाइस का उपयोग कर कठोर स्थिति में पशु नियंत्रित । बेनकाब और सूचकांक और मध्यम उंगली और अंगूठे और अंगूठी उंगली के साथ पूंछ के मध्य बाहर क्षेत्र के साथ पूंछ के आधार को स्थिर करने से गैर प्रमुख हाथ से पूंछ को अस्थिर ।
चेतावनी: पूंछ की नोक पर बहुत अधिक बल लागू नहीं के रूप में त्वचा से खींचा जा सकता है । नस में ऊपर का सामना करना पड़ बेवल के साथ सुई डालें । सुई को हर समय नस के समानांतर रखें क्योंकि यह नस को छिन्न-भिन्न करने में आसान है ।
नोट: रक्त सिरिंज दर्ज हो सकता है और एक अच्छा इंजेक्शन का एक संकेत है । एक ९० ° कोण के लिए सुई झुकने i.v. प्रशासन की सुविधा कर सकते हैं । झुकने सुई एक जोखिम का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं के रूप में अपने सुरक्षा कार्यालय के साथ की पुष्टि करें । - पूंछ नस में नसों में २०० µ एल सुई । द्रव आसानी से प्रवाह और नस अस्थाई रूप से स्पष्ट करना चाहिए ।
चेतावनी: यदि प्रतिरोध से मुलाकात की है द्रव में बल नहीं है । इस सुई के स्थान पर हस्ताक्षर है । - एंटीबॉडी humanely euthanizing माउस से पहले 5 मिनट के लिए प्रसारित करने की अनुमति दें ।
- एक उपयुक्त डिवाइस का उपयोग कर कठोर स्थिति में पशु नियंत्रित । बेनकाब और सूचकांक और मध्यम उंगली और अंगूठे और अंगूठी उंगली के साथ पूंछ के मध्य बाहर क्षेत्र के साथ पूंछ के आधार को स्थिर करने से गैर प्रमुख हाथ से पूंछ को अस्थिर ।
3. दिल को अलग और पाचन
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Euthanize2 का उपयोग कर चूहों या अंय संस्थागत द्वारा स्वीकार किए जाते है इच्छामृत्यु प्रक्रिया ।
- सीओ2 इच्छामृत्यु के लिए, सीओ2 चैंबर में माउस प्लेस और प्रति मिनट चैंबर मात्रा का 20% करने के लिए भरने की दर निर्धारित (यानी, अगर चैंबर 10 एल है, 2 एल पर भरें/ 2 मिनट और निगरानी माउस के लिए भागो जब तक श्वास रह गया है ।
- सह2 बंद और एक अतिरिक्त 1-2 मिनट के लिए माउस को छोड़ दें । सुनिश्चित श्वास चैंबर खोलने और एक पैर की अंगुली चुटकी करने के लिए माउस की प्रक्रिया आगे बढ़ने से पहले मर चुका है की पुष्टि करने से पहले रह गया है ।
- ७०% इथेनॉल के साथ माउस स्प्रे । पेट में त्वचा लिफ्ट और काटना ventral midline कूल्हों के स्तर पर शुरुआत के साथ काटने से उरोस्थि तक माउस । पेट खोलें और डायाफ्राम को बेनकाब करने के लिए जिगर ले जाएँ.
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डायाफ्राम काट, तो midline के दोनों किनारों पर पसलियों, फेफड़ों और दिल puncturing से बचने के लिए सावधान किया जा रहा है ।
- वापस पसलियों छीलने से दिल बेनकाब, तो पहले बाएं atria सही atria द्वारा पीछा काटा ।
चेतावनी: atria काटने जब सावधानी का प्रयोग करें, कोई धमनियों या नसों को सुनिश्चित करने के घायल हो रहे हैं, के रूप में यह अंगों में निहित रक्त फ्लश करने की क्षमता में कमी कर सकते हैं । - Perfuse के साथ दिल को 15 – 20 मिलीलीटर एक 21 जी सुई और ठंडे पंजाबियों के साथ सज्जित एक ६० मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर ठंड पंजाबियों की । धीरे संदंश के साथ दिल का आधार समझ और शीर्ष के पास बाईं निलय में सुई डालें. सही निलय में प्रक्रिया को दोहराएँ. सफेद फेफड़ों और पीला जिगर में एक उचित इंजेक्शन परिणाम ।
नोट: छिड़काव रक्त जमावट से बचने के क्रम में इच्छामृत्यु के बाद 5 मिनट के भीतर प्रदर्शन किया जाना चाहिए, जो परिचालित कोशिकाओं के साथ ब्याज के अंगों को दूषित कर सकते हैं ।
- वापस पसलियों छीलने से दिल बेनकाब, तो पहले बाएं atria सही atria द्वारा पीछा काटा ।
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संदंश के साथ दिल का आधार पकड़ो और धीरे से दिल खींचने के लिए, तो प्रमुख फुफ्फुसीय धमनियों और नसों, महाधमनी और pericardial बोरी काटने से दिल अलग ।
- धीरे से एक साफ एक प्रकार का वृक्ष-मुक्त कागज तौलिया में अंगूठे और तर्जनी उंगलियों के बीच दिल पकड़ और प्रमुख धमनियों और नसों और संदंश के साथ किसी भी अंय दूषित पदार्थों के atria और अवशेष खींच दिल साफ ।
नोट: सुनिश्चित करें कि atria की संपूर्णता निकाल दिया जाता है और कोई अंय ऊतकों, जैसे फेफड़ों या रक्त वाहिकाओं, इन ऊतकों को अपने स्वयं के निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं के रूप में मौजूद हैं । विशेष रूप से फेफड़ों में एक बड़ी प्रतिरक्षा कोशिका आबादी है कि मायोकार्डियम के भीतर उन के छोटे आबादी मुखौटा कर सकते है ।
- धीरे से एक साफ एक प्रकार का वृक्ष-मुक्त कागज तौलिया में अंगूठे और तर्जनी उंगलियों के बीच दिल पकड़ और प्रमुख धमनियों और नसों और संदंश के साथ किसी भी अंय दूषित पदार्थों के atria और अवशेष खींच दिल साफ ।
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ठंडे पंजाबियों के ५० µ l के साथ 5 सेमी प्लास्टिक डिश में दिल को लगाएं ।
- घुमावदार विदारक कैंची का उपयोग दिल कीमा जब तक कोई दिखाई टुकड़े कर रहे है और यह एक चिकनी निरंतरता है ।
नोट: काटने के दौरान पकवान के एक निहित क्षेत्र में दिल रखने के लिए ऊतक नुकसान को कम करने की कोशिश करो । - ८०० µ एल कोल्ड Dulbecco के संशोधित ईगल मीडियम (DMEM) के साथ 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में घुमावदार संदंश का उपयोग कर thetrituratedheart ऊतक स्थानांतरण ।
- घुमावदार विदारक कैंची का उपयोग दिल कीमा जब तक कोई दिखाई टुकड़े कर रहे है और यह एक चिकनी निरंतरता है ।
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जोड़ें ४५० u/एमएल ofcollagenase मैं, ६० u/एमएल के hyaluronidase प्रकार i-S, और ६० u/एमएल DNase-i के प्रत्येक नमूने के लिए ।
- 45-60 मिनट के लिए ५० rpm पर एक कमाल की शेखर पर ३७ डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की मशीन ।
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पाचन के बाद, संक्षेप भंवर नमूने (20 एस) और बर्फ पर तुरंत जगह 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने रखने के लिए ।
- एक 1 मिलीलीटर pipettor का प्रयोग, पिपेट नमूने ऊपर और नीचे जब तक ऊतक नमूने सजातीय है और पिपेट टिप रोकना नहीं है ।
नोट: पिपेट करने के लिए समय की एक विशिष्ट संख्या को परिभाषित reproducibility बढ़ सकता है । अगर दिल नहीं बिगड़ेगा, मायोकार्डियम के टुकड़े पिपेट बाधा हो सकता है । धीरे microcentrifuge ट्यूब के खिलाफ पिपेट टिप पीसने ऊतक के homogenize बड़ा टुकड़े में मदद मिलेगी ।
- एक 1 मिलीलीटर pipettor का प्रयोग, पिपेट नमूने ऊपर और नीचे जब तक ऊतक नमूने सजातीय है और पिपेट टिप रोकना नहीं है ।
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पूर्व गीला एक ४० µm सेल छलनी एक ५० एमएल शंकु ट्यूब पर रखा के साथ 1 मिलीलीटर शीत HBB ।
- फिल्टर करने के लिए homogenized नमूना जोड़ें और धीरे से डाल के माध्यम से धो 12-ठंड HBB के 14 मिलीलीटर ।
- एक बला 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब करने के लिए फ़िल्टर किए गए नमूनों हस्तांतरण और 4 डिग्री सेल्सियस पर रहते हैं ।
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4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४०० x g पर नमूने केंद्रापसारक । महाप्राण बंद supernatant.
- प्रत्येक नमूने के लिए अमोनियम-क्लोराइड-पोटेशियम (ले) lysis बफर की 1 मिलीलीटर जोड़कर लाल रक्त कोशिकाओं लाइसे । भंवर और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी से नमूने resuspend ।
- एक बार lysis पूरा कर लिया है, 5-8 ठंडा है हांक संतुलित नमक समाधान (HBSS) के मिलीलीटर hemolysis रोकने के लिए जोड़ें ।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर ४०० x gfor 5 मिनट पर नमूने केंद्रापसारक । महाप्राण बंद supernatant.
- प्रत्येक नमूने के लिए FACS बफर की 1 मिलीलीटर जोड़ें और एक बला १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण ।
नोट: प्रोटोकॉल 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत नमूनों के साथ 2 घंटे के लिए यहाँ रोका जा सकता है.
4. प्रवाह Cytometry धुंधला और विश्लेषण
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4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४०० x g पर नमूने केंद्रापसारक ।
- गैर-विशिष्ट एंटीबॉडी बाइंडिंग को कम करने के लिए, 1:100 anti-CD16/CD32 और Monocyte अवरोधक (1:20) ( सामग्री तालिकादेखें) के लिए लेखांकन ५० µ l FACS प्रति नमूना पतला । 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
- एंटीबॉडी कमजोर पड़ने (प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए 1:250) लेखांकन के लिए ५० µ एल प्रति नमूना FACS के लिए तैयार करें ।
नोट: एक व्यवहार्यता डाई एंटीबॉडी कॉकटेल में शामिल किया जा सकता है ताकि मृत कोशिकाओं को बाहर करने के लिए । वैकल्पिक रूप से, प्रवाह विश्लेषण द्वारा छोटे आकार अपवर्जन (चित्रा 1सी और डी) इस्तेमाल किया जा सकता है । - धोने के बिना, प्रत्येक नमूना और मिश्रण करने के लिए एंटीबॉडी मास्टर मिश्रण के ५० µ एल जोड़ें ।
- अंधेरे में 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की मशीन ।
- जोड़ने के लिए प्रत्येक नमूने के लिए ६०० µ l FACS जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४०० x g पर नमूने केंद्रापसारक ।
- महाप्राण बंद supernatant और ३०० µ एल FACS में गोली स्थगित । 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने अंधेरे में रखें ।
नोट: कुछ व्यवहार्यता रंजक, जैसे DAPI, प्रवाह cytometry चलने से पहले 10 मिनट के भीतर धुंधला होने की आवश्यकता है । - प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण ( आंकड़े 1 और 2देखें) के भीतर अगले 3 एच । यदि एक लंबे समय की आवश्यकता है, लघु अवधि के निर्धारण एक कम एकाग्रता का उपयोग कर paraformaldehyde (पंजाब में 0.5-1%) धुंधला के संरक्षण की सिफारिश की है ।
नोट: यह अत्यधिक प्रवाह cytometer के fluidics की रुकावट को रोकने के क्रम में प्रवाह cytometry विश्लेषण आरंभ करने से पहले एक ४० µm सेल छलनी के माध्यम से फिल्टर नमूनों की सिफारिश की है ।
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Representative Results
तिथि करने के लिए, कोई अच्छी विधि अंय कार्डियक सेल घटकों, जैसे cardiomyocytes से प्रतिरक्षा कोशिकाओं को अलग करने के लिए डिज़ाइन किया गया है । इसलिए, हृदय एकल कोशिका निलंबन के विश्लेषण प्रवाह cytometry द्वारा एक पूर्व गेटिंग की आवश्यकता है प्रतिरक्षा कोशिका आबादी की पहचान करने के लिए CD45 के साथ, एकल कोशिका और छोटे आकार अपवर्जन गेटिंग के बाद (चित्रा 1a) । वैकल्पिक रूप से, एक व्यवहार्यता धुंधला मृत कोशिकाओं को बाहर करने के लिए किया जा सकता है । छोटे आकार अपवर्जन और व्यवहार्यता डाई धुंधला लगभग बराबर तरीकों का प्रतिनिधित्व करने के लिए मृत कोशिकाओं को बाहर करने के लिए (चित्रा 1बी और 3 डी) । यह अत्यधिक पाचन प्रक्रिया के बाद जल्द ही धुंधला एंटीबॉडी के साथ आगे बढ़ने की सिफारिश की है और हमेशा 4 डिग्री सेल्सियस पर सेल निलंबन रखने के लिए, कोशिकाओं की व्यवहार्यता के रूप में क्षय हो सकता है । इस प्रक्रिया को आम तौर पर पैदावार के बारे में 80-व्यवहार्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं के 90% ।
मायोकार्डियम प्रतिरक्षा कोशिकाओं की एक विविध कॉलोनी घरों, जिनमें से कई अभी भी पहचान और लक्षण वर्णन लंबित हैं । मैक्रोफेज, CD64+ कोशिकाओं के रूप में की पहचान की, दिल की प्रमुख प्रतिरक्षा जनसंख्या हैं, 60 का प्रतिनिधित्व-सभी प्रतिरक्षा कोशिकाओं के 70% (चित्रा 1सी, ऊपर) । एक वयस्क murine दिल के पाचन के बारे में 3-5 x 104 मैक्रोफेज, दिल के आकार के आधार पर पैदावार । कार्डिएक मैक्रोफेज आगे CD11c या CCR2 और MHC-II2के अपने स्तर की उनकी अभिव्यक्ति के आधार पर विभाजित किया जा सकता है ।
अंय हृदय प्रतिरक्षा उपजनसंख्या है कि अच्छी तरह से किया गया है विशेषता पारंपरिक वृक्ष कोशिकाओं रहे हैं । परम्परागत dc CD64- कोशिकाएँ हैं जो MHC-द्वितीय और CD11c के उच्च स्तर (चित्रा 1C, नीचे) के उच्च स्तर तक मध्यवर्ती व्यक्त करते हैं. इन कोशिकाओं को आगे या तो CD103 या CD11b8,9की उनकी अभिव्यक्ति के आधार पर विभाजित किया जा सकता है । dc मैक्रोफेज की तुलना में एक बहुत छोटे कार्डियक उपजनसंख्या का प्रतिनिधित्व करते हैं । प्रत्येक सबसेट के १५० और ५०० dc के बीच एक वयस्क murine हृदय पैदावार का पाचन ।
ठंड पंजाबियों के साथ दिल की छिड़काव आवश्यक है जब मायोकार्डियम के भीतर प्रतिरक्षा कोशिका आबादी की पहचान । हालांकि, अपूर्ण छिड़काव के नमूनों में intravascular पदार्थों की मात्रा में वृद्धि हो सकती है, महत्वपूर्ण पूर्वाग्रह है कि परिधीय परिवर्तन (रक्त) के बजाय हृदय की घुसपैठ में परिवर्तन पर आधारित हो सकता है के लिए अग्रणी । इन मामलों में, फ्लोरोसेंट-बला विरोधी CD45 एंटीबॉडी, जो सभी प्रतिरक्षा स्थूल के माध्यम से परिचालित कोशिकाओं लेबल के intravascular प्रशासन-और microvasculature (चित्रा 2ए), में मदद कर सकते हैं रोधगलन से अलग intravascular दूषित होते. चित्रा 2 बी एक अपूर्ण perfused दिल का एक उदाहरण से पता चलता है जिसमें प्रतिरक्षा कोशिकाओं के 20% intravascular दूषित कर रहे हैं । महत्वपूर्ण बात, संदूषण के इस स्तर मैक्रोफेज और डीसी विश्लेषण पर थोड़ा प्रभाव है, क्योंकि इन कोशिकाओं को शायद ही कभी रक्त में पाए जाते है (चित्रा 2डी) ।
मायोकार्डियम के एक एकल कोशिका निलंबन के प्रवाह cytometry के उपयोग के दिल की छोटी सी आबादी के अध्ययन के लिए अनुमति देता है । उदाहरण के लिए, प्रतिलेखन कारक BATF3 की कमी11कई ऊतकों में परिपक्व CD103+ dc के विकास को रोकने के लिए दिखाया गया है । आदेश में अगर यह भी मायोकार्डियम के मामले में सच है अध्ययन करने के लिए, 8 से कार्डियक कोशिकाओं के एकल सेल निलंबन-15-सप्ताह पुराने BATF3-कमी या नियंत्रण littermates (C57BL/6 पृष्ठभूमि में) प्रवाह cytometry का उपयोग कर विश्लेषण किया गया । कारण छोटी जनसंख्या आकार और मार्करों की संख्या डीसी सबसेट अंतर करने की जरूरत है, प्रोटोकॉल विश्लेषण के लिए पर्याप्त शक्ति प्रदान नहीं किया जा सकता है एक निश्चित जवाब तक पहुंचने के लिए । हालांकि, प्रवाह cytometry विश्लेषण का उपयोग कर मायोकार्डियम की प्रतिरक्षा कोशिकाओं की तुलना करने के लिए जंगली प्रकार बनाम एकBatf3-/- चूहों, CD103 की कमी+ dc उत्तरार्द्ध में पुष्टि की जा सकती (चित्रा 3ए और बी). इसके अलावा, हमने देखा है कि BATF3-कमी काफी अंय कार्डियक आबादी की संरचना में परिवर्तन नहीं किया (चित्रा 3सी और डी) । इन परिणामों उदाहरण देना संवेदनशीलता की डिग्री है कि एंजाइमी और यांत्रिक पाचन की इस संयुक्त विधि का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है एक एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए ।
चित्रा 1 : कार्डियक मैक्रोफेज और dc के लिए गेटिंग कार्यनीति । C57BL/6 चूहों से पृथक दिलों को वर्णित के रूप में पचा रहे थे, और एक सेल निलंबन प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया गया था । (क) CD45 + जी स्वेटर कार्डियक कोशिकाओं का गेटिंग. हृदय एकल कोशिका homogenate से प्रतिरक्षा कोशिकाओं की पहचान करने के लिए CD45 लेबलिंग का उपयोग करें, जिसमें गैर-प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बहुत उच्च स्तर (यानी, cardiomyocytes, endothelial कोशिकाओं और fibroblasts) शामिल हैं. ssc-h vs ssc-a after FSC-h vs FSC-a से तुलना करके दोहरी को बहिष्कृत कर दें । नोट: एसएससी-ए, एसएससी-एच और एसएससी-डब्ल्यू या FSC-ए, FSC-एच और FSC-डब्ल्यू के बीच किसी भी अन्य तुलना इसी तरह उपयोगी हैं । लाइव कोशिकाओं का चयन बहुत छोटी कोशिकाओं को छोड़कर प्रदर्शन किया जा सकता है (एसएससी-एच बनाम FSC-एच गेट). (ख) मृत कोशिका अपवर्जन की तुलना आकार बनाम व्यवहार्यता धुंधला (DAPI) का उपयोग कर । (ग) कार्डियक मैक्रोफेज (CD11b+ CD64+ कोशिकाओं) और dc (CD64- MHC-IIhi CD11c+) की पहचान के लिए गेटिंग कार्यनीति । कार्डियक मैक्रोफेज को MHC-II और CD11c की उनकी अभिव्यक्ति के आधार पर आगे वर्गीकृत किया जा सकता है । कार्डियक dc CD103 या CD11b की उनकी अभिव्यक्ति के आधार पर उपविभाजित किया जा सकता है. (घ) DAPI और डीसी के भीतर के प्रतिनिधि भूखंड छोटे आकार अपवर्जन के बाद डिब्बों । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2 : intravascular कोशिकाओं के संदूषण ्र । (क) एंटी-monocytes CD45 स्वास्थ्यकर्मी (लाल) या गैर-स्वास्थ्यकर्मी (नीला) चूहों में रक्त न्यूट्रोफिल और Ly6Chi एंटीबॉडी के intravascular CD45 ्र की तुलना. (ख) intravascular CD45 ्र द्वारा हृदय की तैयारी में intravascular संदूषणों की पहचान । (ग) रोधगलन और intravascular कोशिकाओं के प्रतिनिधि प्रवाह भूखंड । (घ) एंटी CD45 i.v. प्रशासन के बाद मैक्रोफेज और डीसी डिब्बों के भीतर बला कोशिकाओं के प्रतिनिधि भूखंड. ध्यान दें कि मैक्रोफेज और dc विशेष रूप से extravascular हैं । Intravascular संदूषण आमतौर पर लिम्फोसाइटों, monocytes और न्यूट्रोफिल2होते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3 : BATF3 की कमी वाले चूहों में कार्डियक मैक्रोफेज और dc की ठहराव. (क) Batf3+/+ और Batf3-/- चूहों में कार्डियक dc के प्रतिनिधि प्रवाह भूखंड. (ख) Batf3+/+ और Batf3-/- चूहों में कार्डियक dc का ठहराव । Batf3-/- चूहों में CD103+ dc की अनुपस्थिति नोट करें । (ग और घ) ठहराव कार्डियक मैक्रोफेज (MF) के Batf3+/+ और Batf3-/- चूहों में । त्रुटि पट्टियों का प्रतिनिधित्व SEM. Red प्रतीकों व्यक्तिगत जानवरों का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
रोधगलन, या मायोकार्डिटिस, सबसे हृदय रोगों की एक विशेषता है । हालांकि, मायोकार्डियम गैर रोग राज्यों में अपने स्वयं के प्रतिरक्षा घटकों से रहित नहीं है । स्थिर राज्य के दौरान, कई प्रतिरक्षा कोशिकाओं मायोकार्डियम में रहते हैं और रखरखाव और संरक्षण के लिए आवश्यक भूमिका निभाते हैं । कोशिकाओं के इन विविध आबादियों के लक्षण वर्णन ऐसे इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत एक के रूप में तरीकों के बिना संभव नहीं होता ।
मायोकार्डियम के यांत्रिक और एंजाइमी पाचन का एक संयोजन एक सेल निलंबन है कि विश्लेषण के अंय तरीकों के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है के अलगाव की अनुमति देता है, ऐसे प्रवाह cytometry या immunomagnetic मनका अलगाव के रूप में । वर्तमान विधि के बारे में कई विचार ध्यान में रखा जाना चाहिए । सबसे पहले, हमारे विश्लेषण के सभी मायोकार्डियम के भीतर आबादी को देखें; हम अपने विश्लेषण से atria बाहर के रूप में इन अपने idiosyncrasies के साथ विशेष ऊतकों हैं । दूसरा, इस्तेमाल किया एंजाइमों की मात्रा गतिविधि इकाइयों के रूप में व्यक्त की सेट में मदद करने के लिए अंय स्रोतों से एंजाइमों का उपयोग कर पचा रहे हैं । हालांकि, एंजाइमों के अंतिम एकाग्रता के empiric अनुकूलन और पाचन के समय अत्यधिक की सिफारिश की है, एंजाइम सीमित कोशिका उपज को कम कर सकते हैं और बहुत ज्यादा पाचन व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकते हैं के रूप में. तीसरा, वैकल्पिक लेबल वाले एंटीबॉडी के intravascular प्रशासन को शामिल कदम विशेष रूप से सिफारिश की है जब सामांय मायोकार्डियम में असामांय आबादी का अध्ययन (जैसे लिम्फोसाइटों, monocytes या न्यूट्रोफिल के रूप में)2 या परिस्थितियों में जब रक्त में आबादी की संख्या (monocytosis, granulocytosis या lymphocytosis) जो मायोकार्डियम कि इस विधि का उपयोग करने की पुष्टि की जरूरत है या, वैकल्पिक रूप से, माइक्रोस्कोपी के भीतर परिवर्तन की एक झूठी छाप दे सकता है बदल सकते हैं । हालांकि, मैक्रोफेज या परिपक्व dc का विश्लेषण करते समय यह चरण सीमित उपयोगिता का है, क्योंकि ये कोशिकाएं बहुत कम मात्रा में रक्त (चित्रा 2D) में पाई जाती हैं । यह एंटीबॉडी की मात्रा का अनुकूलन महत्वपूर्ण है और माउस त्याग से पहले मशीन समय, के रूप में दीर्घकालिक गर्मी दिल में कुछ एंटीबॉडी प्रसार के लिए अनुमति दे सकते हैं, विशेष रूप से एक सूजन मायोकार्डियम में । अंत में, यह बहुत महत्वपूर्ण है दिल के अलगाव में सावधानीपूर्वक, प्रमुख धमनियों, नसों और या फेफड़ों के रूप में किसी भी अंय ऊतक के अवशेष को नष्ट करने । इन contaminant ऊतकों प्रतिरक्षा कोशिकाओं है कि आसानी से रोधगलन स्वदेशी आबादी मुखौटा कर सकते हैं की अत्यधिक ऊंचा संख्या है ।
यह बहुत मृत कोशिकाओं के अपवर्जन प्रदर्शन महत्वपूर्ण है, कि क्या व्यवहार्यता रंजक का उपयोग या प्रवाह cytometry विश्लेषण के दौरान छोटे आकार अपवर्जन के माध्यम से, पाचन के रूप में (या रोग के मॉडल में ऊतक क्षति) मृत कोशिकाओं की एक अपेक्षाकृत बड़ी राशि का कारण बन सकता है । हम आकार द्वारा मृत कोशिका अपवर्जन की दक्षता की तुलना में है और एक व्यवहार्यता लेबल का उपयोग कर (चित्रा 1बी और डी), उनके निकट तुल्यता का प्रदर्शन । महत्वपूर्ण रूप से, आकार बहिष्करण निर्धारण और permeabilization के बाद यह प्रक्रिया काफी कक्ष आकार कम कर देता है के बाद उपयोग नहीं किया जा सकता ।
हालांकि autofluorescence शायद ही कभी एक समस्या है कार्डियक मैक्रोफेज की पहचान करने के लिए प्रवाह cytometry का उपयोग कर, यह एक अधिक महत्वपूर्ण समस्या का प्रतिनिधित्व करता है जब कुछ मार्करों की अभिव्यक्ति की विशेषता की कोशिश कर रहा, विशेष रूप से fluorochromes उच्च ऊर्जा से उत्साहित ( कम) प्रकाश तरंग दैर्ध्य (350-500 एनएम) । इन प्रयोगों में, यह अत्यधिक isotype नियंत्रण का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है, नीले और बैंगनी लेजर से बचने (fluorescein isothiocyanate, phycoerythrin, प्रशांत नीले/शानदार वायलेट ४२१) और fluorochromes जैसे ६०० एनएम, ऊपर उत्सर्जन के साथ allophycocyanin का उपयोग करें ।
प्रस्तुत के रूप में प्रोटोकॉल के उपयोग के साथ साथ साहित्य की एक बढ़ती हुई राशि के रूप में अधिक महत्वपूर्ण होते जा रहे है और मूल्यांकन में सूजन की तीव्रता और प्रकार की भूमिका की पहचान है हृदय रोग के परिणामों निस्र्पक । इस विधि प्रोटोकॉल से कक्ष लक्षण वर्णन के उच्च स्तर को अनुमति देता है । उदाहरण के लिए, वंश का उपयोग पता लगाने की अनुमति के लिए अपने क्रमादेशित विभिंन कार्यों2के साथ मैक्रोफेज के विभिंन सबसेट ontogenically की पहचान के लिए । इसी तरह, इस विधि से रोधगलन के दौरान टी सेल प्रतिक्रियाओं का अध्ययन और टी सेल ध्रुवीकरण8अध्ययन करने के लिए पूर्व vivo उत्तेजना के साथ संयुक्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
यह काम (१४८८०८ और १४८७९२) स्वास्थ्य अनुसंधान के कनाडाई संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया था, एसई एक दिल और स्ट्रोक फाउंडेशन, ओंटारियो प्रांतीय कार्यालय, पैसा का मार्च, टेड रोजर्स हार्ट रिसर्च और पीटर मंक के लिए केंद्र से कार्मिक पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था कार्डिएक सेंटर । XCC एक CIHR बंटिंग फेलोशिप रखती है । ला एक दिल और स्ट्रोक/रिचर्ड लेवार छात्र पुरस्कार रखती है ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | Wisent | 311-010-CL | 1x PBS |
| 21 G x 1 1/2 (0.8 mm x 40 mm) PrecisionGlide Needle | BD | 305167 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Wisent | 311-511-CL | 1x HBSS |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503-50G | |
| Bovine serum | Sigma | B9433 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid | BioShop | EDT111 | |
| Vacuum filter , 0.2 µm Filtropur V50 | Sarstedt | 83.1823.001 | |
| 28 G 1/2 1 cc insulin syringe | BD | 329424 | |
| 60 mL syringe | BD | 309653 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Wisent | 319-005-CL | 1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | from Clostridium histolyticum |
| Hyaluronidase type I-S | Sigma | H3506 | |
| DNase-I | Sigma | D4513 | from bovine pancreas |
| Cell strainer, 40 µm Nylon | Falcon | 352340 | |
| Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer | Lonza | 10-546E | |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b | Biolegend | 101222 | 1:250 dilution |
| APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c | Biolegend | 128025 | 1:250 dilution |
| APC anti-mouse CD103 | Biolegend | 121414 | 1:250 dilution |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c | Biolegend | 117334 | 1:250 dilution |
| PE anti-mouse Ly-6G | Biolegend | 127607 | 1:250 dilution |
| Pacific Blue anti-mouse I-Ab | Biolegend | 116422 | 1:250 dilution |
| FITC anti-mouse CD64 (FcgRI) | Biolegend | 139315 | 1:250 dilution |
| PE/Cy7 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103113 | 1:250 dilution |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103132 | 1:40 dilution |
| TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| True-Stain Monocyte Blocker | Biolegend | 426101 | 1:20 dilution |
| FlowJo V10 | TreeStar Inc | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
| Mouse: Batf3-/- | The Jackson Laboratory | JAX: 013755 |
References
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