SA-β-Galaktosidase-basert screening analysen for identifisering av Senotherapeutic narkotika

Summary

Cellular senescence er nøkkelen faktor i utviklingen av kroniske alder-relaterte patologi. Identifisering av legemiddel selskap som mål senescent celler viser løftet for å forlenge sunn aldring. Her presenterer vi en roman analysen til skjermen for identifisering av senotherapeutics basert på måling av senescence knyttet β-Galaktosidase aktivitet i enkeltceller.

Abstract

Cell senescence er et av kjennetegnene på aldring kjent for å negativt påvirke en sunn levetid. Narkotika i stand til å drepe senescent celler spesielt i cellekultur, betegnet senolytics, kan redusere senescent celle byrden i vivo og forlenge healthspan. Flere klasser av senolytics har blitt identifisert hittil inkludert HSP90 hemmere, BCL-2 familie hemmere, piperlongumin, en FOXO4 hemmende peptid og kombinasjonen av dasatinib/quercetin. Påvisning av SA-β-gal ved økt lysosomal pH er en av de beste karakterisert markører for påvisning av senescent celler. Live celle målinger av senescence-assosiert β-galaktosidase (SA-β-gal) aktivitet ved hjelp av fluorescerende substrat C₁₂FDG i kombinasjon med fastsettelse av det totale celle tallet ved hjelp av en DNA interkalering Hoechst Dye åpner muligheten til å skjermen for senotherapeutic medikamenter som enten redusere total SA-β-gal aktivitet ved å drepe av senescent celler (senolytics) eller ved å undertrykke SA-β-gal og andre fenotyper av senescent celler (senomorphics). Bruk av et høyt innhold fluorescerende bildeoppkjøp og analyseplattform gjør det mulig for rask, høy gjennomstrømming screening av stoffet bibliotekene for effekter på SA-β-gal, celle morfologi og celle nummer.

Introduction

Cellular senescence ble beskrevet for første gang av Leonard Hayflick og Paul Moorhead, som viste at normale celler hadde en begrenset evne til å spre i kultur¹. Senescent celler ikke sprer seg til tross for tilstedeværelsen av næringsstoffer, vekstfaktorer og mangel på kontakt hemming, men forblir metabolically aktiv². Dette fenomenet er kjent som replicative senescence og ble hovedsakelig tilskrevet telomere forkortelse, i hvert fall i humane celler³. Videre studier har vist at celler kan også bli overtalt til å gjennomgå senescence som svar på andre stimuli, slik som kreftfremkallende stress (diagnostisk indusert senescence, OIS), DNA skade, cytotoksisk narkotika, eller bestråling (stress indusert senescence, SIS)^{4 , 5} andre priser ^{, 6}. som svar på DNA-skade, inkludert telomere erosjon, celler enten senesce, starte ukontrollert cellevekst, eller gjennomgå apoptose Hvis skaden ikke kan repareres. I dette tilfellet, celle senescence synes å være gunstig som det fungerer i en svulst undertrykkende måte². I kontrast er senescence økt med aldring på grunn av akkumulering av cellulære skader inkludert DNA skade. Siden senescent celler kan skille cytokiner, metalloproteinases og vekstfaktorer, kalt senescence-assosiert sekretoriske fenotype (SASP), denne Aldersavhengige økningen i mobilnettet senescence og SASP bidrar til redusert vev homeostase og senere aldring. Også denne Aldersavhengige økningen i senescence byrde er kjent for å indusere metabolske sykdommer, stress følsomhet, progeria syndromer og svekket helbredelse^7,8 og er, delvis, ansvarlig for de mange alder-relaterte sykdommer, slik som aterosklerose, artrose, muskel degenerasjon, sårdannelse, og Alzheimers sykdom^{9,10,11,12,13}. Eliminere senescent celler kan bidra til å forebygge eller forsinke vevs dysfunksjon og forlenge healthspan¹⁴. Dette har blitt vist i transgene Mouse-modellene^14,15,16 , så vel som ved å bruke senolytic legemidler og legemiddel kombinasjoner som ble oppdaget gjennom både narkotika screening og Bioinformatic analyse av trasé indusert spesielt i senescent celler^{17,18,19,20,21,22}. Identifisere mer optimal senotherapeutic narkotika, i stand til å mer effektivt redusere senescent celle byrde, er et viktig neste skritt i utviklingen av terapeutiske tilnærminger for sunn aldring.

Senescent celler viser karakteristiske fenotypiske og molekylære trekk, både i kultur og in vivo. Disse senescence markører kan være enten årsaken eller resultatet av senescence induksjon eller et biprodukt av molekylære endringer i disse cellene. Men ingen enkelt markør er funnet spesielt i senescent celler. Foreløpig er senescence-assosiert β-galaktosidase (SA-β-gal) deteksjon en av de beste-karakterisert og etablerte single-celle baserte metoder for å måle senescence in vitro og in vivo. SA-β-gal er en lysosomal Hydrolase med en optimal enzymatisk aktivitet ved pH 4. Måling av sin aktivitet ved pH 6 er mulig fordi senescent celler viser økt lysosomal aktivitet^23,24. For levende celler, økt lysosomal pH oppnås ved lysosomal alkalinization med vacuolar H⁺-ATPase inhibitor Bafilomycin a1 eller endosomal forsuring inhibitor Chloroquine^25,26. 5-Dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galaktopyranosid (C₁₂FDG) brukes som substrat i levende celler som den beholder kløyvde produkt i cellene på grunn av sin 12 karbon lipofile moiety²⁵. Viktigere, SA-β-gal aktivitet i seg selv er ikke direkte forbundet med noen sti identifisert i senescent celler og er ikke nødvendig å indusere senescence. Med denne analysen, kan senescent celler identifiseres selv i heterogene celle populasjoner og aldring vev, slik som huden biopsier fra eldre individer. Det har også blitt brukt til å vise en sammenheng mellom celle senescence og aldring²³ som det er en pålitelig markør for senescent celle deteksjon i flere organismer og betingelser²⁷,^{28,29, 30}i det. Her, en høy gjennomstrømning SA-β-gal screening analysen basert på fluorescerende substrat C₁₂FDG hjelp primær mus embryonale fibroblaster (MEFs) med robust oksidativt stress indusert celle senescence er beskrevet og dens fordeler og ulemper diskuteres. Selv om denne analysen kan utføres med ulike celletyper, bruk av Ercc1-mangelfull, DNA reparasjon svekket MEFs muliggjør raskere induksjon av senescence under forhold med oksidativt stress. I mus, redusert uttrykk for DNA-reparasjon endonuclease ERCC1-XPF forårsaker nedsatt DNA-reparasjon, akselerert opphopning av endogene DNA skade, forhøyet ROS, mitokondrie dysfunksjon, økt senescent celle byrde, tap av stilk cellen funksjon og prematur aldring, i likhet med naturlig aldring^31,32. Tilsvarende Ercc1-mangelfull MEFs gjennomgår senescence raskere i kultur¹⁷. En viktig funksjon i senescent MEF analysen er at hver brønn har en blanding av senescent og ikke-senescent celler, slik at for den klare demonstrasjon av senescent celle-spesifikke effekter. Men selv om vi tror at bruk av oksidativt stress i primær celler for å indusere senescence er mer fysiologiske, denne analysen også kan brukes med cellelinjer der senescence er indusert med DNA skadelige stoffer som etoposid eller bestråling.

Protocol

Animal bruk ble godkjent av Scripps Florida institusjonelle Animal Care og use Committee. 1. generering av senescent murine embryonale Fibroblast (MEF) – 12-15 dager Isolere vill type og Ercc1-/- MEFs fra gravide kvinnelige mus på embryonale dag 13 (E13) som beskrevet tidligere33.Merk: alle følgende trinn utføres i en vevs kultur hette under aseptisk forhold og ved bruk av sterile instrumenter. Resect embryo hodet over ø…

Representative Results

SA-β-gal aktivitet kan oppdages i celler som er indusert for å senesce av ulike måter fra replicative utmattelse, gentoksisk og oksidativt stress, til diagnostisk aktivisering23,38. I dagens modell med Ercc1-mangelfull mus embryonale Fibroblast celler, normoxic vekstforhold (20% O2) var tilstrekkelig til å indusere celle senescence etter dyrking av dem for et par passasjer…

Discussion

SA-β-gal er en veldefinert biomarkør for mobilnettet senescence opprinnelig oppdaget av Dimri et al. (1995) viser at senescent menneskelige fibroblaster har økt aktivitet av SA-β-gal når analyseres ved pH 6²³ sammenlignet med voksende celler. I mellomtiden, in vitro og in vivo-analysen for sa-β-gal har blitt etablert for ulike celletyper og vev^25,39,40. Den fluorescens basert enkelt celle m…

Materials

DMEM	Corning	10-013-CV	medium
Ham's F10	Gibco	12390-035	medium
fetal bovine serum	Tissue Culture Biologics	101	serum
1x non-essential amino acids	Corning	25-025-Cl	amino-acids
bafilomycin A1	Sigma	B1793	lysosomal inhibitor
C12FDG	Setareh Biotech	7188	b-Gal substrate
Hoechst 33342	Life Technologies	H1399	DNA intercalation agent
17DMAG	Selleck Chemical LLC	50843	HSP90 inhibitor
InCell6000 Cell Imaging System	GE Healthcare		High Content Imaging System