Summary
Dit protocol biedt een eenvoudige en efficiënte methode om te isoleren, te identificeren en te kwantificeren van immune cellen die woonachtig zijn in het myocardium van muizen tijdens steady-state of ontsteking. Het protocol combineert enzymatische en mechanische spijsvertering voor het genereren van een enkel celsuspensie die verder kan worden geanalyseerd door stroom cytometry.
Abstract
Het immuunsysteem is een essentieel onderdeel van een gezond hart. Het myocardium is herbergt een rijke bevolking van verschillende immuun cel subsets met functionele brandcompartimentering zowel tijdens steady-state en tijdens verschillende vormen van ontsteking. Tot voor kort, de studie van immuuncellen in het hart vereist het gebruik van microscopie of slecht ontwikkelde spijsvertering-protocollen, die geboden van voldoende gevoeligheid tijdens ernstige ontsteking maar konden vertrouwen identificeren kleine — maar belangrijke — populaties van cellen tijdens steady-state. Hier bespreken we een eenvoudige methode combineren enzymatische (collagenase, hyaluronidase en DNAse) en mechanische vertering van lymfkliertest harten voorafgegaan door intravasculaire administratie van fluorescently-gelabelde antilichamen tegen kleine onderscheiden maar onvermijdelijke intravasculaire cel contaminanten. Deze methode genereert een suspensie van geïsoleerde levensvatbare cellen die kunnen worden geanalyseerd door stroom cytometry voor identificatie, fenotypering en kwantificering, of verder gezuiverd met fluorescentie-geactiveerde cel sorteren of magnetische kraal scheiding voor transcriptionele analyse of in vitro studies. Wij zijn een voorbeeld van een stapsgewijze flow cytometrische analyse om te onderscheiden van de belangrijkste macrophage en dendritische cel populaties van het hart. Voor een middelgrote formaat experiment (10 harten) vereist de voltooiing van de procedure 2 – 3 h.
Introduction
Verschillende vormen van myocardiale stress of schade, met inbegrip van ischemische (ischemie-reperfusie of myocardinfarct) en niet-ischemische (hypertensie of myocarditis), bevordering van de rekrutering van ontstekingscellen met herstellend en beschermend, maar ook pathogene eigenschappen. Al in 1891, beschreven Romberg eerst de aanwezigheid van cellulaire infiltreert in het myocardium van patiënten geïnfecteerd met tyfus en roodvonk1. De gedetailleerde studie van immuun hartcellen vereist echter de ontwikkeling van meer geavanceerde technieken van de immunophenotyping. Dientengevolge, zijn pas onlangs we begonnen te begrijpen dat een diverse bevolking van immune cellen met essentiële onderhoud rollen tijdens steady-state zich binnen het myocardium bevindt.
Histologie is geweest, en nog steeds is, de meest voorkomende methode te karakteriseren immuun hartcellen tijdens ontsteking. Terwijl histologie een waardevolle diagnostisch hulpmiddel vertegenwoordigt, heeft het gebruik ervan in de studie van immuun hartcellen echter belangrijke beperkingen. De immune cellen die woonachtig zijn in het myocardium vertegenwoordigen een zeer klein percentage van het totaal aantal cellen en zijn min of meer gelijkmatig verdeeld in een proportioneel immense ruimte. Ook Toon verschillende vormen van cardiale ontsteking, zoals virale myocarditis, focal patronen van ontsteking. Dit betekent dat de nauwkeurige analyse van het immuunsysteem van het hart vaak hogere graden van de histologische bemonstering, verhoging van de kosten te verminderen van bias vereisen. Histologie biedt bovendien een zeer beperkte hoeveelheid bruikbare informatie in cel identificatie (bijvoorbeeld aantal parameters). Met een steeds groeiend aantal cel subsets kunt weergeven die het gebruik van meerdere expressie markers vereisen (met inbegrip van oppervlakte markeringen, transcriptiefactoren of secreted moleculen), heeft stroom cytometry zich gevestigd als de meest krachtige tool voor immunophenotyping, Als gevolg van lage kosten en hoge gegevensdoorvoer.
Het gebruik van immunophenotyping technieken is sterk afhankelijk van de ontwikkeling van efficiënte spijsvertering protocollen dat is toegestaan voor single-cellen analyse van grote aantallen cellen. De ontwikkeling van uitputtende protocollen van de extractie van de cel opende een nieuw venster van mogelijkheden in de studie van cardiale immunologie. Door de combinatie van de spijsvertering en stroom cytometry transcriptomics zijn de grote bevolking van macrofagen en dendritische cellen die woonachtig zijn in het hart gekarakteriseerd2,3. De overvloedigste bevolking van immuun hartcellen tijdens steady-state zijn CD64++ MerTK macrofagen, die kunnen verder worden onderverdeeld op basis van hun uitdrukking voor CCR2 of CD11c2. CCR2+ macrofagen zijn afkomstig uit beenmerg volwassen Haematopoiese, overwegende dat de meerderheid van CCR2- -macrofagen, dat hoge of lage niveaus van MHC-II uitdrukken kunnen, zijn hoofdzakelijk van prenatale oorsprong. Macrofagen belangrijke taken uitvoeren zoals reparatie4 en verwijdering van puin5 tijdens blessure of ondersteunende elektrische connectiviteit6 in stabiele toestand. Tijdens verschillende vormen van ontstekingen een belangrijke toevloed van Ly6Chi MHC-IIlo CD64int monocyten optreden, die later differentiëren in Ly6CHallo CCR2+ macrofagen2,7 . Een aanzienlijk kleiner, maar belangrijke bevolking van cellen die woonachtig zijn in het myocardium van gezonde individuen is samengesteld uit dendritische cellen8,9. De twee belangrijke subsets van cardiale conventionele DCs (cDCs) hebben onlangs gekenmerkt: cDC1 (CD103+ DCs) en cDC2 (CD11b+ DCs). DCs spelen een belangrijke rol in de verdediging tegen infectie8 maar kunnen ook bevorderen zelfverwonding tijdens ontsteking, met name tijdens een myocardinfarct9.
Hier beschrijven we een eenvoudige methode voor het isoleren van levensvatbare immuun hartcellen van muis myocard. De methode combineert enzymatische en mechanische spijsvertering met een cel-zeef filtratie met het oog op een interne celsuspensie dat kan worden geanalyseerd, of verder gezuiverd is, wat door de stroom cytometry sorteren of magnetische kraal verrijking. Nauwkeurige metingen van extravascular myocardcellen vereisen cardiale perfusie om het verwijderen van eventuele verontreinigingen uit de bloedbaan van de cardiale microvasculature. Daarnaast presenteren wij een optionele stap van intravasculaire labeling van immune cellen die kunnen worden gebruikt om te onderscheiden verder myocardcellen van intravasculaire contaminanten, gebaseerd op de Galkina et al. protocol10. Tot slot presenteren we een fundamentele stroom cytometry analyse ter identificatie van de grote macrophage en cDC subpopulaties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethische verklaring: dit protocol is herzien en goedgekeurd door de Commissie van de zorg van het dier op het University Health Network (Toronto, Canada) en is in overeenstemming met de Canadese Raad op Animal Care.
1. buffer voorbereiding
- HBB buffer (Henks evenwichtig zout oplossing (HBSS), 2% warmte geïnactiveerd runderserum, 0,2% bovien serumalbumine) voor te bereiden. Voeg toe 10 mL van warmte geïnactiveerd runderserum en 1 g bovien serumalbumine aan 500 mL HBSS. Filter steriliseren door een 0,2 µm filter en bewaren bij 4 ° C.
- Bereiden van FACS buffer (met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), 2% warmte geïnactiveerd runderserum, 1 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA, pH 8,0)). Voeg toe 10 mL warmte geïnactiveerd runderserum en 1 mL van de EDTA 0.5 M tot 500 mL PBS. Filter steriliseren door een 0,2 µm filter en bewaren bij 4 ° C.
Opmerking: Oplossingen kunnen worden achtergelaten bij 4 ° C voor maximaal 1 maand.
2. etikettering van circulerende leukocyten
- Aseptisch bereiden anti-muis CD45 injectie met 1 microgram van antilichaam verdund in een steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voor een definitieve geïnjecteerde volume van 200 µL/muis. Volume in een 28.5G insuline spuit laden en blijf uit de buurt van licht.
Opmerking: Gebruik twee verschillende fluorescerende-gelabelde anti-CD45 antilichamen om te onderscheiden van het intravasculaire (gekleurd door i.v. toediening) van de intracardiac kleuring (gekleurd na vertering; Zie stap 4). -
Vooraf warm muizen (8-12 weken oud) door de staart aan een rode warmte lamp voor 5 min bloot te leggen.
Let op: Niet oververhit raakt het dier. Houd van de lamp op een veilige afstand (> 30 cm).- Beperken van het dier in de sternale positie met behulp van een geschikte inrichting. Bloot en stabiliseer de staart met de niet-dominante hand door immobilizing de basis van de staart met de index- en middelvinger en de medio-distale regio van de staart met de duim en de ringvinger.
Let op: Geldt niet te veel kracht op het puntje van de staart, als de huid kan worden getrokken uit. Plaats de naald met de schuine kant naar boven in de ader. Houd de naald evenwijdig aan de ader te allen tijde als het is gemakkelijk om het doorprikken van de ader.
Opmerking: Bloed invoeren van de injectiespuit kan optreden en is een teken van een goede injectie. Buigen de naald onder een hoek van 90° kan vergemakkelijken i.v. toediening. Bevestigen met uw veiligheid kantoor zoals buigende naalden kunnen een gevaar vormen. - 200 µL intraveneus injecteren in de ader van de staart. De vloeistof moet gemakkelijk stromen en schakelt u tijdelijk de ader.
Let op: Forceer niet vloeistof in als weerstand wordt voldaan. Dit is een teken van omdat van de naald. - Het toestaan van antilichaam circuleren gedurende 5 minuten voordat het humaan euthanizing muis.
- Beperken van het dier in de sternale positie met behulp van een geschikte inrichting. Bloot en stabiliseer de staart met de niet-dominante hand door immobilizing de basis van de staart met de index- en middelvinger en de medio-distale regio van de staart met de duim en de ringvinger.
3. hart isoleren en spijsvertering
-
Euthanaseren van muizen met behulp van CO2 of door andere institutioneel aanvaarde euthanasie procedure.
- Voor CO2 euthanasie, plaatst u de muisaanwijzer in de CO2 -kamer en het tarief van de opvulling ingesteld op 20% van het volume van de kamer per minuut (dat wil zeggen, als de kamer 10 L, opvulling op 2 L/min is). Een looptijd van 2 min en monitor muis totdat ademhaling heeft opgehouden.
- Uitschakeling van de CO-2 en laat de muis voor een extra 1-2 min. zorgen ademhaling heeft opgehouden alvorens de kamer te openen en uitvoeren van een teen snuifje om te bevestigen dat de muis is dood voordat wij overgaan tot het verwerken van de muis.
- Spray de muis met 70% ethanol. Til de huid op de buik en ontleden de muis door te snijden langs het begin van de ventral midline op het niveau van de heupen tot het borstbeen. Open de buik en de lever om bloot van het middenrif te verplaatsen.
-
Snijd het middenrif en de ribben aan weerszijden van de middellijn, voorzichtig om te voorkomen dat het prikken van de longen en het hart.
- Expose het hart door peeling toen de ribben, snijd eerst de linker atria gevolgd door de juiste atria.
Let op: Wees voorzichtig bij het snijden van de atria, ervoor te zorgen dat geen slagaders of aders zijn gewond, aangezien dit de efficiëntie van het spoelen van het bloed opgenomen in de organen kan verminderen. - Perfuse het hart met 15-20 mL koude PBS met een 60 mL injectiespuit met een naald 21 G uitgerust en koude PBS. Zachtjes begrijpen van de basis van het hart met een tang en plaats de naald in het linkerventrikel in de buurt van de top. Herhaal de procedure in het rechterventrikel. Een correcte injectie resulteert in witte longen en bleke lever.
Opmerking: Perfusie moet worden uitgevoerd binnen 5 minuten na euthanasie om te voorkomen dat bloed coagulatie, die de organen van belang met het circulerende cellen kan besmetten.
- Expose het hart door peeling toen de ribben, snijd eerst de linker atria gevolgd door de juiste atria.
-
Houd de basis van het hart met een tang en zachtjes het hart optrekken, dan loskoppelen van het hart door het snijden van de grote pulmonary slagaders en aders, aorta en de pericardvocht zak.
- Reinig het hart door het hart tussen de duim en de wijsvinger zachtjes te houden in een schone stofvrije papieren handdoek en trek de atria en de overblijfselen van de grote slagaders en aders en eventuele andere verontreinigingen met een tang.
Opmerking: Zorg ervoor het geheel van de atria wordt verwijderd en geen andere weefsels, zoals de longen of de bloedvaten, als deze weefsels hun eigen resident immune cellen hebben aanwezig zijn. De Long heeft met name een grote immuun cel bevolking die de kleinere bevolking van die binnen het myocardium maskeren kan.
- Reinig het hart door het hart tussen de duim en de wijsvinger zachtjes te houden in een schone stofvrije papieren handdoek en trek de atria en de overblijfselen van de grote slagaders en aders en eventuele andere verontreinigingen met een tang.
-
Plaats het hart in een 5 cm kunststof schotel met 50 µL van koude PBS.
- Blad voor het hart met gebogen ontleden schaar totdat er geen zichtbare deeltjes en het heeft een gladde consistentie.
Opmerking: Probeer te houden het hart op een beperkt gebied van de schotel tijdens het hakken om te minimaliseren van verlies van weefsel. - Overdracht thetrituratedheart weefsel met gebogen pincet in 2 mL microcentrifuge buis met 800 µL koude Dulbecco van bewerkt Eagle Medium (DMEM).
- Blad voor het hart met gebogen ontleden schaar totdat er geen zichtbare deeltjes en het heeft een gladde consistentie.
-
Toevoegen van 450 U/mL ofcollagenase ik 60 U/mL hyaluronidase type I-S en 60 U/mL DNase-I bij elk monster.
- Incubeer monsters bij 37 ° C op een rockende shaker 50 rpm voor 45 – 60 min.
-
Na de vertering, kort vortex monsters (20 s) en onmiddellijk plaats op ijs te houden van de monsters bij 4 ° C.
- Met behulp van een pipet 1 mL, Pipetteer monsters op en neer totdat weefselsteekproeven homogeen zijn en niet het uiteinde van de pipet verstoppen doen.
Opmerking: Vaststelling van een bepaald aantal keren naar Pipetteer reproduceerbaarheid kan verhogen. Als de harten zijn niet optimaal verteerd, kunnen stukken van myocard belemmeren de pipet. Voorzichtig slijpen de pipet tip tegen de microcentrifuge buis zal helpen Meng grotere stukken van weefsel.
- Met behulp van een pipet 1 mL, Pipetteer monsters op en neer totdat weefselsteekproeven homogeen zijn en niet het uiteinde van de pipet verstoppen doen.
-
Natte vooraf een 40 µm cel zeef geplaatst op een conische buis van 50 mL met 1 mL koude HBB.
- Gehomogeniseerde monster toevoegen aan de filter en wassen via door het langzaam stromende 12 – 14 mL koude HBB.
- Gefilterde monsters overbrengen in een conische buis van gelabelde 15 mL en houden bij 4 ° C.
-
Centrifugeer steekproeven bij 400 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Gecombineerd uit supernatant.
- Lyse rode bloedcellen door toevoeging van 1 mL lysis-buffermengsel van Ammonium-Chloride-kalium (ACK) aan elk monster. Resuspendeer monsters door vortexing en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Zodra lysis heeft voltooid, voeg 5 – 8 mL van koude Henks evenwichtig zout oplossing (HBSS) om te stoppen met hemolyse.
- Centrifugeer steekproeven op 400 x Gvoor 5 min bij 4 ° C. Gecombineerd uit supernatant.
- Voeg 1 mL FACS buffer toe aan elk monster tot een gelabelde 1,5 mL microcentrifuge buis.
Opmerking: Het protocol kan worden onderbroken hier voor maximaal 2 uur met monsters opgeslagen bij 4 ° C.
4. Stroom Cytometry kleuring en analyse
-
Centrifugeer steekproeven bij 400 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
- Verklein de niet-specifieke antilichaam-bindende en Verdun 1:100 anti-CD16/CD32 en monocyt Blocker (1:20) (Zie Tabel van materialen) boekhouding voor 50 µL FACS per monster. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
- De administratieve verwerking van antilichaam, verdunning (1:250 voor elke antilichaam) van 50 µL van FACS per monster te bereiden.
Opmerking: Een levensvatbaarheid kleurstof kan worden opgenomen in het antilichaam cocktail om uit te sluiten van de dode cellen. Als alternatief, kleine grootte uitsluiting door flow analyse kan worden gebruikt (Figuur 1C en D). - Zonder wassen, voeg 50 µL van antilichaam master mix aan elk monster en meng.
- Incubeer monsters bij 4 ° C gedurende 30 minuten in het donker.
- 600 µL FACS toevoegen aan elk monster te wassen en centrifugeren van de monsters bij 400 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
- Gecombineerd uit supernatant en resuspendeer de pellet in 300 µL FACS. Houd de monsters bij 4 ° C in het donker.
Opmerking: Sommige levensvatbaarheid kleurstoffen, zoals DAPI, vereisen binnen 10 min voordat u stroom cytometry kleuring. - Analyseren door stroom cytometry (Zie figuren 1 en 2) binnen de volgende 3 h. Als een langere tijd is vereist, op korte termijn fixatie met behulp van een lage concentratie paraformaldehyde (0,5 – 1% in PBS) wordt aanbevolen voor het behoud van de kleuring.
Opmerking: Het is sterk aanbevolen om het filteren van monsters door een zeef cel 40 µm vóór starten stroom cytometry analyse ter voorkoming van obstructie van de fluidics van de cytometer van de stroom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tot op heden is geen goede methode ontwikkeld om te isoleren van immune cellen van andere cardiale celbestanddelen, zoals cardiomyocytes. Analyse van de cardiale eencellige schorsing door stroom cytometry heeft dus een vooraf gating met CD45 om te identificeren van de immuun cel populaties, gevolgd door eencellige en klein uitsluiting gating (Figuur 1A). Anderzijds kan een levensvatbaarheid kleuring worden uitgevoerd als u wilt uitsluiten van de dode cellen. Uitsluiting van kleine omvang en levensvatbaarheid kleurstof vlekken vertegenwoordigen bijna gelijkwaardige methoden uit te sluiten van de dode cellen (Figuur 1B en 1 D). Het is sterk aanbevolen wilt doorgaan met het antilichaam kleuring snel na de ingreep van de spijsvertering en houden altijd de celsuspensie bij 4 ° C, omdat de levensvatbaarheid van de cellen kan verval. Deze procedure levert doorgaans ongeveer 80-90% van levensvatbare immuuncellen.
Het myocardium herbergt een divers kolonie van immune cellen, waarvan vele nog in afwachting van de identificatie en karakterisering zijn. Macrofagen, geïdentificeerd als CD64+ cellen, zijn de belangrijke immune bevolking van het hart, 60-70% van alle immuuncellen (Figuur 1C, bovenaan). De spijsvertering van een volwassen lymfkliertest hart levert over 3-5 x 104 macrofagen, afhankelijk van de grootte van het hart. Cardiale macrofagen kunnen verder onderverdeeld worden op basis van hun uitdrukking van CD11c of CCR2 en hun niveaus van MHC-II2.
De andere cardiale immuun subpopulatie dat goed gekenmerkt zijn conventionele dendritische cellen. Conventionele DCs zijn CD64- cellen dat uitdrukkelijke intermediair tot hoge niveaus van MHC-II en hoge niveaus van CD11c (Figuur 1 C, bodem). Deze cellen kunnen verder worden onderverdeeld op basis van hun uitdrukking van CD103 of CD11b8,9. DCs vertegenwoordigen een veel kleinere cardiale subpopulatie ten opzichte van macrofagen. De spijsvertering van een volwassen lymfkliertest hart levert tussen 150 en 500 DCs van elke deelverzameling.
Perfusie van het hart met koude PBS is essentieel bij het identificeren van immuun cel populaties binnen het myocardium. Echter kan onvolmaakt perfusie verhogen de hoeveelheid intravasculaire verontreinigende stoffen in de monsters, wat leidt tot belangrijke vooroordeel dat kan worden gebaseerd op perifere wijzigingen (bloed) in plaats van wijzigingen in de cardiale infiltreert. In deze gevallen kan intravasculaire toediening van anti-CD45 TL-gelabelde antilichamen, waarmee alle immuuncellen circuleren door middel van macro- en microvasculature (Figuur 2A) de labels, helpen differentiëren myocardcellen uit intravasculaire contaminanten. Figuur 2 B ziet u een voorbeeld van een gebrekkig perfused hart in die 20% van immuuncellen intravasculaire contaminanten zijn. Nog belangrijker is, is dit niveau van besmetting heeft weinig effect op macrophage en DC analyse, aangezien deze cellen zelden in bloed (Figuur 2D aangetroffen worden).
Het gebruik van stroom cytometry van de ophanging van een eencellige van myocard zorgt voor de studie van de kleine subpopulaties van het hart. Bijvoorbeeld, is de tekortkoming van de transcriptiefactor BATF3 gebleken om te voorkomen dat de ontwikkeling van volwassen CD103+ DCs in verschillende weefsels11. Om te kunnen studeren als dit ook voor het myocardium geldt, zijn eencellige schorsingen van hartcellen van 8 – 15-week-oude BATF3-deficiënte of besturingselement nestgenoten (op C57BL/6 achtergrond) geanalyseerd met behulp van stroom cytometry. Vanwege de kleine bevolkingsgrootte en aantal markeringen nodig om te onderscheiden van de DC-subsets, kan histologie niet hebben verstrekt voldoende stroom voor analyse naar het bereiken van een definitief antwoord. Echter, met behulp van stroom cytometry analyse te vergelijken de immuuncellen van het myocardium van wild-type ten opzichte van een Batf3- / - muizen, een gebrek aan CD103+ DCs kan worden bevestigd in de laatste (Figuur 3A en B). Daarnaast zien we dat BATF3-deficiency niet aanzienlijk gewijzigd de samenstelling van andere cardiale populaties (Figuur 3C en D). Deze resultaten illustreren de mate van gevoeligheid die kan worden bereikt met behulp van deze gecombineerde methode van enzymatische en mechanische spijsvertering om de schorsing van een enkele cel.
Figuur 1 : Strategie voor cardiale macrofagen en DCs gating. Geïsoleerde harten van C57BL/6 muizen werden verteerd zoals beschreven, en één celsuspensie werd geanalyseerd door stroom cytometry. (A) Gating van CD45 + live singlet hartcellen. Gebruik CD45 labeling te identificeren van immuuncellen van de cardiale eencellige homogenaat, waarin zeer hoge niveaus van niet-immune cellen (dat wil zeggen, cardiomyocytes, endotheliale cellen en fibroblasten). Uitsluiten van paren door het vergelijken van SSC-H vs SSC-A gevolgd door FSC-H vs FSC-A. Opmerking: Een andere vergelijking tussen SSC-A, SSC-H en WS-W of FSC-A, FSC-H en FSC-W zijn eveneens nuttig. Selectie van levende cellen kan worden uitgevoerd door met uitzondering van zeer kleine cellen (WS-H vs FSC-H poort). (B) vergelijking van uitsluiting van de dode cel met behulp van grootte vs levensvatbaarheid kleuring (DAPI). (C) strategie voor de identificatie van cardiale macrofagen Gating (CD11b+ CD64+ cellen) en DCs (CD64- MHC-IIhi CD11c+). Cardiale macrofagen kunnen verder worden ingedeeld op basis van hun uitdrukking van MHC-II en CD11c. cardiale DCs kan worden onderverdeeld gebaseerd op hun uitdrukking van CD103 of CD11b. de representatieve percelen (D) van de DAPI + dode cellen binnen de macrofaag en DC compartimenten na uitsluiting van kleine omvang. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Etikettering van intravasculaire cellen contaminanten. (A) vergelijking intravasculaire CD45 etikettering van bloed neutrofiele granulocyten en Ly6CHallo monocyten in anti-CD45 antistof behandeld (rood) of niet-behandelde (blauw) muizen. (B) identificatie van intravasculaire contaminanten in een cardiale voorbereiding door intravasculaire CD45 etikettering. (C) vertegenwoordiger stroom percelen van myocardiale en intravasculaire cellen. (D) vertegenwoordiger percelen van gelabelde cellen binnen de macrofaag en DC compartimenten na anti-CD45 i.v. toediening. Merk op dat macrofagen en DCs uitsluitend extravascular. Intravasculaire verontreinigingen zijn meestal lymfocyten, monocyten en neutrofielen2. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Kwantificering van cardiale macrofagen en DCs in BATF3-deficiënte muizen. (A) representatieve stroom percelen van cardiale DCs in Batf3+/ + en Batf3- / - muizen. (B) kwantificering van cardiale DCs in Batf3+/ + en Batf3- / - muizen. Opmerking de afwezigheid van CD103+ DCs in Batf3- / - muizen. (C en D) kwantificering van cardiale macrofagen (MF) in Batf3+/ + en Batf3- / - muizen. Foutbalken vertegenwoordigen SEM. rode symbolen vertegenwoordigen individuele dieren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Myocardiale ontsteking of myocarditis, is een functie van meest cardiovasculaire ziekten. Het myocardium is echter niet gespeend van eigen immuunsysteem componenten in niet-ziekte staten. Tijdens steady-state, vele immune cellen bevinden zich in het myocardium en spelen de essentiële rol van onderhoud en bescherming. De karakterisering van deze verschillende populaties van cellen zou niet mogelijk zijn geweest zonder methoden zoals gepresenteerd in dit protocol.
Een combinatie van mechanische en enzymatische vertering van het myocardium toelaat de isolatie van een enkele celsuspensie die kan worden gebruikt in combinatie met andere methoden voor analyse, zoals de stroom cytometry of immunomagnetic isolatie van de kraal. Verscheidene overwegingen met betrekking tot de huidige methode moeten rekening worden gehouden. Eerst, verwijzen al onze analyses naar de bevolking binnen het myocardium; Wij sluiten de atria uit onze analyse zijn gespecialiseerde weefsels met zijn eigen eigenaardigheden. Ten tweede, de hoeveelheid enzymen gebruikt worden uitgedrukt als activiteit eenheden om te helpen bij de opzet van de spijsvertering met behulp van enzymen uit andere bronnen. Echter, empirische optimalisatie van de uiteindelijke concentratie van enzymen en het tijdstip van de spijsvertering is sterk aanbevolen, omdat beperken enzym aanzienlijk de opbrengst van de cel verminderen kan en teveel spijsvertering drastische gevolgen voor levensvatbaarheid hebben kan. Ten derde, de optionele stap waarbij intravasculaire beheer van gelabelde antilichamen wordt vooral aanbevolen bij de studie van ongewoon populaties in de normale myocard (zoals lymfocyten, monocyten en neutrofielen)2 of omstandigheden Wanneer de nummers van populaties in het bloed kan veranderen (monocytosis, granulocytosis of lymphocytosis) die een valse indruk van wijzigingen binnen het myocardium die moeten worden bevestigd met behulp van deze methode of, als alternatief, microscopie kunnen geven. Deze stap is echter van beperkt nut bij het analyseren van macrofagen of volwassen DCs, aangezien deze cellen zelden in significante hoeveelheden in het bloed (Figuur 2D gevonden zijn). Het is belangrijk voor het optimaliseren van de hoeveelheid antistoffen toegediend en de incubatietijd voordat het opofferen van de muis, als lange termijn incubatie kan zorgen voor de verspreiding van sommige antilichaam in het hart, vooral in een ontstoken myocard. Tot slot, is het zeer belangrijk om te worden nauwgezet in het isolement van het hart, het elimineren van de overblijfselen van de grote slagaders, aders en/of een ander weefsel, zoals de Long. Deze verontreinigingen weefsels hebben sterk verhoogde aantal immuuncellen die gemakkelijk de myocardiale inheemse bevolking kunnen maskeren.
Het is zeer belangrijk voor het uitvoeren van de uitsluiting van dode cellen, of met behulp van levensvatbaarheid kleurstoffen of via uitsluiting van de kleine grootte tijdens de stroom cytometry analyse, als spijsvertering (of weefselschade in ziekte modellen) kan leiden tot een relatief grote hoeveelheid dode cellen. Wij hebben ten opzichte van de efficiëntie van dode cel uitsluiting door de grootte en het gebruik van een etiket van de levensvatbaarheid (Figuur 1B en D), demonstreren hun in de omgeving van gelijkwaardigheid. Nog belangrijker is, is dat de grootte uitsluiting kan niet worden gebruikt na fixatie en permeabilization aangezien deze procedure aanzienlijk de celgrootte van de vermindert.
Hoewel autofluorescence zelden een probleem is voor het identificeren van cardiale macrofagen met behulp van stroom cytometry, vertegenwoordigt dit een belangrijker probleem wanneer het proberen om het karakteriseren van de expressie van sommige markers, met name met fluorochromes opgewonden door hoge energie ( kortere) licht golflengten (350-500 nm). In deze experimenten, is het sterk aanbevolen om isotype besturingselementen gebruiken, de blauw en violet lasers (fluoresceïne isothiocyanaat, phycoerythrin, Pacific Blue/Brilliant Violet 421) te vermijden en gebruik van fluorochromes met emissies boven 600 nm, zoals allophycocyanin.
Het gebruik van protocollen als de hier vermelde belangrijker worden als een toenemende hoeveelheid literatuur is het identificeren van de rol van intensiteit en soort ontsteking in evalueren en karakteriseren van de resultaten van hart-en vaatziekten. Deze methode maakt het mogelijk hogere niveaus van cel karakterisering dan histologie. Bijvoorbeeld, het gebruik van lineage tracering voor de identificatie van ontogenically verschillende subgroepen van macrofagen met hun geprogrammeerde verschillende functies2toegestaan. Deze methode kan ook worden gebruikt bij het bestuderen van T cel reacties tijdens myocardiale ontsteking en gecombineerd met ex vivo stimulatie te bestuderen van de T cel polarisatie8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Canadese instituten van gezondheidsonderzoek (148808 en 148792), SE werd ondersteund door een hart en beroerte Foundation, personeel award van het Ontario provinciale Office, maart van dubbeltjes, Ted Rogers Centre voor onderzoek van het hart en de Peter Munk Hartcentrum. XCC houdt een CIHR Banting Fellowship. LA houdt een hart & beroerte/Richard Lewar studententijd Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | Wisent | 311-010-CL | 1x PBS |
| 21 G x 1 1/2 (0.8 mm x 40 mm) PrecisionGlide Needle | BD | 305167 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Wisent | 311-511-CL | 1x HBSS |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503-50G | |
| Bovine serum | Sigma | B9433 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid | BioShop | EDT111 | |
| Vacuum filter , 0.2 µm Filtropur V50 | Sarstedt | 83.1823.001 | |
| 28 G 1/2 1 cc insulin syringe | BD | 329424 | |
| 60 mL syringe | BD | 309653 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Wisent | 319-005-CL | 1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | from Clostridium histolyticum |
| Hyaluronidase type I-S | Sigma | H3506 | |
| DNase-I | Sigma | D4513 | from bovine pancreas |
| Cell strainer, 40 µm Nylon | Falcon | 352340 | |
| Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer | Lonza | 10-546E | |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b | Biolegend | 101222 | 1:250 dilution |
| APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c | Biolegend | 128025 | 1:250 dilution |
| APC anti-mouse CD103 | Biolegend | 121414 | 1:250 dilution |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c | Biolegend | 117334 | 1:250 dilution |
| PE anti-mouse Ly-6G | Biolegend | 127607 | 1:250 dilution |
| Pacific Blue anti-mouse I-Ab | Biolegend | 116422 | 1:250 dilution |
| FITC anti-mouse CD64 (FcgRI) | Biolegend | 139315 | 1:250 dilution |
| PE/Cy7 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103113 | 1:250 dilution |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103132 | 1:40 dilution |
| TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| True-Stain Monocyte Blocker | Biolegend | 426101 | 1:20 dilution |
| FlowJo V10 | TreeStar Inc | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
| Mouse: Batf3-/- | The Jackson Laboratory | JAX: 013755 |
References
- Marboe, C. C., Fenoglio, J. J. Pathology and natural history of human myocarditis. Pathology and Immunopathology Research. 7 (4), 226-239 (1988).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Pinto, A. R., et al. An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile. PLoS One. 7 (5), 36814 (2012).
- Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).
- Fujiu, K., Wang, J., Nagai, R. Cardioprotective function of cardiac macrophages. Cardiovascular Research. 102 (2), 232-239 (2014).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Nahrendorf, M., et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).
- Clemente-Casares, X., et al. A CD103(+) Conventional Dendritic Cell Surveillance System Prevents Development of Overt Heart Failure during Subclinical Viral Myocarditis. Immunity. 47 (5), 974-989 (2017).
- Van der Borght, K., et al. Myocardial Infarction Primes Autoreactive T Cells through Activation of Dendritic Cells. Cell Reports. 18 (12), 3005-3017 (2017).
- Galkina, E., et al. Preferential migration of effector CD8+ T cells into the interstitium of the normal lung. Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3473-3483 (2005).
- Edelson, B. T., et al. Peripheral CD103+ dendritic cells form a unified subset developmentally related to CD8alpha+ conventional dendritic cells. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 823-836 (2010).
