Summary
Bu iletişim kuralı izole, tanımlamak ve kararlı duruma veya enflamasyon sırasında fareler Miyokardiyum içinde ikamet eden bağışıklık hücreleri ölçmek için basit ve etkili bir yöntem sunuyor. Protokol enzimatik ve mekanik sindirim daha fazla akış sitometresi tarafından analiz edilecek bir tek hücre süspansiyon nesil için birleştirir.
Abstract
Bağışıklık sistemini sağlıklı bir kalp, temel bir bileşenidir. Miyokardiyum olduğunu farklı bağışıklık hücre alt kümeleri fonksiyonel bölünebilme kararlı duruma sırasında ve çeşitleri enflamasyon sırasında ile zengin bir nüfusa ev. Yakın zamana kadar kalbinde bağışıklık hücreleri çalışma mikroskobu kullanımını gerekli veya yeterli duyarlılığı sırasında şiddetli inflamasyon sağlanan ama güvenle aciz kalmışlardır kötü gelişmiş sindirim protokollerini tanımlamak küçük — ama anahtar — nüfus hücreleri kararlı duruma sırasında. Burada, bir basit yöntem birleştirerek enzimatik (collagenase, hyaluronidase ve DNaz) ve küçük ayırt etmek için antikorlar fluorescently etiketli intravasküler yönetimi tarafından öncesinde fare kalplerin mekanik sindirim tartışmak ama kaçınılmaz damar içi hücre kirletici. Bu yöntem tarafından incelendi akış sitometresi tanıma, fenotipleme ve miktar veya floresan aktif hücre sıralama veya manyetik boncuk ayrılması için daha fazla saf izole hücrelerin bir süspansiyon oluşturur Transkripsiyon analiz veya vitro çalışmalar. Biz anahtar makrofaj ve dendritik hücre popülasyonlarının kalp ayırt etmek için bir adım adım akış sitometrik analizin bir örnek içerir. Bir orta ölçekli deney (10 kupa) yordamı tamamlandıktan 2 – 3 saat gerektirir.
Introduction
Miyokardiyal stres veya yaralanma, iskemik dahil olmak üzere (iskemi reperfüzyon veya miyokard infarktüsü) farklı formları ve iskemik olmayan (hipertansiyon veya miyokardit), ama aynı zamanda Onarıcı ve koruyucu, inflamatuar hücrelerle istihdamı teşvik patojenik özellikleri. 1891, gibi erken Romberg ilk hücresel infiltratlar tifüs ve Kızıl hastalığı1ile infekte hastaların Miyokardiyum varlığı tarif. Ancak, kardiyak bağışıklık hücreleri detaylı çalışmanın daha gelişmiş immunophenotyping teknikleri geliştirilmesi gerekmektedir. Sonuç olarak, yakın zamanda bağışıklık hücreleri temel bakım rolleri ile farklı bir popülasyon sırasında kararlı duruma Miyokardiyum içinde bulunduğu anlamaya başlamıştır.
Histoloji oldu ve hala, enflamasyon sırasında kalp bağışıklık hücreleri ayırdetmek için en yaygın yöntem. Ancak, Histoloji değerli bir tanı aracı temsil ederken, kullanımı kardiyak bağışıklık hücreleri insan önemli sınırlamaları vardır. Miyokardiyum içinde ikamet eden bağışıklık hücreleri toplam hücrelerin çok küçük bir oran temsil ve orantılı olarak çok büyük bir alanda daha fazla veya daha az eşit olarak dağıtılır. Benzer şekilde, kardiyak inflamasyon, viral miyokardit gibi çeşitli formları inflamasyon odak desenleri gösterin. Kalp bağışıklık sisteminin doğru analiz kez yüksek derece histolojik örnekleme, önyargı azaltmak için maliyeti artan gerektiren anlamına gelir. Ayrıca, Histoloji çok sınırlı bir hücre kimliği (Örneğin sayıda parametre) kullanışlı bilgileri sağlar. Akış Sitometresi (yüzey işaretleyicileri, transkripsiyon faktörleri veya salgılanan moleküller gibi) birden çok ifade işaretleri kullanımını gerektiren hücre alt kümeleri artan bir sayı ile immunophenotyping için en güçlü araç olarak kendisini kurmuştur, düşük maliyetli ve yüksek işlem hacmi nedeniyle.
İmmunophenotyping teknikleri çok sayıda hücreleri tek hücre analizi için izin verimli sindirim protokolleri gelişimini yakından bağlıdır. Hücre ekstraksiyon ayrıntılı iletişim kuralları gelişimi kardiyak İmmünoloji çalışmada fırsatları yeni bir pencere açtı. Arada sindirim, akış sitometresi ve transcriptomics yoluyla, makrofajlar ve dendritik hücreleri merkezinde ikamet eden büyük nüfus karakterize2,3olmuştur. Kardiyak bağışıklık hücreleri en bol popülasyon sırasında kararlı duruma vardır CD64+MerTK+ CCR2 veya CD11c2onların ifade üzerinde temel alan makrofajlar, daha da ayrılabilir. CCR2+ ise makrofajlar yetişkin kemik iliği hematopoiesis kaynaklanan çoğu CCR2 MHC-II yüksek veya düşük düzeyde ifade edebilir,- makrofajlar, esas olarak Doğum öncesi kökenlidir. Makrofajlar onarım4 ve enkaz5 kaldırılması sırasında yaralanma veya elektrik bağlantısı6 sabit durumda destekleyen gibi temel fonksiyonları yerine getirir. Enflamasyon sırasında çeşitleri Ly6CMerhaba MHC-IIlo CD64int monosit önemli bir akını oluşur, hangi daha sonra Ly6CMerhaba CCR2 ayırt+ makrofajlar2,7 . Önemli ölçüde daha küçük ancak önemli Vaha'da hücrelerinin sağlıklı bireyler Miyokardiyum içinde ikamet eden dendritik hücreler8,9/ oluşur. Kardiyak geleneksel DCs (KGK) iki ana alt kümeleri son zamanlarda nitelendirmiştir: cDC1 (CD103+ DCs) ve cDC2 (CD11b+ DCs). DCs enfeksiyon8 karşı savunmak için önemli rol oynarlar ama aynı zamanda kendini yaralama sırasında özellikle9miyokard infarktüsü enflamasyon sırasında yükseltebilirsiniz.
Burada, fare Miyokardiyum üzerinden kardiyak immün hücrelerin izolasyonu için basit bir yöntem açıklanmaktadır. Yöntemi analiz veya daha fazla akış sitometresi sıralama veya manyetik boncuk zenginleştirme tarafından saf bir tek hücre süspansiyon elde etmek için enzimatik ve mekanik sindirim bir hücre-Süzgeç filtrasyon ile birleştirir. Extravascular miyokard hücrelerinin doğru ölçümler kardiyak perfüzyon kardiyak microvasculature kan olası kirletici kaldırmak için gerektirir. Buna ek olarak, biz daha fazla intravasküler kirleticiler, Galkina ve ark. Protokolü10tabanlı miyokardiyal hücreler ayırt etmek için kullanılan bağışıklık hücrelerinin damar içi etiketleme, isteğe bağlı bir adım mevcut. Son olarak, biz büyük makrofaj ve cDC altgrupları tanımlamak için bir temel Akış Sitometresi Analizi mevcut.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Beyanı: Bu protokol gözden geçirilmiş ve Üniversitesi Sağlık Ağı (Toronto, Kanada), hayvan bakımı Komitesi tarafından onaylanmış ve hayvan bakımı Kanada Konseyi ile uyumlu.
1. arabellek hazırlık
- HBB arabellek (Hank'in dengeli tuz çözüm (HBSS), % 2 ısı inaktive Sığır serum, %0,2 sığır serum albümin) hazırlayın. Isı 10 mL Sığır serum ve HBSS 500 ml Sığır serum albümin 1 g inaktive ekleyin. Filtre 0.2 µm filtreden sterilize ve 4 ° C'de depolayın
- FACS arabellek hazırlamak (fosfat tamponlu tuz (PBS), % 2 ısı inaktive Sığır serum, 1 mM Ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA, pH 8.0)). Sığır serum ve 1 mL 0.5 M EDTA PBS 500 ml 10 mL ısı inaktive ekleyin. Filtre 0.2 µm filtreden sterilize ve 4 ° C'de depolayın
Not: Çözümler 4 ° C'de 1 ay boyunca saklanır.
2. lökosit dolaşan etiketleme
- Aseptik steril fosfat tamponlu tuz (PBS) için 200 µL/fare son enjeksiyon hacmi içinde seyreltilmiş antikor 1 µg ile Anti-fare CD45 enjeksiyon hazırlayın. Birim 28,5 G insülin enjektör yük ve ışıktan uzak tutun.
Not: iki farklı fluorochrome etiketli anti-CD45 antikorlar intrakardiyak boyama üzerinden intravasküler (damar yolu yönetim lekeli) ayırt etmek için kullanın (sindirim sonra lekeli; bkz. Adım 4). -
Fareler (8-12 hafta yaşlı) kırmızı ısı lamba 5 min için kuyruğuna açarak önceden ısıtmak.
Dikkat: hayvan aşırı değil. Lamba güvenli bir mesafede tutmak (> 30 cm).- Hayvan sternal konumda uygun bir aygıt kullanarak engelleyin. Ortaya çıkarmak ve sigara dominant el ile kuyruk kuyruk dizin ve orta parmak ile altyapı ve kuyruk başparmak ve parmak yüzük ile orta-distal bölge immobilizing tarafından stabilize.
Dikkat: cilt çıkardı gibi çok fazla güç kuyruk ucunda geçerli değildir. İğne eğimi damar içine yukarı dönük olacak şekilde yerleştirin. Gibi damar ponksiyon kolay iğne her zaman ven paralel tutun.
Not: kan şırınga girerek oluşabilir ve iyi bir enjeksiyon işaretidir. İğne 90 ° açı bükme damardan yönetim kolaylaştırabilir. Bükme iğneler bir tehlike temsil edebilir gibi ile emanet ofis onaylayın. - 200 µL intravenöz kuyruk damar içine enjekte. Sıvı kolay akışını ve geçici olarak ven temizleyin.
Dikkat: direnç karşılandığında sıvı zorlamayın. Bu iğne saklanmalıdır işaretidir. - Antikor insanca fare ötenazi önce 5 min için dolaşmaya izin.
- Hayvan sternal konumda uygun bir aygıt kullanarak engelleyin. Ortaya çıkarmak ve sigara dominant el ile kuyruk kuyruk dizin ve orta parmak ile altyapı ve kuyruk başparmak ve parmak yüzük ile orta-distal bölge immobilizing tarafından stabilize.
3. kalp yalıtma ve sindirim
-
CO2 kullanarak fare ötenazi veya diğer kurumsal olarak kabul edilen ötanazi yordam tarafından.
- CO2 ötenazi, CO2 odasında fareyi getirin ve dakikada (odası 10 L, 2 L/dk dolgu iseYani, ) Odası hacmi %20 için dolgu oranını ayarlamak. Nefes kesildiği tarih vardır kadar 2 dk ve monitör mouse için çalıştırın.
- CO2 kes ve ek bir 1-2 dk. nefes odası açmadan önce kesildiği tarih vardır sağlamak için fare ve fare fare işlemeye devam etmeden önce öldü onaylamak için bir ayak çimdik gerçekleştirmek.
- Sprey % 70 etanol ile fare. Karın, cilt kaldırın ve fare kadar göğüs kemiği kalça düzeyinde ventral orta hat başlangıç boyunca keserek incelemek. Karın açar ve diyafram ortaya çıkarmak için karaciğer gider.
-
Diyafram, sonra kaburga akciğer ve kalp delinme önlemek için dikkatli olmak orta çizgi, her iki tarafta kesti.
- Peeling ezbere geri kaburga, sonra Sol kulakçık sağ kulakçık tarafından takip kesim ilk maruz.
Dikkat: Bu organlarda bulunan kan yıkama etkinliğini azaltabilir gibi herhangi bir arter veya damarlar yaralandı, sağlanması atria, kesme dikkatli kullanın. - 15-20 mL soğuk PBS 21 G iğne ile donatılmış bir 60 mL şırınga kullanarak ve soğuk PBS kalple sıvı. Yavaşça kalp Bankası forseps ile kavramak ve tepe yakınındaki sol ventrikül iğne yerleştirin. Sağ ventrikül yordamı yineleyin. Uygun bir enjeksiyon beyaz akciğerler ve soluk karaciğer ile sonuçlanır.
Not: Perfüzyon ötenazi sonra 5 dakika içinde organ hücreleri dolaşan ile ilgi kontamine kan pıhtılaşması önlemek için yapılmalıdır.
- Peeling ezbere geri kaburga, sonra Sol kulakçık sağ kulakçık tarafından takip kesim ilk maruz.
-
Kalp Bankası forseps ile tutun ve hafifçe yukarı çekin kalp, sonra kalp ana pulmoner arterler ve damarlar, aort ve perikardiyal çuval keserek ayırmak.
- Kalp kalp başparmak ve işaret parmakları arasında bir temiz havsız kağıt havlu ile nazikçe tutarak temiz ve kulakçık ve ana arterler ve damarlar ve diğer kirletici maddeleri kalıntıları forseps ile çekin.
Not: kulakçık tamamı kaldırılır ve bu dokularda kendi yerleşik bağışıklık hücreleri gibi hiçbir diğer dokular, akciğer veya kan damarları, gibi mevcut olun. Akciğer özellikle bu Miyokardiyum içinde daha küçük nüfus maske yapabilirsiniz bir büyük bağışıklık hücre nüfusa sahiptir.
- Kalp kalp başparmak ve işaret parmakları arasında bir temiz havsız kağıt havlu ile nazikçe tutarak temiz ve kulakçık ve ana arterler ve damarlar ve diğer kirletici maddeleri kalıntıları forseps ile çekin.
-
Kalp 50 µL soğuk PBS ile 5 cm plastik çanak yerleştirin.
- Görünür hiçbir parça vardır ve pürüzsüz bir tutarlılık vardır kadar eğri diseksiyon makası kullanarak kalp kıyma.
Not: kalp doku kaybı en aza indirmek için kesme sırasında yemeğin bulunduğu bir alanda bulundurmaya çalışın. - 2 mL microcentrifuge tüp ile 800 µL soğuk Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (DMEM) içine eğri forseps kullanarak thetrituratedheart doku aktarın.
- Görünür hiçbir parça vardır ve pürüzsüz bir tutarlılık vardır kadar eğri diseksiyon makası kullanarak kalp kıyma.
-
Ben, hyaluronidase tip ı-S 60 U/mL ve DNaz 60 U/mL 450 U/mL ofcollagenase ekleyin-ben her örnek için.
- 45-60 dk 50 RPM sallanan bir shaker olarak 37 ° C'de örnekleri kuluçkaya.
-
Sindirim, girdap örnekleri kısa bir süre sonra (20 s) ve hemen buz örnekleri 4 ° C'de tutmak için yer
- Doku örnekleri homojen ve Pipet Ucu zarar değil kadar 1 mL pipettor kullanarak, örnekleri yukarı ve aşağı pipet.
Not: bir kaç kez pipet için tanımlama tekrarlanabilirlik artabilir. Kalpleri en iyi şekilde sindirmek değil eğer Miyokardiyum adet pipet engel. Yavaşça microcentrifuge tüp karşı pipet ucu Bileme daha büyük doku parçaları homojenize yardımcı olacaktır.
- Doku örnekleri homojen ve Pipet Ucu zarar değil kadar 1 mL pipettor kullanarak, örnekleri yukarı ve aşağı pipet.
-
50 mL konik tüp ile 1 mL soğuk HBB yerleştirilen bir 40 µm hücre süzgeç önceden ıslak.
- Homojenize örnek için filtre ekleyin ve yavaş yavaş 12-14 mL soğuk HBB dökerek ile yıkayın.
- Filtre uygulanmış örnekleri etiketli 15 mL konik tüp aktarmak ve 4 ° C'de tutmak
-
Santrifüj örnekleri 400 x g 4 ° C'de 5 min için de Süpernatant Aspire edin.
- Her örnek için 1 mL amonyum klorür potasyum (ACK) lizis arabelleği ekleyerek kırmızı kan hücreleri parçalayıcı. Örnekleri vortexing tarafından resuspend ve 5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya.
- Lizis tamamladıktan sonra 5-8 mL, soğuk Hank'in dengeli tuz çözüm (hemoliz durdurmak için HBSS) ekleyin.
- Örnekleri, 400 x gfor 4 ° C'de 5 dk santrifüj kapasitesi Süpernatant Aspire edin.
- Her örnek ve etiketli 1.5 mL microcentrifuge tüp transferi FACS arabelleği 1 mL ekleyin.
Not: Protokol burada en fazla 2 saat için 4 ° C'de depolanan örnekleri ile duraklatılmış
4. akış sitometresi boyama ve analiz
-
Santrifüj örnekleri 400 x g 4 ° C'de 5 min için de
- Non-spesifik antikor bağlama azaltmak için seyreltik 1: 100 anti-CD16/CD32 ve monosit engelleyici (1:20) (bakınız Tablo reçetesi) muhasebe örnek başına 50 µL FACS için. 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
- Antikor seyreltme (1:250 her antikor için) muhasebe FACS 50 µL örnek başına için hazırlayın.
Not: Bir canlılık boya antikor kokteyl ölü hücreleri dışlamak için eklenebilir. Alternatif olarak, küçük boyutlu dışlama akışı analizi tarafından kullanılan (Şekil 1C ve D) olabilir. - Çamaşır olmadan, 50 µL antikor ana karışımı her örnek ve karışımı ekleyin.
- Örnekleri için karanlıkta 30 dk 4 ° C'de kuluçkaya.
- Yıkama ve örnekleri, 400 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi için her örnek 600 µL FACS eklemek
- Süpernatant Aspire edin ve Pelet 300 µL FACS içinde resuspend. Karanlıkta 4 ° C'de örnekleri tutmak.
Not: Bazı canlılığı boya, DAPI gibi akış sitometresi çalıştırmadan önce 10 dakika içinde boyama gerektirir. - Akış Sitometresi tarafından analiz (bkz: Şekil 1 ve 2) sonraki 3 saat içinde. Eğer daha uzun bir süre düşük konsantrasyon paraformaldehyde kullanarak gerekli, kısa vadeli fiksasyon (0.5-%1 PBS) boyama korumak için önerilir.
Not: Akış sitometresi akışkanlar tıkanıklığı önlemek için bir 40 µm hücre süzgeç önce başlatmak Akış Sitometresi Analizi yoluyla örnekleri filtre uygulamak için önerilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bugüne kadar iyi bir yöntem yoktur cardiomyocytes gibi diğer kardiyak hücre bileşenlerinden bağışıklık hücreleri izole etmek için tasarlanmıştır. Bu nedenle, kardiyak tek hücre süspansiyon tarafından Akış Sitometresi Analizi bir tek hücre ve küçük boyutlu dışlama gating (Şekil 1A) ardından bağışıklık hücre popülasyonlarının tanımlamak için CD45 ile önceden geçişi gerektirir. Alternatif olarak, ölü hücreleri dışlamak için bir canlılık boyama gerçekleştirilebilir. Küçük boyutlu dışlama ve canlılığı boya boyama ölü hücreleri (Şekil 1B ve 1 D) dışlamak için neredeyse eşdeğer yöntemlerini temsil eder. Hücrelerin canlılık çürük gibi yakında sindirim işlemden sonra boyama antikor ile sürdürmek ve her zaman hücre süspansiyon 4 ° C'de tutmak için önerilir. Bu yordam genellikle kalıcı bağışıklık hücreleri yaklaşık % 80-90 verir.
Miyokardiyum çoğu hala kimlik ve karakterizasyonu bekleyen olan bağışıklık hücrelerinin farklı bir koloni evler. CD64 tanımlanan makrofajlar,+ hücrelerdir, 60-%70 tüm bağışıklık hücrelerinin (Şekil 1C, top) temsil eden büyük bağışıklık nüfus kalp. Yetişkin bir fare kalp hazım verimleri hakkında 3-5 x 104 makrofajlar, kalbin boyutuna bağlı olarak. Kardiyak makrofajlar daha fazla CD11c veya CCR2 kendi ifade ve MHC-II2düzeylerinin bağlı alt.
İyi karakterize diğer kardiyak bağışıklık subpopulation geleneksel dendritik hücreler vardır. Geleneksel DCs vardır CD64- hücreleri bu hızlı orta ve yüksek düzeyde MHC-II ve CD11c yüksek düzeyde (1 C rakam, alt). Bu hücreler daha fazla dayalı onların ifade ya CD103 ya da CD11b8,9olarak ayrılabilir. DCs makrofajlar için göre bir çok küçük kalp subpopulation temsil eder. Yetişkin bir fare kalp hazım her alt 150 ve 500 DCs arasında verir.
Perfüzyon kalp soğuk PBS ile bağışıklık hücre popülasyonlarının Miyokardiyum içinde tanımlarken esastır. Ancak, kusurlu perfüzyon kardiyak infiltratlar değişimler yerine yapılan çevre değişiklikleri (kan) dayalı önemli önyargı önde gelen damar içi kirletici maddeler miktarda artabilir. Bu gibi durumlarda, makro ve microvasculature (Şekil 2A) dolaşan bütün bağışıklık hücreleri etiketleri, damar içi yönetim floresan etiketli anti-CD45 antikorların miyokardiyal hücrelerden ayırt yardımcı olabilir damar içi kirletici. Resim 2 B bağışıklık hücreleri % 20'si intravasküler kirletici olan Imperfectly perfused bir kalp bir örneği gösterilir. Önemlisi, bu düzeyde kirlenme makrofaj ve DC analizi, küçük etkisi beri bu hücreler nadiren kan (Şekil 2D) bulunur.
Akış Sitometresi Miyokardiyum bir tek hücre süspansiyon, kalp küçük altgrupları çalışma için sağlar. Örneğin, transkripsiyon faktörü BATF3 eksikliği olgun CD103 gelişimi önlemek için gösterilen+ DCs birkaç doku11. Bu da söz konusu olduğunda Miyokardiyum doğru ise çalışma için 8-15-hafta-yaşlı BATF3-eksik veya denetim littermates (arka planda C57BL/6) kalp hücreleri tek hücre süspansiyonlar akış sitometresi kullanarak analiz edildi. Küçük nüfus büyüklüğü ve DC alt kümeleri ayırt etmek için gerekli işaretleri sayısı nedeniyle, Histoloji kesin bir cevap ulaşmak analiz için yeterli güç sağlanan. Ancak, Miyokardiyum bağışıklık hücreleri karşılaştırmak için Akış Sitometresi Analizi kullanarak vahşi-tipi bir Batf3- / - fareler, CD103 eksikliği karşı ikinci (Şekil 3A ve B)+ DCs onaylanabilir. Buna ek olarak, biz BATF3-eksikliği önemli ölçüde diğer kardiyak nüfus (Şekil 3C ve D) bileşimi değil değişmek o gözlenen. Bu sonuçlar bir tek hücre süspansiyon ulaşmak için enzimatik ve mekanik sindirim kombine bu yöntemi kullanarak elde edilebilir duyarlılık derecesini örnekler.
Resim 1 : Kalp makrofajlar ve DCs için strateji geçişi. C57BL/6 fareler gelen izole kalp açıklandığı gibi sindirmek ve tek hücre süspansiyon akış sitometresi tarafından analiz edildi. (A)Gating CD45 + canlı singlet kardiyak hücre. CD45 etiketleme--dan non-immün hücreleri (Yani, cardiomyocytes, endotel hücreleri ve fibroblastlar) çok yüksek düzeyde içeren kardiyak tek hücre homogenate bağışıklık hücreleri tanımlamak için kullanın. SSC-H vs karşılaştırarak birini dışlamak SSC-A FSC-H vs tarafından takip FSC-A. Not: Diğer bir karşılaştırma SSC-A, SSC-H ve SSC-W veya FSC-A, FSC-H ve FSC-W arasında benzer şekilde yararlı. Canlı hücrelerin seçimini çok küçük hücreler (SSC-H vs FSC-H kapısı) hariç tarafından gerçekleştirilir. (B) ölü hücre dışlama boyama (DAPI) boyutu vs canlılığı kullanarak karşılaştırılması. (C) kardiyak makrofajlar tanımlaması için strateji geçişi (CD11b+ CD64+ hücreleri) ve DCs (CD64- MHC-IIMerhaba CD11c+). Kardiyak makrofajlar daha da sınıflandırılabilir MHC-II onların ifade üzerinde temel alan ve CD11c. kardiyak DCs alt onların ifade CD103 veya CD11b. (D) temsilcisi araziler makrofaj ve DC içindeki DAPI + ölü hücreleri temel küçük boyutlu dışlama sonra bölmeleri. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 :, Damar içi etiketleme hücreleri kirletici. Damar içi CD45 kan nötrofil ve Ly6CMerhaba monosit anti-CD45 antikor olarak etiketleme(a)karşılaştırma (kırmızı) tedavi ya da tedavi olmayan (mavi) fareler. (B) CD45 damar içi etiketleme tarafından kardiyak bir hazırlık intravasküler kirletici madde tanımlaması. (C) temsilcisi akışı miyokard ve intravasküler hücrelerinin çizer. (D) temsilcisi araziler makrofaj ve DC bölmeleri anti-CD45 damardan yönetim sonra içindeki etiketli hücreleri. Makrofajlar ve DCs sadece extravascular olduğunu unutmayın. Damar içi kirletici maddeler genellikle lenfosit, monosit ve nötrofil2vardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Kalp makrofajlar ve DCs BATF3-eksik farelerde quantification. (A)temsilcisi akışı araziler Batf3kardiyak DC'lerin+/ + ve Batf3- / - fareler. (B) miktar Batf3kardiyak DC'lerin+/ + ve Batf3- / - fareler. CD103 biri olmadığına dikkat edin+ Batf3- / - farelerde DCs. (C ve D) kardiyak makrofajlar (MF) Batf3miktar+/ + ve Batf3- / - fareler. Hata çubukları SEM kırmızı sembolleri temsil bireysel hayvanlar temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Miyokardiyal iltihap veya miyokardit, en kalp-damar hastalıkları bir özelliktir. Ancak, Miyokardiyum sigara hastalık durumlarında kendi bağışıklık bileşenlerinde yoksun değildir. Kararlı duruma sırasında birçok bağışıklık hücreleri Miyokardiyum içinde bulunan ve bakım ve koruma önemli rol oynarlar. Bu farklı nüfus hücrelerin karakterizasyonu bu protokol için sunulan bir gibi yöntemleri olmadan mümkün olmazdı.
Miyokardiyum mekanik ve enzimatik sindirim bir arada analiz, akış sitometresi veya immunomagnetic boncuk yalıtım gibi diğer yöntemleri ile birlikte kullanılan bir tek hücre süspansiyon yalıtım izin verir. Mevcut yöntemi ile ilgili birkaç önemli noktalar dikkate alınması gerekir. İlk olarak, tüm bizim analizleri Miyokardiyum içinde nüfus başvurur; Bu özel kendi idiosyncrasies kurcalayarak olarak kulakçık bizim çözümleme dışı bırakmak. İkinci olarak, kullanılan enzimler miktarda aktivite birimleri sindirim enzimleri diğer kaynaklardan kullanarak kurulum yardımcı olarak ifade edilir. Ancak, deneylere optimizasyonu enzimlerin nihai toplama ve zaman sindirim, enzim sınırlama hücre verim önemli ölçüde azaltabilir ve çok fazla sindirim büyük ölçüde canlılık etkileyebilecek önerilir. Üçüncü olarak, damar içi yönetim etiketli antikor içeren isteğe bağlı adım özellikle nadir nüfus olarak (örneğin, lenfosit, monosit veya nötrofil) normal Miyokardiyum2 veya koşullar altında okurken önerilir ne zaman kan nüfusun numaraları (monocytosis, granulocytosis veya lymphocytosis) değişebilir hangi değişiklikleri bu yöntemi ya da, alternatif olarak, mikroskobu kullanılarak onaylanması gerekmektedir Miyokardiyum içinde yanlış bir izlenim verebilir. Bu hücreler nadiren kan (Şekil 2D) oldukça yüksek miktarlarda bulunur ancak, bu adım sınırlı yarar makrofajlar ya da olgun DCs, analiz ederken gibidir. Yönetilen antikor miktarı optimize etmek önemlidir ve fare, ödün önce kuluçka süresi uzun vadeli kuluçka merkezinde, özellikle iltihaplı bir Miyokardiyum içine bazı antikor difüzyon için izin verebilirsiniz. Son olarak, ana arterler, damarlar ve veya akciğer gibi diğer herhangi bir doku kalıntıları ortadan kaldırarak kalbin, izolasyon titiz olmak çok önemlidir. Bu kirletici doku çok sayıda kolayca miyokardiyal yerli nüfus maske yapabilirsiniz bağışıklık hücreleri yüksek sahip.
Ölü hücreleri dışlanması gerçekleştirmek çok önemli, olup canlılığı boya kullanarak veya küçük boyutlu dışlama Akış Sitometresi Analizi sırasında sindirim (veya doku hasarı hastalık modelleri) olarak ölü hücreleri nispeten büyük miktarda neden olabilir. Ölü hücre dışlama boyutu ve canlılığı etiket (Şekil 1B ve D), kullanma verimliliğini karşılaştırıldığında var çevre denklik gösteren. Önemlisi, bu yordamı hücre boyutunu önemli ölçüde indirgeyerek boyutu dışlama fiksasyon ve permeabilization sonra kullanılamaz.
Autofluorescence nadiren kardiyak makrofajlar akış sitometresi kullanarak tanımlamak için bir sorun olsa da, bu daha önemli bir sorun bazı işaretler, özellikle fluorochromes yüksek enerji () tarafından heyecan ile ifade karakterize etmek çalışırken temsil eder daha kısa) ışık dalga boylarında (350-500 nm). Bu deneylerde izotip denetimleri kullanın, mavi ve mor lazerler (floresein isothiocyanate, phycoerythrin, Pasifik mavi/parlak mor 421) önlemek ve emisyon 600 yukarıda fluorochromes kullanım önerilir nm, allophycocyanin gibi.
İletişim kurallarının kullanımını burada sunulan bir edebiyat giderek artan miktarda yoğunluğu ve değerlendirilmesi ve kardiyovasküler hastalık sonuçları karakterize iltihap türünü rolü tanımlayan iş daha önemli hale gelmektedir. Bu yöntem yüksek düzeyde hücre karakterizasyonu Histoloji daha izin verir. Örneğin, soy izleme makrofajlar onların programlanmış farklı işlevleri2ile ontogenically farklı alt kümelerine tanımlanması için izin kullanımı. Benzer şekilde, bu yöntem miyokardiyal enflamasyon sırasında T hücre yanıt çalışırdım ve T hücre polarizasyon8çalışmaya ex vivo stimülasyon ile kombine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser Kanada Enstitüleri Sağlık Araştırma tarafından (148808 ve 148792) desteklenmiştir, SE bir kalp ve inme Vakfı, personel Ödülleri İstanbul İl Office, Mart Dimes, kalp araştırma ve Peter Munk Ted Rogers Merkezi tarafından desteklenmiştir Kalp Merkezi. XCC bir CIHR Banting bursu tutar. LA bir kalp ve inme/Richard Lewar öğrencilik Ödülü almıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | Wisent | 311-010-CL | 1x PBS |
| 21 G x 1 1/2 (0.8 mm x 40 mm) PrecisionGlide Needle | BD | 305167 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Wisent | 311-511-CL | 1x HBSS |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503-50G | |
| Bovine serum | Sigma | B9433 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid | BioShop | EDT111 | |
| Vacuum filter , 0.2 µm Filtropur V50 | Sarstedt | 83.1823.001 | |
| 28 G 1/2 1 cc insulin syringe | BD | 329424 | |
| 60 mL syringe | BD | 309653 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Wisent | 319-005-CL | 1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | from Clostridium histolyticum |
| Hyaluronidase type I-S | Sigma | H3506 | |
| DNase-I | Sigma | D4513 | from bovine pancreas |
| Cell strainer, 40 µm Nylon | Falcon | 352340 | |
| Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer | Lonza | 10-546E | |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b | Biolegend | 101222 | 1:250 dilution |
| APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c | Biolegend | 128025 | 1:250 dilution |
| APC anti-mouse CD103 | Biolegend | 121414 | 1:250 dilution |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c | Biolegend | 117334 | 1:250 dilution |
| PE anti-mouse Ly-6G | Biolegend | 127607 | 1:250 dilution |
| Pacific Blue anti-mouse I-Ab | Biolegend | 116422 | 1:250 dilution |
| FITC anti-mouse CD64 (FcgRI) | Biolegend | 139315 | 1:250 dilution |
| PE/Cy7 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103113 | 1:250 dilution |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103132 | 1:40 dilution |
| TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| True-Stain Monocyte Blocker | Biolegend | 426101 | 1:20 dilution |
| FlowJo V10 | TreeStar Inc | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
| Mouse: Batf3-/- | The Jackson Laboratory | JAX: 013755 |
References
- Marboe, C. C., Fenoglio, J. J. Pathology and natural history of human myocarditis. Pathology and Immunopathology Research. 7 (4), 226-239 (1988).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Pinto, A. R., et al. An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile. PLoS One. 7 (5), 36814 (2012).
- Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).
- Fujiu, K., Wang, J., Nagai, R. Cardioprotective function of cardiac macrophages. Cardiovascular Research. 102 (2), 232-239 (2014).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Nahrendorf, M., et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).
- Clemente-Casares, X., et al. A CD103(+) Conventional Dendritic Cell Surveillance System Prevents Development of Overt Heart Failure during Subclinical Viral Myocarditis. Immunity. 47 (5), 974-989 (2017).
- Van der Borght, K., et al. Myocardial Infarction Primes Autoreactive T Cells through Activation of Dendritic Cells. Cell Reports. 18 (12), 3005-3017 (2017).
- Galkina, E., et al. Preferential migration of effector CD8+ T cells into the interstitium of the normal lung. Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3473-3483 (2005).
- Edelson, B. T., et al. Peripheral CD103+ dendritic cells form a unified subset developmentally related to CD8alpha+ conventional dendritic cells. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 823-836 (2010).
