Summary

SA-β-Galaktosidase-basert screening analysen for identifisering av Senotherapeutic narkotika

Published: June 28, 2019
doi:

Summary

Cellular senescence er nøkkelen faktor i utviklingen av kroniske alder-relaterte patologi. Identifisering av legemiddel selskap som mål senescent celler viser løftet for å forlenge sunn aldring. Her presenterer vi en roman analysen til skjermen for identifisering av senotherapeutics basert på måling av senescence knyttet β-Galaktosidase aktivitet i enkeltceller.

Abstract

Cell senescence er et av kjennetegnene på aldring kjent for å negativt påvirke en sunn levetid. Narkotika i stand til å drepe senescent celler spesielt i cellekultur, betegnet senolytics, kan redusere senescent celle byrden i vivo og forlenge healthspan. Flere klasser av senolytics har blitt identifisert hittil inkludert HSP90 hemmere, BCL-2 familie hemmere, piperlongumin, en FOXO4 hemmende peptid og kombinasjonen av dasatinib/quercetin. Påvisning av SA-β-gal ved økt lysosomal pH er en av de beste karakterisert markører for påvisning av senescent celler. Live celle målinger av senescence-assosiert β-galaktosidase (SA-β-gal) aktivitet ved hjelp av fluorescerende substrat C12FDG i kombinasjon med fastsettelse av det totale celle tallet ved hjelp av en DNA interkalering Hoechst Dye åpner muligheten til å skjermen for senotherapeutic medikamenter som enten redusere total SA-β-gal aktivitet ved å drepe av senescent celler (senolytics) eller ved å undertrykke SA-β-gal og andre fenotyper av senescent celler (senomorphics). Bruk av et høyt innhold fluorescerende bildeoppkjøp og analyseplattform gjør det mulig for rask, høy gjennomstrømming screening av stoffet bibliotekene for effekter på SA-β-gal, celle morfologi og celle nummer.

Introduction

Cellular senescence ble beskrevet for første gang av Leonard Hayflick og Paul Moorhead, som viste at normale celler hadde en begrenset evne til å spre i kultur1. Senescent celler ikke sprer seg til tross for tilstedeværelsen av næringsstoffer, vekstfaktorer og mangel på kontakt hemming, men forblir metabolically aktiv2. Dette fenomenet er kjent som replicative senescence og ble hovedsakelig tilskrevet telomere forkortelse, i hvert fall i humane celler3. Videre studier har vist at celler kan også bli overtalt til å gjennomgå senescence som svar på andre stimuli, slik som kreftfremkallende stress (diagnostisk indusert senescence, OIS), DNA skade, cytotoksisk narkotika, eller bestråling (stress indusert senescence, SIS)4 , 5 andre priser , 6. som svar på DNA-skade, inkludert telomere erosjon, celler enten senesce, starte ukontrollert cellevekst, eller gjennomgå apoptose Hvis skaden ikke kan repareres. I dette tilfellet, celle senescence synes å være gunstig som det fungerer i en svulst undertrykkende måte2. I kontrast er senescence økt med aldring på grunn av akkumulering av cellulære skader inkludert DNA skade. Siden senescent celler kan skille cytokiner, metalloproteinases og vekstfaktorer, kalt senescence-assosiert sekretoriske fenotype (SASP), denne Aldersavhengige økningen i mobilnettet senescence og SASP bidrar til redusert vev homeostase og senere aldring. Også denne Aldersavhengige økningen i senescence byrde er kjent for å indusere metabolske sykdommer, stress følsomhet, progeria syndromer og svekket helbredelse7,8 og er, delvis, ansvarlig for de mange alder-relaterte sykdommer, slik som aterosklerose, artrose, muskel degenerasjon, sårdannelse, og Alzheimers sykdom9,10,11,12,13. Eliminere senescent celler kan bidra til å forebygge eller forsinke vevs dysfunksjon og forlenge healthspan14. Dette har blitt vist i transgene Mouse-modellene14,15,16 , så vel som ved å bruke senolytic legemidler og legemiddel kombinasjoner som ble oppdaget gjennom både narkotika screening og Bioinformatic analyse av trasé indusert spesielt i senescent celler17,18,19,20,21,22. Identifisere mer optimal senotherapeutic narkotika, i stand til å mer effektivt redusere senescent celle byrde, er et viktig neste skritt i utviklingen av terapeutiske tilnærminger for sunn aldring.

Senescent celler viser karakteristiske fenotypiske og molekylære trekk, både i kultur og in vivo. Disse senescence markører kan være enten årsaken eller resultatet av senescence induksjon eller et biprodukt av molekylære endringer i disse cellene. Men ingen enkelt markør er funnet spesielt i senescent celler. Foreløpig er senescence-assosiert β-galaktosidase (SA-β-gal) deteksjon en av de beste-karakterisert og etablerte single-celle baserte metoder for å måle senescence in vitro og in vivo. SA-β-gal er en lysosomal Hydrolase med en optimal enzymatisk aktivitet ved pH 4. Måling av sin aktivitet ved pH 6 er mulig fordi senescent celler viser økt lysosomal aktivitet23,24. For levende celler, økt lysosomal pH oppnås ved lysosomal alkalinization med vacuolar H+-ATPase inhibitor Bafilomycin a1 eller endosomal forsuring inhibitor Chloroquine25,26. 5-Dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galaktopyranosid (C12FDG) brukes som substrat i levende celler som den beholder kløyvde produkt i cellene på grunn av sin 12 karbon lipofile moiety25. Viktigere, SA-β-gal aktivitet i seg selv er ikke direkte forbundet med noen sti identifisert i senescent celler og er ikke nødvendig å indusere senescence. Med denne analysen, kan senescent celler identifiseres selv i heterogene celle populasjoner og aldring vev, slik som huden biopsier fra eldre individer. Det har også blitt brukt til å vise en sammenheng mellom celle senescence og aldring23 som det er en pålitelig markør for senescent celle deteksjon i flere organismer og betingelser27,28,29, 30i det. Her, en høy gjennomstrømning SA-β-gal screening analysen basert på fluorescerende substrat C12FDG hjelp primær mus embryonale fibroblaster (MEFs) med robust oksidativt stress indusert celle senescence er beskrevet og dens fordeler og ulemper diskuteres. Selv om denne analysen kan utføres med ulike celletyper, bruk av Ercc1-mangelfull, DNA reparasjon svekket MEFs muliggjør raskere induksjon av senescence under forhold med oksidativt stress. I mus, redusert uttrykk for DNA-reparasjon endonuclease ERCC1-XPF forårsaker nedsatt DNA-reparasjon, akselerert opphopning av endogene DNA skade, forhøyet ROS, mitokondrie dysfunksjon, økt senescent celle byrde, tap av stilk cellen funksjon og prematur aldring, i likhet med naturlig aldring31,32. Tilsvarende Ercc1-mangelfull MEFs gjennomgår senescence raskere i kultur17. En viktig funksjon i senescent MEF analysen er at hver brønn har en blanding av senescent og ikke-senescent celler, slik at for den klare demonstrasjon av senescent celle-spesifikke effekter. Men selv om vi tror at bruk av oksidativt stress i primær celler for å indusere senescence er mer fysiologiske, denne analysen også kan brukes med cellelinjer der senescence er indusert med DNA skadelige stoffer som etoposid eller bestråling.

Protocol

Animal bruk ble godkjent av Scripps Florida institusjonelle Animal Care og use Committee. 1. generering av senescent murine embryonale Fibroblast (MEF) – 12-15 dager Isolere vill type og Ercc1-/- MEFs fra gravide kvinnelige mus på embryonale dag 13 (E13) som beskrevet tidligere33.Merk: alle følgende trinn utføres i en vevs kultur hette under aseptisk forhold og ved bruk av sterile instrumenter. Resect embryo hodet over ø…

Representative Results

SA-β-gal aktivitet kan oppdages i celler som er indusert for å senesce av ulike måter fra replicative utmattelse, gentoksisk og oksidativt stress, til diagnostisk aktivisering23,38. I dagens modell med Ercc1-mangelfull mus embryonale Fibroblast celler, normoxic vekstforhold (20% O2) var tilstrekkelig til å indusere celle senescence etter dyrking av dem for et par passasjer…

Discussion

SA-β-gal er en veldefinert biomarkør for mobilnettet senescence opprinnelig oppdaget av Dimri et al. (1995) viser at senescent menneskelige fibroblaster har økt aktivitet av SA-β-gal når analyseres ved pH 623 sammenlignet med voksende celler. I mellomtiden, in vitro og in vivo-analysen for sa-β-gal har blitt etablert for ulike celletyper og vev25,39,40. Den fluorescens basert enkelt celle m…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av NIH Grants AG043376 (prosjekt 2 og Core A, PDR; Prosjekt 1 og Core B, LJN) og AG056278 (prosjekt 3 og Core A, PDR, og prosjekt 2, LJN) og et stipend fra Glenn Foundation (LJN).

Materials

DMEM  Corning 10-013-CV medium
Ham's F10 Gibco 12390-035 medium
fetal bovine serum Tissue Culture Biologics 101 serum
1x non-essential amino acids Corning 25-025-Cl amino-acids
bafilomycin A1  Sigma B1793 lysosomal inhibitor
C12FDG Setareh Biotech 7188 b-Gal substrate
Hoechst 33342  Life Technologies H1399 DNA intercalation agent
17DMAG Selleck Chemical LLC 50843 HSP90 inhibitor
InCell6000 Cell Imaging System GE Healthcare High Content Imaging System

References

  1. Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
  2. Campisi, J., di Fagagna, F. D. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (9), 729-740 (2007).
  3. Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature. 345 (6274), 458-460 (1990).
  4. Zhu, J., Woods, D., McMahon, M., Bishop, J. M. Senescence of human fibroblasts induced by oncogenic Raf. Genes and Development. 12 (19), 2997-3007 (1998).
  5. Dimri, G. P., Itahana, K., Acosta, M., Campisi, J. Regulation of a senescence checkpoint response by the E2F1 transcription factor and p14(ARF) tumor suppressor. Molecular and Cellular Biology. 20 (1), 273-285 (2000).
  6. Michaloglou, C., et al. BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi. Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).
  7. Niedernhofer, L. J. Tissue-specific accelerated aging in nucleotide excision repair deficiency. Mechanisms of Ageing and Development. 129 (78), 408-415 (2008).
  8. Gitenay, D., et al. Glucose metabolism and hexosamine pathway regulate oncogene-induced senescence. Cell Death & Disease. 5, e1089 (2014).
  9. Erusalimsky, J. D., Kurz, D. J. Cellular senescence in vivo: its relevance in ageing and cardiovascular disease. Experimental Gerontology. 40 (8-9), 634-642 (2005).
  10. Kassem, M., Marie, P. J. Senescence-associated intrinsic mechanisms of osteoblast dysfunctions. Aging Cell. 10 (2), 191-197 (2011).
  11. Campisi, J., Andersen, J. K., Kapahi, P., Melov, S. Cellular senescence: A link between cancer and age-related degenerative disease. Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 354-359 (2011).
  12. Golde, T. E., Miller, V. M. Proteinopathy-induced neuronal senescence: a hypothesis for brain failure in Alzheimer’s and other neurodegenerative diseases. Alzheimers Research & Therapy. 1 (2), 5 (2009).
  13. Telgenhoff, D., Shroot, B. Cellular senescence mechanisms in chronic wound healing. Cell Death & Differentiation. 12 (7), 695-698 (2005).
  14. Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
  15. Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. , (2016).
  16. Childs, B. G., et al. Senescent intimal foam cells are deleterious at all stages of atherosclerosis. Science. 354 (6311), 472-477 (2016).
  17. Fuhrmann-Stroissnigg, H., et al. Identification of HSP90 inhibitors as a novel class of senolytics. Nature Communications. 8 (1), 422 (2017).
  18. Zhu, Y., et al. New agents that target senescent cells: the flavone, fisetin, and the BCL-XL inhibitors, A1331852 and A1155463. Aging. 9 (3), 955-963 (2017).
  19. Zhu, Y., et al. Identification of a Novel Senolytic Agent, Navitoclax, Targeting the Bcl-2 Family of Anti-Apoptotic Factors. Aging Cell. , (2015).
  20. Zhu, Y., et al. The Achilles’ heel of senescent cells: from transcriptome to senolytic drugs. Aging Cell. , (2015).
  21. Baar, M. P., et al. Targeted Apoptosis of Senescent Cells Restores Tissue Homeostasis in Response to Chemotoxicity and Aging. Cell. 169 (1), 132-147 (2017).
  22. Jeon, O. H., et al. Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nature. , (2017).
  23. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 92 (20), 9363-9367 (1995).
  24. Itahana, K., Campisi, J., Dimri, G. P. Methods to detect biomarkers of cellular senescence: the senescence-associated beta-galactosidase assay. Methods in Molecular Biology. 371, 21-31 (2007).
  25. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-[beta]gal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
  26. Cahu, J., Sola, B. A sensitive method to quantify senescent cancer cells. Journal of Visualized Experiments. 78 (78), (2013).
  27. Collado, M., et al. Tumour biology: Senescence in premalignant tumours. Nature. 436 (7051), 642 (2005).
  28. Krishnamurthy, J., et al. Ink4a/Arf expression is a biomarker of aging. The Journal of Clinical Investigation. 114 (9), 1299-1307 (2004).
  29. Mishima, K., et al. Senescence-associated beta-galactosidase histochemistry for the primate eye. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 40 (7), 1590-1593 (1999).
  30. Melk, A., et al. Expression of p16INK4a and other cell cycle regulator and senescence associated genes in aging human kidney. Kidney International. 65 (2), 510-520 (2004).
  31. Niedernhofer, L. J., et al. A new progeroid syndrome reveals that genotoxic stress suppresses the somatotroph axis. Nature. 444 (7122), 1038-1043 (2006).
  32. Wang, J., Clauson, C. L., Robbins, P. D., Niedernhofer, L. J., Wang, Y. The oxidative DNA lesions 8,5′-cyclopurines accumulate with aging in a tissue-specific manner. Aging Cell. 11 (4), 714-716 (2012).
  33. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (64), (2012).
  34. Jagannathan, L., Cuddapah, S., Costa, M. Oxidative stress under ambient and physiological oxygen tension in tissue culture. Current Pharmacology Reports. 2 (2), 64-72 (2016).
  35. Meuter, A., et al. Markers of cellular senescence are elevated in murine blastocysts cultured in vitro: molecular consequences of culture in atmospheric oxygen. J Assist Reprod Genet. 31 (10), 1259-1267 (2014).
  36. Robinson, A. R., et al. Spontaneous DNA damage to the nuclear genome promotes senescence, redox imbalance and aging. Redox Biology. 17, 259-273 (2018).
  37. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal Of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  38. Zhao, H., Darzynkiewicz, Z. Biomarkers of cell senescence assessed by imaging cytometry. Methods in Molecular Biology. 965, 83-92 (2013).
  39. Yang, N. -. C., Hu, M. -. L. A fluorimetric method using fluorescein di-β-d-galactopyranoside for quantifying the senescence-associated β-galactosidase activity in human foreskin fibroblast Hs68 cells. Analytical Biochemistry. 325 (2), 337-343 (2004).
  40. Zhao, J., et al. Quantitative Analysis of Cellular Senescence in Culture and In Vivo. Current Protocols in Cytometry. 79, (2017).
  41. Capparelli, C., et al. CDK inhibitors (p16/p19/p21) induce senescence and autophagy in cancer-associated fibroblasts, "fueling" tumor growth via paracrine interactions, without an increase in neo-angiogenesis. Cell Cycle. 11 (19), 3599-3610 (2012).
  42. Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annual Review of Pathology. 5, 99-118 (2010).
  43. Mah, L. J., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. GammaH2AX as a molecular marker of aging and disease. Epigenetics. 5 (2), 129-136 (2010).
  44. Hewitt, G., et al. Telomeres are favoured targets of a persistent DNA damage response in ageing and stress-induced senescence. Nature Communications. 3, 708 (2012).
  45. Narita, M., et al. Rb-mediated heterochromatin formation and silencing of E2F target genes during cellular senescence. Cell. 113 (6), 703-716 (2003).
  46. Georgakopoulou, E. A., et al. Specific lipofuscin staining as a novel biomarker to detect replicative and stress-induced senescence. A method applicable in cryo-preserved and archival tissues. Aging-Us. 5 (1), 37-50 (2013).
  47. Severino, J., Allen, R. G., Balin, S., Balin, A., Cristofalo, V. J. Is β-Galactosidase Staining a Marker of Senescence in Vitro and in Vivo?. Experimental Cell Research. 257 (1), 162-171 (2000).

Play Video

Cite This Article
Fuhrmann-Stroissnigg, H., Santiago, F. E., Grassi, D., Ling, Y., Niedernhofer, L. J., Robbins, P. D. SA-β-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs. J. Vis. Exp. (148), e58133, doi:10.3791/58133 (2019).

View Video