Summary
Dieses Protokoll stellt eine einfache und effiziente Methode, um zu isolieren, Identifikation und Quantifizierung von Immunzellen, die ihren Wohnsitz im Myokard von Mäusen im Steady-State oder Entzündungen. Das Protokoll kombiniert mechanische und enzymatische Verdauung zur Erzeugung einer einzelnen Zelle Suspension, die weiter durch Durchflusszytometrie analysiert werden können.
Abstract
Das Immunsystem ist ein wesentlicher Bestandteil eines gesunden Herzens. Der Herzmuskel ist Heimat einer reichen Bevölkerung von verschiedenen Immunzellen Teilmengen mit funktionaler Aufteilung bei Steady-State und bei verschiedenen Formen von Entzündungen. Bis vor kurzem das Studium der Immunzellen im Herzen erforderte den Einsatz der Mikroskopie oder schlecht entwickelte Verdauung Protokolle, genügend Sensibilität während einer schweren Entzündung aber konnten nicht sicher identifizieren kleine-aber wichtige-Populationen von Zellen im Steady-State. Hier diskutieren wir eine einfache Methode kombinieren enzymatische (Kollagenase, Hyaluronidase und DNAse) und mechanische Verdauung der murinen Herzen vorangestellt intravaskulärer Verabreichung von eindringmittel radioaktiv markierten Antikörper gegen kleine unterscheiden aber unvermeidbar intravaskulären Zelle Verunreinigungen. Diese Methode erzeugt eine Aussetzung der isolierten lebensfähige Zellen, die durch Durchflusszytometrie zur Identifikation, Phänotypisierung und Quantifizierung analysiert oder weiter gereinigt mit Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung oder magnetischer Wulst Trennung für werden können transkriptionelle Analyse oder in-vitro- Studien. Wir sind ein Beispiel für eine schrittweise durchflusszytometrischen Analyse der wichtigsten Makrophagen und dendritischen Zellpopulationen des Herzens zu unterscheiden. Für eine mittlere Größe Experiment (10 Herzen) erfordert der Abschluss des Verfahrens 2 – 3 h.
Introduction
Verschiedene Formen der myokardialen Stress oder Verletzungen, einschließlich ischämische (Ischämie Reperfusion oder Myokardinfarkt) und nicht-ischämische (Hypertonie oder Myokarditis), fördern die Einstellung von Entzündungszellen mit reparative und schützend, sondern auch pathogenen Eigenschaften. Bereits im Jahr 1891, beschrieben Romberg erstmals das Vorhandensein von zellulären Infiltrate im Herzmuskel von Patienten mit Typhus und Scharlach1. Jedoch erforderlich der Detailstudie des kardialen Immunzellen die Entwicklung von fortgeschrittenen Immunphänotypisierung Techniken. Infolgedessen haben wir erst vor kurzem begonnen zu verstehen, dass eine vielfältige Bevölkerung von Immunzellen mit notwendigen Wartungs-Rollen während der Steady-State innerhalb der Herzmuskel befindet.
Histologie wurde und immer noch ist, die am häufigsten verwendete Methode, kardiale Immunzellen während einer Entzündung zu charakterisieren. Während Histologie ein wertvolles diagnostisches Instrument darstellt, hat seine Verwendung in der Studie von kardialen Immunzellen jedoch wichtige Einschränkungen. Die Immunzellen mit Wohnsitz im Myokard stellen einen sehr kleinen Teil der gesamten Zellen und sind mehr oder weniger gleichmäßig verteilt in einem verhältnismäßig großen Raum. Ähnlich, zeigen verschiedene Formen der kardialen Entzündung, wie virale Myokarditis, fokale Muster der Entzündung. Dies bedeutet, dass die genaue Analyse des Immunsystems des Herzens erfordern oft höhere Grade der histologischen Probenahme, Erhöhung der Kosten um Verzerrungen zu reduzieren. Darüber hinaus bietet die Histologie eine sehr begrenzte Menge von brauchbaren Informationen in Zelle Identifikation (z.B. Anzahl der Parameter). Mit einer ständig wachsenden Zahl der Zelle Teilmengen, die mehrere Ausdruck Marker (einschließlich oberflächenmarker, Transkriptionsfaktoren oder abgesondert Moleküle) erfordert, hat sich Durchflusszytometrie als das mächtigste Werkzeug für die Immunphänotypisierung etabliert, aufgrund der Low-Cost und hohem Durchsatz.
Die Immunphänotypisierung Techniken richtet sich eng an der Entwicklung von effizienten Verdauung-Protokolle, die für einzelne Zellen Analyse einer großen Anzahl von Zellen erlaubt. Die Entwicklung der ausführliche Protokolle der Zelle Extraktion eröffnet ein neues Fenster der Möglichkeiten in der Studie von kardialen Immunologie. Durch die Kombination von Verdauung, Durchflusszytometrie und Transkriptom wurden die großen Populationen von Makrophagen und dendritischen Zellen, die ihren Wohnsitz im Herzen zeichnet sich2,3. Die am häufigsten vorkommende Bevölkerung von kardialen Immunzellen im Steady-State sind CD64++ MerTK Makrophagen, die weiter unterteilt werden können, basierend auf ihren Ausdruck CCR2 oder CD11c2. CCR2+ Makrophagen stammen aus Erwachsenen Knochenmark Hämatopoese, während die Mehrheit des CCR2– Makrophagen, die hohe oder niedrige Niveaus des MHC-II zum Ausdruck bringen können, sind vor allem pränatalen Ursprungs. Makrophagen führen Sie wichtige Funktionen wie Reparatur4 und Entfernung von Schmutz5 bei Verletzungen oder elektrische Verbindungstechnik6 im Steady-State zu unterstützen. Während verschiedene Formen von Entzündungen ein wichtige Zustrom von Ly6CHallo MHC-IIlo CD64Int Monozyten auftreten, zu unterscheiden, die später in Ly6CHallo CCR2+ Makrophagen2,7 . Eine deutlich kleinere, aber wichtige Population von Zellen, die ihren Wohnsitz im Myokard von gesunden Personen besteht aus dendritischen Zellen8,9. Die zwei großen Teilmengen von kardialen herkömmlichen DCs (cDCs) wurden vor kurzem charakterisiert: cDC1 (CD103+ DCs) und cDC2 (CD11b+ DCs). DCs eine wichtige Rolle in der Verteidigung gegen Infektion8 aber auch Selbstverletzung während einer Entzündung, besonders bei Myokardinfarkt9fördern können.
Hier beschreiben wir eine einfache Methode zur Isolierung von lebensfähigen kardiale Immunzellen aus Maus Myokard. Die Methode kombiniert mechanische und enzymatische Verdauung mit Zelle-Sieb Filtration um eine einzelne Zelle Suspension zu erhalten, die analysiert oder durch Flow Cytometry sortieren oder magnetischer Wulst Bereicherung weiter gereinigt werden können. Genaue Messungen der extravascular Herzmuskelzellen erfordern kardialen Durchblutung um mögliche Verunreinigungen aus dem Blutkreislauf der kardiologische Microvasculature zu entfernen. Darüber hinaus präsentieren wir Ihnen einen optionalen Schritt des intravaskulären Kennzeichnung von Immunzellen, die verwendet werden, um weitere Herzmuskelzellen intravaskulären Verunreinigungen, basierend auf der Galkina Et Al. Protokoll10unterscheiden. Schließlich präsentieren wir eine grundlegende Flow Cytometry Analyse Ermittlung die wichtigsten Subpopulationen von Makrophagen und cDC.
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Protocol
Ethik-Anweisung: Dieses Protokoll wurde überprüft und genehmigt Animal Care auf vom Ausschuss des University Health Network (Toronto, Kanada) und ist in Übereinstimmung mit dem Canadian Council on Animal Care.
1. Puffer Vorbereitung
- HBB Puffer (Hank es ausgewogen Salz Lösung (HBSS), 2 % Hitze inaktiviert Rinderserum, 0,2 % Rinderserumalbumin) vorzubereiten. Fügen Sie 10 mL Hitze Rinderserum und 1 g Rinderserumalbumin, 500 mL HBSS inaktiviert. Filter durch einen 0,2 µm-Filter zu sterilisieren und Lagerung bei 4 ° C.
- Bereiten Sie FACS-Puffer (Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), 2 % Hitze inaktiviert Rinderserum, 1 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA, pH 8,0)). Fügen Sie 10 mL Hitze Rinderserum und 1 mL 0,5 M EDTA bis 500 mL PBS inaktiviert. Filter durch einen 0,2 µm-Filter zu sterilisieren und Lagerung bei 4 ° C.
Hinweis: Lösungen können bei 4 ° C bis zu 1 Monat aufbewahrt werden.
(2) Kennzeichnung des zirkulierenden Leukozyten
- Aseptisch bereiten Sie Anti-Maus CD45 Injektion mit 1 µg des Antikörpers in sterilen Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) für eine endgültige Injektionsvolumen von 200 µL/Maus verdünnt. Ladevolumen in eine 28,5 G Insulin Spritze und Licht fernhalten.
Hinweis: Verwenden Sie zwei verschiedene Fluorochrom-markierte Anti-CD45 Antikörper um den intravaskulären (gefärbt durch intravenöse Verabreichung) Die intrakardiale Färbung unterscheiden (gebeizt nach der Verdauung, siehe Schritt 4). -
Wärmen Sie indem man die Rute zu einer roten Wärmelampe für 5 min es Mäuse (8 – 12 Wochen alt vor).
Achtung: Überhitzen Sie das Tier nicht. Halten Sie die Lampe in einem sicheren Abstand (> 30 cm).- Zurückhalten Sie das Tier in der sternalen Position mithilfe eines entsprechenden Geräts. Setzen Sie aus und stabilisieren Sie das Heck mit der nichtdominanten Hand durch Immobilisierung der Schwanzwurzel mit den Zeige- und Mittelfinger und der Mitte distalen Region der Schwanz mit Daumen und Ringfinger.
Achtung: Beziehen Sie zuviel Kraft an der Spitze der Rute nicht, wie die Haut abgezogen werden kann. Stechen Sie die Nadel mit der Fase nach oben in die Vene. Halten Sie die Nadel parallel zu der Vene zu allen Zeiten, da es leicht zu durchstechen die Vene.
Hinweis: Blut in die Spritze gelangen können auftreten und ist ein Zeichen für eine gute Injektion. Biegen die Nadel in einem Winkel von 90° kann intravenös zu verabreichenden Verwaltung erleichtern. Bestätigen Sie mit Ihrer Sicherheit Büro wie Biege Nadeln eine Gefahr darstellen können. - Injizieren Sie 200 µL intravenös in die Rute Vene. Die Flüssigkeit sollte leicht fließen und deaktivieren Sie vorübergehend die Vene.
Achtung: Nicht mit Gewalt Flüssigkeit im Widerstand erfüllt ist. Dies ist Zeichen für Abhandenkommen der Nadel. - Lassen Sie Antikörper für 5 min vor menschlich euthanizing Maus zirkulieren.
- Zurückhalten Sie das Tier in der sternalen Position mithilfe eines entsprechenden Geräts. Setzen Sie aus und stabilisieren Sie das Heck mit der nichtdominanten Hand durch Immobilisierung der Schwanzwurzel mit den Zeige- und Mittelfinger und der Mitte distalen Region der Schwanz mit Daumen und Ringfinger.
3. Herz zu isolieren und die Verdauung
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Mäuse mit CO2 einschläfern oder durch andere Verfahren institutionell anerkannte Euthanasie.
- Platzieren Sie für CO2 Euthanasie den Mauszeiger in der CO2 -Kammer und die Füllrate auf 20 % des kammervolumens pro Minute (d. h., wenn die Kammer 10 L, Füllung bei 2 L/min). Führen Sie für 2 min und Monitor Maus bis Atmung aufgehört hat.
- Schalten Sie die CO2 und lassen Sie die Maus für eine zusätzliche 1-2 min. sicher atmen aufgehört hat, vor dem Öffnen der Kammers und führen ein Zeh Kneifen um zu bestätigen, dass die Maus tot bevor Sie mit die Maus zu verarbeiten ist.
- Sprühen Sie die Maus mit 70 % Ethanol. Heben Sie die Haut am Bauch und sezieren Sie die Maus durch Schnitt entlang der ventralen Mittellinie Anfang auf der Ebene von der Hüfte bis zum Brustbein. Öffnen Sie den Bauch und bewegen Sie die Leber, das Zwerchfell verfügbar zu machen.
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Schneiden Sie die Membran dann die Rippen auf beiden Seiten der Mittellinie, wobei Sie darauf achten, um zu vermeiden, Punktion, Lunge und Herz.
- Expose das Herz durch Peeling damals die Rippen, schneiden zuerst die linken Vorhöfen gefolgt von den rechten Herzvorhof.
Achtung: Seien Sie vorsichtig beim Schneiden die Vorhöfe, sicherzustellen, dass keine Arterien oder Venen verletzt werden, da dies die Effizienz der Spülung des Blutes in die Organe enthalten verringern kann. - Durchspülen Sie das Herz mit 15 – 20 mL kaltem PBS mit einer 60 mL-Spritze mit einer Nadel 21 G ausgestattet und kaltem PBS. Vorsichtig fassen Sie die Basis des Herzens mit der Zange und Stechen Sie die Nadel in die linke Herzkammer in der Nähe der Spitze. Wiederholen Sie den Vorgang in der rechten Herzkammer. Eine korrekte Injektion führt zu weißen Lunge und Leber blass.
Hinweis: Perfusion sollte durchgeführt werden innerhalb von 5 Minuten nach Sterbehilfe zur Vermeidung Blutgerinnung, die die Organe des Interesses mit zirkulierenden Zellen verunreinigen können.
- Expose das Herz durch Peeling damals die Rippen, schneiden zuerst die linken Vorhöfen gefolgt von den rechten Herzvorhof.
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Halten Sie die Basis des Herzens mit der Pinzette und sanft hochziehen Sie das Herz, dann lösen Sie mitten durch Schneiden die großen Lungenarterien und Venen, Aorta und der Herzbeutel Plünderung zu.
- Das Herz sanft halten das Herz zwischen Daumen und Zeigefinger in einem sauberen fusselfreien Papiertuch zu reinigen und die Vorhöfe und die Reste der großen Arterien und Venen und andere Verunreinigungen mit einer Pinzette abziehen.
Hinweis: Stellen Sie sicher die Gesamtheit der Vorhöfe wird entfernt und keine andere Gewebe wie die Lunge oder Blutgefäße, vorhanden sind, da diese Gewebe ihre eigenen Wohnsitz Immunzellen haben. Die Lunge hat insbesondere eine großen Immunzelle Bevölkerung, die die kleinere Populationen innerhalb der Herzmuskel überdecken kann.
- Das Herz sanft halten das Herz zwischen Daumen und Zeigefinger in einem sauberen fusselfreien Papiertuch zu reinigen und die Vorhöfe und die Reste der großen Arterien und Venen und andere Verunreinigungen mit einer Pinzette abziehen.
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Legen Sie das Herz in einer 5 cm Plastikschale mit 50 µL kaltem PBS.
- Hacken Sie die Herzen mit gebogenen sezierenden Schere bis gibt es keine sichtbaren Stücke und es eine weiche Konsistenz hat.
Hinweis: Versuchen Sie, das Herz in einem geschlossenen Bereich der Schale zu halten, beim Häckseln um Gewebeverlust zu minimieren. - Thetrituratedheart Gewebe mit gebogenen Pinzette in 2 mL Microcentrifuge Schlauch mit 800 µL kalter Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM) zu übertragen.
- Hacken Sie die Herzen mit gebogenen sezierenden Schere bis gibt es keine sichtbaren Stücke und es eine weiche Konsistenz hat.
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Hinzufügen von 450 U/mL Ofcollagenase I, 60 U/mL von Hyaluronidase Typ I-S und 60 U/mL der DNase-ich zu jeder Probe.
- Inkubieren Sie Proben bei 37 ° C auf einen rockigen Shaker bei 50 u/min für 45 – 60 min.
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Nach der Verdauung, kurz Wirbel Proben (20 s) und sofort auf Eis, Proben bei 4 ° c zu halten
- Mit Hilfe einer 1 mL-Pipette, pipette Proben rauf und runter bis Gewebeproben homogen sind und die PIPETTENSPITZE nicht verstopfen.
Hinweis: Definieren eine bestimmte Anzahl von Wiederholungen, pipette kann Reproduzierbarkeit erhöhen. Wenn das Herz nicht optimal verdaut werden, können Teile des Myokard die Pipette behindern. Die PIPETTENSPITZE gegen den Microcentrifuge Schlauch vorsichtig Schleifen hilft, größere Stücke des Gewebes zu homogenisieren.
- Mit Hilfe einer 1 mL-Pipette, pipette Proben rauf und runter bis Gewebeproben homogen sind und die PIPETTENSPITZE nicht verstopfen.
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Vornässen Sie 40 µm Zelle Sieb auf ein 50 mL konische Röhrchen mit 1 mL kalte HBB gelegt.
- Der Filter homogenisierten Probe hinzu und langsam gießen 12 – 14 mL kalte HBB durch Waschen.
- Gefilterten Proben auf einem gekennzeichneten 15 mL konische Rohr übertragen und bei 4 ° c halten
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Zentrifuge Proben bei 400 X g für 5 min bei 4 ° C. Aspirieren Sie überstand.
- Lyse von Erythrozyten durch Zugabe von 1 mL der Ammonium-Chlorid-Kalium (ACK) Lysis Puffer für jede Probe. Aufschwemmen Sie Proben durch aufschütteln und in 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Wenn Lyse abgeschlossen ist, fügen Sie 5 – 8 mL des kalten Hank ausgewogen Salz Lösung (HBSS), Hämolyse zu stoppen.
- Zentrifugieren Sie Proben auf 400 X Gfor 5 min bei 4 ° C. Aspirieren Sie überstand.
- Fügen Sie 1 mL der FACS-Puffer zu jeder Probe und Transfer zu einem gekennzeichneten 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.
Hinweis: Das Protokoll kann hier bis zu 2 h mit Proben bei 4 ° c gelagert pausiert werden
(4) flow Cytometry Färbung und Analyse
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Zentrifuge Proben bei 400 X g für 5 min bei 4 ° C.
- Um unspezifische Antikörperbindung zu reduzieren, zu verdünnen, 1: 100 Anti-CD16/CD32 und Monocyte-Blocker (01:20) (siehe Tabelle der Materialien) Bilanzierung von 50 µL FACS pro Probe. Bei Raumtemperatur für 15 min inkubieren.
- Bereiten Sie den Antikörper-Verdünnung (1: 250 für jeden Antikörper) entfielen 50 µL FACS pro Probe.
Hinweis: Ein Lebensfähigkeit Farbstoff kann in der Antikörper cocktail aufgenommen werden, um abgestorbene Zellen auszuschließen. Alternativ kann die geringe Größe Ausschluss durch Flow-Analyse verwendet (Abbildung 1C und D). - Ohne Waschen, fügen Sie 50 µL Antikörper-master-Mix zu jeder Probe und mischen.
- Inkubieren Sie Proben bei 4 ° C für 30 Minuten im Dunkeln.
- Jede Probe zu waschen und Zentrifugieren Sie Proben bei 400 X g für 5 min bei 4 ° c fügen Sie 600 µL FACS hinzu
- Aspirieren Sie überstand und aufzuwirbeln Sie Pellet in 300 µL FACS. Halten Sie Proben bei 4 ° C im Dunkeln.
Hinweis: Einige Lebensfähigkeit Farbstoffe, wie z. B. DAPI, erfordern Färbung innerhalb von 10 min vor dem Ausführen der Durchflusszytometrie. - Analysieren von Durchflusszytometrie (siehe Abbildungen 1 und 2) innerhalb der nächsten 3 h. Wenn eine längere Zeit erforderlich, kurzfristigen Fixierung mit einer niedrigen Konzentration Paraformaldehyd ist (0,5 – 1 % mit PBS-Puffer) wird empfohlen, die Färbung zu erhalten.
Hinweis: Es wird empfohlen, um Proben durch ein 40 µm Zelle Sieb vor initiieren Flow Cytometry Analyse zu filtern, zur Vermeidung von Verstopfung der Fluidik das Durchflusszytometer.
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Representative Results
Bislang wurde keine gute Methode entwickelt, um Immunzellen von anderen Herzmuskelzellen Bestandteilen, wie Kardiomyozyten zu isolieren. Daher erfordert eine Analyse der einzelnen Herzmuskelzellen Suspension durch Durchflusszytometrie Pre Anspritzung mit CD45, die immun Zellpopulationen, gefolgt von Einzelzellen und geringen Größe Ausgrenzung gating (Abb. 1A) zu identifizieren. Alternativ kann eine Lebensfähigkeit Färbung durchgeführt werden, um abgestorbene Zellen auszuschließen. Geringen Größe Ausgrenzung und Lebensfähigkeit Farbstoff Färbung repräsentieren fast gleichwertige Methoden, abgestorbenen Zellen (Abbildung 1B und 1D) auszuschließen. Es wird dringend empfohlen, mit dem Antikörper Färbung bald nach der Verdauung Verfahren vorgehen und immer die Zellsuspension bei 4 ° C, da die Lebensfähigkeit der Zellen zerfallen kann. Dieses Verfahren liefert in der Regel etwa 80 – 90 % der lebensfähigen Immunzellen.
Das Myokard beherbergt eine vielfältige Kolonie von Immunzellen, von denen viele noch ausstehende Identifizierung und Charakterisierung sind. Makrophagen, identifiziert als CD64+ Zellen, sind die wichtigsten immun Bevölkerung des Herzens, 60 – 70 % aller Immunzellen (Abbildung 1C, oben) vertreten. Die Verdauung eines Erwachsenen murinen Herzens ergibt über 3 – 5 x 104 Makrophagen, abhängig von Größe des Herzens. Kardiale Makrophagen können weiter unterteilt werden, basierend auf ihren Ausdruck von CD11c oder CCR2 und ihre Ebenen des MHC-II-2.
Die anderen kardialen immun Subpopulation, die gut gekennzeichnet worden sind konventionellen dendritischen Zellen. Konventionelle DCs sind CD64– Zellen, dass ausdrückliche Mittelstufe, hohes Maß an MHC-II und hohe CD11c (Abbildung 1 C, unten). Diese Zellen können weiter unterteilt werden, basierend auf ihren Ausdruck von CD103 oder CD11b8,9. DCs darstellen eine viel kleineren kardiale Subpopulation im Vergleich zu Makrophagen. Die Verdauung eines Erwachsenen murinen Herzens ergibt sich zwischen 150 und 500 DCs jede Teilmenge.
Durchblutung des Herzens mit kaltem PBS ist unerlässlich beim Identifizieren von immun-Zell-Populationen innerhalb der Herzmuskel. Unvollkommene Perfusion kann jedoch die Beträge des intravaskulären Verunreinigungen in den Proben, führt zu wichtigen Voreingenommenheit, die auf periphere Veränderungen (Blut) stützen kann erhöhen, anstatt Änderungen in der kardialen Infiltrate. In diesen Fällen helfen intravaskulären Verwaltung von Leuchtstofflampen radioaktiv markierten Anti-CD45-Antikörpern, die alle Immunzellen zirkulieren durch Makro- und Microvasculature (Abb. 2A) Etiketten, Herzmuskelzellen aus unterscheiden intravaskulären Verunreinigungen. Abbildung 2 B zeigt ein Beispiel für eine unvollkommen PERFUNDIERTEN Herzen in dem 20 % der Immunzellen intravaskulären Verunreinigungen sind. Wichtig ist, hat dieses Maß an Verschmutzung wenig Einfluss auf Makrophagen und DC-Analyse, da diese Zellen im Blut (Abbildung 2D) selten zu finden sind.
Die Verwendung der Durchflusszytometrie aus einer einzigen Zelle Suspension von Myokard ermöglicht die Studie von der kleinen Subpopulationen des Herzens. Z. B. der Mangel des Transkriptionsfaktors BATF3 nachweislich zu verhindern, dass die Entwicklung der Reifen CD103+ DCs in verschiedenen Geweben11. Um zu studieren, wenn dies auch im Falle der Herzmuskel gilt, wurden einzelne Zellsuspensionen von Herzzellen von 8 – 15 Wochen alten BATF3-defizienten oder Kontrolle wurfgeschwistern (im Hintergrund der C57BL/6) mit Durchflusszytometrie analysiert. Aufgrund der kleinen Bevölkerungsgröße und Anzahl der Marker benötigt, um die DC-Teilmengen zu unterscheiden Histologie konnte nicht genügend Strom für die Analyse, eine definitive Antwort zu erreichen zur Verfügung gestellt haben. Jedoch verwenden Flow Cytometry Analyse vergleichen die Immunzellen des Myokard von Wildtyp-im Vergleich zu einer Batf3- / - Mäuse, ein Mangel an CD103+ DCs kann bestätigt werden, in der letzteren (Abbildung 3A und B). Darüber hinaus haben wir beobachtet, dass BATF3-Mangel nicht wesentlich, die Zusammensetzung der anderen kardialen Populationen (Abbildung 3C und D ändern). Diese Ergebnisse stehen exemplarisch für den Grad der Sensibilität, die durch diese kombinierte Methode der enzymatischen und mechanische Verdauung zu einem einzigen Zellsuspension erreicht werden kann.
Abbildung 1 : Strategie für kardiale Makrophagen und DCs gating. Isolierte Herzen von C57BL/6 Mäusen wurden verdaut, wie beschrieben, und einzelne Zellsuspension wurde durch Durchflusszytometrie analysiert. (A) Herbeirufung von CD45 + live Singulett Herzzellen. Mit dem CD45 Kennzeichnung Immunzellen aus den einzelnen Herzmuskelzellen Homogenat bestimmt sehr hohes Maß an nicht-immunen Zellen (z.B. Herzzellen, Endothelzellen und Fibroblasten) umfasst. Dubletten ausschließen, indem Sie Vergleich SSC-H Vs SSC-A gefolgt von FSC-H Vs FSC-A. Hinweis: Alle anderen Vergleich zwischen SSC-A, SSC-H und SSC-W oder FSC-A, FSC-H und FSC-W sind ebenso nützlich. Auswahl von lebenden Zellen kann durchgeführt werden, mit Ausnahme von sehr kleinen Zellen (SSC-H Vs FSC-H Tor). (B) Vergleich der Tote Zelle Ausgrenzung mit Größe Vs Lebensfähigkeit Färbung (DAPI). (C) Strategie zur Identifikation von kardialen Makrophagen Gating (CD11b+ CD64+ Zellen) und DCs (CD64– MHC-IIHallo CD11c+). Kardiale Makrophagen können weiter klassifiziert werden, basierend auf ihrer Expression von MHC-II und CD11c. kardiale DCs können unterteilt werden basierend auf ihren Ausdruck von CD103 oder CD11b. (D) repräsentative Grundstücke DAPI + tote Zellen innerhalb der Makrophagen und DC Fächer nach klein-Ausschluss. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Kennzeichnung von intravaskulären Zellen Kontaminanten. (A) Vergleich der intravaskulären CD45 Kennzeichnung von Blut neutrophile und Ly6CHallo Monozyten in Anti-CD45 Antikörper (rot) behandelt oder nicht behandelt (blau) Mäuse. (B) Kennung des intravaskulären Verunreinigungen in einer kardialen Zubereitung von intravaskulären CD45 Kennzeichnung. (C) repräsentative Fluss Grundstücke der myokardialen und intravaskulären Zellen. (D) repräsentative Grundstücke von markierten Zellen innerhalb der Makrophagen und DC Fächer nach Anti-CD45 i.v. Gabe. Beachten Sie, dass Makrophagen und DCs ausschließlich extravascular sind. Intravaskulären Schadstoffe sind in der Regel Lymphozyten, Monozyten und neutrophile2. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Quantifizierung der kardialen Makrophagen und DCs BATF3-defizienten Mäusen. (A) repräsentative Fluss Grundstücke kardiale DCs in Batf3+ / + und Batf3- / - Mäusen. (B) Quantifizierung der kardialen DCs in Batf3+ / + und Batf3- / - Mäusen. Beachten Sie das Fehlen von CD103+ DCs Batf3- / - Mäusen. (C und D) Quantifizierung der kardialen Makrophagen (MF) in Batf3+ / + und Batf3- / - Mäusen. Fehlerbalken darzustellen SEM rote Symbole repräsentieren einzelne Tiere. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Myokardiale Entzündung oder Herzmuskelentzündung (Myokarditis), ist ein Merkmal der meisten Herz-Kreislauf-Krankheiten. Der Herzmuskel ist jedoch nicht frei von eigener immun Komponenten in Krankheitszuständen. Im Steady-State viele Immunzellen befinden sich im Myokard und spielen die wesentliche Rolle der Wartung und Schutz. Die Charakterisierung dieser vielfältigen Populationen von Zellen wäre nicht möglich ohne Methoden wie dem präsentiert in diesem Protokoll gewesen.
Eine Kombination aus mechanischen und enzymatische Verdauung von Myokard erlaubt die Isolation einer einzelnen Zelle Suspension, die in Kombination mit anderen Methoden der Analyse, wie Flow Cytometry oder Immunomagnetic Wulst Isolation verwendet werden können. Einige Überlegungen in Bezug auf das vorliegende Verfahren müssen berücksichtigt werden. Zuerst alle unsere Analysen beziehen sich auf die Bevölkerung im Myokard; Wir schließen die Vorhöfe aus unserer Analyse sind spezialisierte Gewebe mit seinen eigenen Besonderheiten. Zweitens werden die Beträge von Enzymen verwendet als Leistungseinheiten, helfen bei der Einrichtung der Verdauung mit Hilfe von Enzymen aus anderen Quellen angegeben. Empirisch-Optimierung Die Endkonzentration von Enzymen und die Zeit der Verdauung ist jedoch dringend empfohlen, da Beschränkung Enzym die Zellausbeute deutlich reduzieren kann und zu viel Verdauung kann drastische Auswirkungen auf Rentabilität. Drittens die optionale Schritt mit intravaskulären Verwaltung der beschriftete Antikörper empfiehlt sich besonders bei ungewöhnliche Populationen in der normalen Myokard (z. B. Lymphozyten, Monozyten und neutrophile)2 oder unter Umständen zu studieren Wann Zahlen der Bevölkerung im Blut können sich ändern (Monocytosis, Granulocytosis oder Lymphozytose) die geben eines falschen Eindruck der Veränderungen in den Herzmuskel, die mit dieser Methode oder alternativ die Mikroskopie bestätigt werden müssen. Allerdings ist dieser Schritt von begrenztem Nutzen, bei der Analyse von Makrophagen oder Reife DCs, da diese Zellen nur selten in erheblichen Mengen im Blut (Abbildung 2D) befinden. Es ist wichtig, die Menge der Antikörper verabreicht zu optimieren und die Inkubationszeit vor Einbußen bei der Maus als langfristige Inkubation können für einige Antikörper-Diffusion in das Herz, besonders in einem entzündeten Herzmuskel. Zu guter Letzt ist es sehr wichtig, sorgfältig in der Isolation des Herzens, Beseitigung der Reste der großen Arterien, Venen oder jedes andere Gewebe wie die Lunge. Diese Verunreinigung Gewebe erhöhte hoch Zahlen von Immunzellen, die leicht die myokardialen indigenen Bevölkerungsgruppen Maske können.
Es ist sehr wichtig, Ausschluss von abgestorbenen Zellen durchzuführen, ob Lebensfähigkeit Farbstoffe verwenden oder durch geringe Größe Ausschluss während Flow Cytometry-Analyse, Verdauung (oder Gewebeschäden in Krankheitsmodellen) kann dazu führen, dass eine relativ große Menge von abgestorbenen Zellen. Wir haben die Effizienz des Toten Zelle Ausgrenzung durch Größe und eine Rentabilität Zeichennutzung (Abbildung 1B und D), gegenüber demonstrieren ihre nahe Äquivalenz. Wichtig ist, kann nicht Größe Ausschluss nach Fixierung und Permeabilisierung verwendet werden, da dieses Verfahren senkt die Zellengröße.
Obwohl Autofluoreszenz selten ein Problem, kardiale Makrophagen mit Durchflusszytometrie zu identifizieren ist, dies noch Wichtigeres stellt ein Problem dar bei dem Versuch, die Expression von einige Marker, vor allem mit Fluorochromes begeistert von hoher Energie (charakterisieren kürzere) Lichtwellenlängen (350 – 500 nm). In diesen Experimenten ist es dringend empfohlen, Isotype Steuerelemente verwenden, vermeiden die blau-violetten Laser (Fluorescein-Herstellung, Phycoerythrin, Pacific Blue/brillant violett 421) und verwenden Fluorochromes mit Emissionen über 600 nm, wie z. B. Allophycocyanin.
Die Verwendung von Protokollen wie die enthaltenen werden immer wichtiger, da eine zunehmende Menge an Literatur ist die Rolle der Intensität und Art der Entzündung bei der Bewertung und Charakterisierung der Ergebnisse des Herz-Kreislauf-Krankheit zu identifizieren. Diese Methode ermöglicht höhere Zelle Charakterisierung als Histologie. Zum Beispiel die Verwendung der Linie Ablaufverfolgung für die Identifizierung von ontogenically verschiedene Teilmengen von Makrophagen mit ihren unterschiedlichen programmierten Funktionen2erlaubt. In ähnlicher Weise kann diese Methode verwendet, um die T-Zell-Reaktionen während einer myokardialen Entzündung zu studieren und mit ex-Vivo Stimulation zur Studie T-Zell Polarisation8kombiniert werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Canadian Institutes of Health Research (148808 und 148792), SE wurde unterstützt durch ein Herz und Stroke Foundation, Personal Award vom Ontario Provincial Office, March of Dimes, Ted Rogers Centre for Heart Research und Peter Munk Herz Zentrum. XCC hält eine CIHR Banting Fellowship. LA hält ein Herz & Schlaganfall/Richard Lewar Zugehörigkeit Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | Wisent | 311-010-CL | 1x PBS |
| 21 G x 1 1/2 (0.8 mm x 40 mm) PrecisionGlide Needle | BD | 305167 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Wisent | 311-511-CL | 1x HBSS |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503-50G | |
| Bovine serum | Sigma | B9433 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid | BioShop | EDT111 | |
| Vacuum filter , 0.2 µm Filtropur V50 | Sarstedt | 83.1823.001 | |
| 28 G 1/2 1 cc insulin syringe | BD | 329424 | |
| 60 mL syringe | BD | 309653 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Wisent | 319-005-CL | 1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | from Clostridium histolyticum |
| Hyaluronidase type I-S | Sigma | H3506 | |
| DNase-I | Sigma | D4513 | from bovine pancreas |
| Cell strainer, 40 µm Nylon | Falcon | 352340 | |
| Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer | Lonza | 10-546E | |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b | Biolegend | 101222 | 1:250 dilution |
| APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c | Biolegend | 128025 | 1:250 dilution |
| APC anti-mouse CD103 | Biolegend | 121414 | 1:250 dilution |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c | Biolegend | 117334 | 1:250 dilution |
| PE anti-mouse Ly-6G | Biolegend | 127607 | 1:250 dilution |
| Pacific Blue anti-mouse I-Ab | Biolegend | 116422 | 1:250 dilution |
| FITC anti-mouse CD64 (FcgRI) | Biolegend | 139315 | 1:250 dilution |
| PE/Cy7 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103113 | 1:250 dilution |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103132 | 1:40 dilution |
| TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| True-Stain Monocyte Blocker | Biolegend | 426101 | 1:20 dilution |
| FlowJo V10 | TreeStar Inc | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
| Mouse: Batf3-/- | The Jackson Laboratory | JAX: 013755 |
References
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