Cellulaire senescentie is de belangrijkste factor in de ontwikkeling van chronische leeftijdsgebonden pathologieën. Identificatie van therapeutische middelen die gericht zijn op senescentie cellen tonen belofte voor het verlengen van gezonde veroudering. Hier presenteren we een nieuwe assay voor de identificatie van senotherapeutica op basis van meting van senescentie geassocieerde β-galactosidase activiteit in enkelvoudige cellen.
Cell senescentie is een van de kenmerken van veroudering bekend om een negatieve invloed op een gezonde levensduur. Geneesmiddelen die in staat zijn om de senescentie cellen te doden, specifiek in de celcultuur, de zogenaamde senolytica, kunnen de senescentie-celbelasting in vivo verminderen en de healthspan verlengen. Er zijn tot nu toe meerdere klassen van senolytica geïdentificeerd, waaronder HSP90 remmers, bcl-2 familie remmers, piperlongumine, een FOXO4 remmende peptide en de combinatie van Dasatinib/quercetine. Detectie van SA-β-gal bij een verhoogde lysosomale pH is een van de best gekenmerkte markers voor de detectie van senescentie cellen. Levende celmetingen van senescentie-geassocieerde β-galactosidase (SA-β-Gal) activiteit met behulp van het fluorescerende substraat C12FDG in combinatie met de bepaling van het totale aantal cellen met behulp van een DNA intercalating Hoechst Dye opent de mogelijkheid om scherm voor senotherapeutische geneesmiddelen die ofwel de algehele SA-β-gal-activiteit verminderen door het doden van senescentie cellen (senolytica) of door het onderdrukken van SA-β-gal en andere fenotypes van senescentie cellen (senomorfen). Het gebruik van een high-content fluorescerende beeld acquisitie-en analyseplatform zorgt voor de snelle screening van medicijn bibliotheken met een hoge doorvoer voor effecten op SA-β-gal, celmorfologie en celnummer.
Cellulaire senescentie werd voor het eerst beschreven door Leonard Hayflick en Paul Moorhead, die liet zien dat normale cellen een beperkt vermogen hadden om te vermenigvuldigen in cultuur1. Senescentie cellen niet te vermenigvuldigen ondanks de aanwezigheid van voedingsstoffen, groeifactoren en gebrek aan contact remming, maar blijven metabosch actief2. Dit fenomeen staat bekend als replicatief senescentie en werd voornamelijk toegeschreven aan de telomeer verkorting, althans in menselijke cellen3. Verdere studies hebben aangetoond dat cellen ook kunnen worden geïnduceerd om senescentie te ondergaan in reactie op andere stimuli, zoals oncogene stress (oncogene geïnduceerde senescentie, OIS), DNA-beschadiging, cytotoxische geneesmiddelen of bestraling (stress geïnduceerde senescentie, SIS)4 , 5 , 6. als reactie op DNA schade, met inbegrip van telomeer erosie, cellen ofwel senesce, start ongecontroleerde celgroei, of ondergaan apoptosis als de schade niet kan worden hersteld. In dit geval, cel senescentie lijkt te zijn gunstig als het werkt in een tumor suppressieve manier2. In tegenstelling, senescentie wordt verhoogd met veroudering als gevolg van de accumulatie van cellulaire schade met inbegrip van DNA-schade. Aangezien senescentie cellen cytokines kunnen afscheiden, matrixmetalloproteïnases en groeifactoren, aangeduid als de senescentie-geassocieerde secretoire fenotype (sasp), deze leeftijd afhankelijke toename van cellulaire senescentie en sasp draagt bij aan verminderde weefselhomeostase en vervolgens veroudert. Ook is deze leeftijdsafhankelijke toename van de senescentie last bekend voor het opwekken van metabole ziekten, stress gevoeligheid, Progeria syndromen en verstoorde genezing7,8 en is, deels, verantwoordelijk voor de talrijke leeftijdsgebonden ziekten, zoals atherosclerose, artrose, gespierde degeneratie, zweervorming, en de ziekte van Alzheimer9, 10,11,12,13. Het elimineren van senescentie cellen kan helpen om weefsel disfunctie te voorkomen of vertragen en healthspan14uit te breiden. Dit is aangetoond in transgene muismodellen14,15,16 en door gebruik te maken van senolytische geneesmiddelen en combinaties van geneesmiddelen die werden ontdekt door zowel de screening van de drug en bioinformatische analyse van trajecten specifiek geïnduceerd in de senescentie cellen17,18,19,20,21,22. Het identificeren van meer optimale senotherapeutische geneesmiddelen, in staat om de senescentie-celbelasting effectiever te verminderen, is een belangrijke volgende stap in de ontwikkeling van therapeutische benaderingen voor gezonde veroudering.
De senescentie cellen vertonen karakteristieke fenotypische en moleculaire kenmerken, zowel in de cultuur als in vivo. Deze senescentie markers kunnen ofwel de oorzaak of het resultaat zijn van senescentie inductie of een bijproduct van moleculaire veranderingen in deze cellen. Er wordt echter geen enkele marker specifiek gevonden in de senescentie cellen. Op dit moment, senescentie-geassocieerde β-galactosidase (SA-β-Gal) detectie is een van de meest gekarakteriseerde en gevestigde eencellige methoden voor het meten van senescentie in vitro en in vivo. SA-β-Gal is een lysosomale hydrolase met een optimale enzymatische activiteit bij pH 4. Het meten van zijn activiteit bij pH 6 is mogelijk, omdat de senescentie cellen een verhoogde lysosomale activiteit vertonen23,24. Voor levende cellen wordt een verhoogde lysosomale pH verkregen door lysosomale alkalisatie met de vacuole H+-ATPase-remmer bafilomycine a1 of de endosomale verzuring remmer chloroquine25,26. 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside (C12FDG) wordt gebruikt als substraat in levende cellen als het behoudt het gecleaved product in de cellen als gevolg van de 12 Carbon lipofiele stof25. Belangrijk is dat de SA-β-gal-activiteit zelf niet rechtstreeks verbonden is met een in de senescentie cellen geïdentificeerd traject en niet noodzakelijk is voor het induceren van senescence. Met deze test kunnen senescentie cellen worden geïdentificeerd, zelfs in heterogene celpopulaties en verouderings weefsels, zoals huid biopsieën van oudere individuen. Het is ook gebruikt om een correlatie tussen cel senescentie en veroudering van23 te laten zien, omdat het een betrouwbare marker is voor het detecteren van sencentie cellen in verschillende organismen en voorwaarden27,28,29, 30. Hier wordt een hoge doorvoer van de SA-β-gal-screeningtest op basis van het fluorescerende substraat C12FDG met behulp van primaire muis embryonale fibroblasten (mef’s) met robuuste oxidatieve stress geïnduceerde celsenescentie beschreven en de voor-en nadelen ervan worden besproken. Hoewel deze test kan worden uitgevoerd met verschillende celtypen, het gebruik van Ercc1-deficiënte, DNA-herstel verminderde mefs zorgt voor een snellere inductie van senescentie onder omstandigheden van oxidatieve stress. Bij muizen, verminderde expressie van de DNA-reparatie endonuclease ERCC1-XPF veroorzaakt verminderde DNA-herstel, versnelde accumulatie van endogene DNA-schade, verhoogde ROS, mitochondriale disfunctie, verhoogde senescentie celbelasting, verlies van stamcel functie en vroegtijdige veroudering, vergelijkbaar met natuurlijke veroudering31,32. Evenzo ondergaan Ercc1-deficiënte mef’s sneller senescentie in cultuur17. Een belangrijk kenmerk van de senescentie-MEF-test is dat elk goed een mengsel van senescentie-en niet-senescentie cellen heeft, waardoor een duidelijke demonstratie van senescentie-celspecifieke effecten mogelijk is. Hoewel we geloven dat het gebruik van oxidatieve stress in primaire cellen voor het opwekken van senescentie meer fysiologisch is, kan deze test ook worden gebruikt met cellijnen waar senescentie wordt geïnduceerd met DNA-schadelijke agentia zoals Etoposide of bestraling.
SA-β-Gal is een goed gedefinieerde biomarker voor cellulaire senescentie die oorspronkelijk werd ontdekt door Dimri et al. (1995) waaruit blijkt dat senescentie menselijke fibroblasten de activiteit van SA-β-gal hebben verhoogd bij een aanval op pH 623 in vergelijking met prolifererende cellen. Ondertussen zijn in vitro en in vivo analyse voor sa-β-gal vastgesteld voor verschillende celtypen en weefsels25,39,<sup cla…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door NIH grants AG043376 (project 2 en Core A, PDR; Project 1 en Core B, LJN) en AG056278 (project 3 en Core A, PDR; en project 2, LJN) en een subsidie van de Glenn Foundation (LJN).
DMEM | Corning | 10-013-CV | medium |
Ham's F10 | Gibco | 12390-035 | medium |
fetal bovine serum | Tissue Culture Biologics | 101 | serum |
1x non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | amino-acids |
bafilomycin A1 | Sigma | B1793 | lysosomal inhibitor |
C12FDG | Setareh Biotech | 7188 | b-Gal substrate |
Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | DNA intercalation agent |
17DMAG | Selleck Chemical LLC | 50843 | HSP90 inhibitor |
InCell6000 Cell Imaging System | GE Healthcare | High Content Imaging System |