Summary
여기, 선물이 비보 전 폐 암 모델을 모방한 종양 진행의 단계 및 기본 종양을 격리 하는 데 도움이 프로토콜 순환 종양 세포, 및 전이성 병 변.
Abstract
종양 진행의 다른 지점에서 종양 세포를 분리 하는 것이 어렵습니다. 우리는 비보 전 폐 모델 자연 매트릭스와 종양 세포의 상호 작용 및 영양분의 지속적인 흐름이 보여줄 수 있는 뿐만 아니라 정상적인 세포 구성 성분으로 종양 세포의 상호 작용 및 자연 매트릭스 모델을 만들었습니다. Acellular 비보 전 폐 모델 쥐 심장-폐 블록 분리 및 decellularization 프로세스를 사용 하 여 모든 셀을 제거 하 여 만들어집니다. 오른쪽 주 기관지에서 연결 하 고 종양 세포를 주사기에 의해 기관에 배치 됩니다. 셀을 이동 하 고 왼쪽된 폐. 폐 폐 동맥 폐쇄 회로에 미디어의 지속적인 흐름을 받는 생물에 배치 됩니다. 왼쪽된 폐에 성장 하는 종양은 1 차 종양. 순환 미디어에 격리 되어 종양 세포는 종양 세포를 순환 하 고 오른쪽 폐에 종양 세포는 전이성 병 변. 세포질 비보 전 폐 모델 decellularization 과정을 건너뛰는 의해 만들어집니다. 각 모델은 다른 연구 질문에 대답을 사용할 수 있습니다.
Introduction
암 전이 대부분 암 관련 된 죽음 뒤에 범인 하 고 암을 싸우는 노력에 궁극적인 도전 포즈. 이 방법의 전반적인 목표는 3 차원 (3 차원) 세포 성장 뿐만 아니라 흐름의 차원 4 차원 (4d) 세포 문화 프로토콜을 디자인 하는 것입니다. 그것은 전이 과정 [즉, 주 종양, 순환 종양 세포 (CTCs), 및 전이성 병 변]의 세 가지 단계를 나타냅니다.
지난 3 년간 전세계의 과학자 들은 다른 암 치료 또는 진행 없는 생존의 가능성을 향상에 전이성 진행을 기본 메커니즘을 이해 하는 정보 비교할 수 없는 풍부한 나왔고. 일부 암, 유방암, 등의 임상 관리 개선 크게1; 그러나, 폐 암 등 일부 암에는 여전히 가난한 생존2있다. 생체 외에서 그리고 vivo에서 동물 모델에 새로운 통찰력을 질병의 발전을 지탱 하는 메커니즘을 생성 되었습니다. 지난 몇 년 동안, 셀 라인 파생 xenografts (CDX) 및 환자 파생 xenografts (PDX)의 더 많은 관심으로 그들이 조직학 특징, 행동 기본 인간 종양3, 성장 속도 등 많은 관련 기능을 유지 되었습니다. 특성, 그리고 치료에 대 한 응답입니다. 그러나, 각 모델에는 CTC 형성 및 전이를 먼 기관4,,56의 메커니즘을 이해 하는 제한이 있습니다.
최근, 우리 기관 재설계 및 관류 기반 세포 배양의 개념을 이용 하 여 4 차원 비보 전 폐 암 모델 개발. 비슷한 인간 암 분 비와 함께 시간이 지남에 성장 perfusable 종양 작은 혹을 형성 하 여 인간의 폐 암 성장을 모방 단백질 생산7. 그것은 암 환자에서 가난한 생존 예측 나타나고 또한 치료 응답 cisplatin 치료8,9시 종양 회귀에 의해 유전자 표현 서명을 나타냅니다. 그것은 전이성 병 변 형성할 수 있도록 폐 모델 수정 추가 했습니다. CTCs는 맥 관 구조에 기본 종양과 intravasate에서 개발 하 고 전이성 병 변10를 contralateral 폐로 extravasate. 유전자 표현 연구 기본 종양, CTCs, 전이성 병 변의 독특한 식 프로필 형10에 필요한 유전자의 부분 집합의 upregulation를 하시기 바랍니다. 이 전이 과정 생물 학적 조건 암 환자에서의 존재로 인해 발생 합니다. 이 모델의 장점은 자연 매트릭스 및 건축의 존재와 종양 작은 혹의 형성에 이르게 하는 양분의 살포. 또한, 그것은 또한 시간이 지남에 종양 진행에 종양 microenvironment 또는 약의 다른 성분의 효과 공부 하는 기회를 제공 합니다. 이 모델은 실험실 설정에서 암 세포 (폐암, 유방암, 육 종 등)의 범위를 성장 사용할 수 있습니다.
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Protocol
동물 실험에 대 한 프로토콜 기관 동물 관리 및 사용 위원회 휴스턴 감리교 연구소에 의해 승인 하 고 모든 규정, 법령, 지침 및 정책에 따라 수행 했다.
1. 쥐 폐 수확
- 케 타 민 (100mg/kg) 및 xylazine (10 mg/kg)의 측면에서의 복 (IP) 주입에 의해 4에 6-1 주일-오래 된 남성 Sprague-Dawley 쥐를 anesthetize. 뒷 다리 발가락 집게로 슬쩍 때 움직임의 부재를 확인 하 여 마 취를 확인 합니다.
- 10 분 후 가슴 및 복 부를 면도 하 고 액체 면봉으로 피부를 닦아냅니다.
- 집게와을 따기로 일회용 메스와 incising에 의해 피부를 제거 합니다. 메스와 incising에 의해 흉 강을 연 후가 위로 왼쪽 흉 곽의 앞쪽 측 및 횡 경 막의 오른쪽을 절단 하 여 양자 thoracotomy를 수행 합니다.
참고: 이것은 비 생존 수술입니다. - 흉 곽을 잡고 고 27 G 바늘을 사용 하 여 뛰는 심장의 우 심 실에 헤 파 린 (1000 단위/mL)의 2 개 mL를 주입.
참고:이 폐에 혈전의 어떤 형성이 되지 것입니다. - 완전히가 위 흉 곽을 제거 하 고 혈액이 밖으로 나오는 때까지 환기, 좌 심 실에서 18 G 바늘 장소. 그런 다음, 25g 바늘을 사용 하 여 우 심 실에 heparinized 인산 염 버퍼 염 분 (12.5 단위/mL; heparinized PBS)의 15 mL를 주사.
- 열 등 하 고 우량한 베 나 카바, 심장의 오른쪽에 두 개의 큰 혈관 고 heparinized PBS 27g 바늘을 사용 하 여 우 심 실에서의 추가 10 mL와 폐를 플러시.
참고: 열 등 한 베 나 정 맥의 큰 그릇으로 마음의 바닥에서 시각 이다 붉은 혈액으로 가득. 마찬가지로, 뛰어난 베 나 정 맥은 큰 그릇으로 심장의 위쪽 부분에 시각. - 갑 상선에 기도 잘라. 조심 스럽게 제거 hemiazygos 정 맥 및 아치에 대동맥의 분 지의 수준에서 하강 대동맥.
- 흉 강 쥐 시체의 나머지 부분에서 심장-폐 블록을 가져가 라.
- 오른쪽과 왼쪽 심의 절반 절단 하 여 수행 하는 ventriculotomy 고 주문 품 prefilled 18 G-스테인리스 바늘 정 우 심 실을 통해 주요 폐 동맥 (PA) 합니다.
- 2-0 실크 넥타이 정을 보호 하 고 신중 하 게 노출 우 심 실 및 심 방.
- 좌 심 실에 여성 Luer 칸막이 배치 하 고 2-0 실크 넥타이와 그것을 확보.
- PA 정 통해 heparinized PBS의 20 mL와 심장-폐 블록을 플러시 하 고 문화 미디어 또는 heparinized PBS 포함 50 mL 튜브에.
참고: 휴대 전화 모델에 대 한 단계는 생물 반응 기를 설정 하는 3.1로 이동 합니다. Acellular 모델는 decellularization에 대 한 2.1 단계로 진행 합니다.
2. 폐 Decellularization
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Decellularization 단위의 준비
- 병 뚜껑에 두 개의 구멍을 관통 하 고 여성 루어 (그림 1A 및 1B) 구멍에 스냅 하 여 각 decellularization 챔버/병을 준비 합니다. 다른 쪽에 검은 나일론 반지와 보안. 마찬가지로, 정 맥 설정된 첨부 파일 (그림 1C)에 대 한 또 다른 병 뚜껑에 단일 구멍을 드릴 합니다.
참고: 그림 1A 및 1B 의 두 가지 측면에서 동일한 병 뚜껑 있습니다. 그림 1C 단계 2.1.1에서에서 위에서 말한 바와 같이 단일 구멍 다른 모자입니다. - (그림 1A 및 1B) 병 뚜껑 내부에서 여성 루어를 0.5 인치 튜브 (에 폐 동맥 또는 PA 끝) 및 6 인치 튜브 (그림 1J)를 연결 하 고 연결 끝에 남성 Luer 잠금. Decellularization 챔버/병 500 mL 병으로 잠금을 설정 합니다.
- 여성 루어와 카트리지 (그림 1G)에 의해 펌프 헤드 (그림 1E , 1F)에 붙어 있는 펌프 튜브 (그림 1 H)의 어느 끝에 (남성 Luer 잠금 연결 되)는 두 개의 2 피트 튜브의 한쪽 끝을 연결 잠금 (그림 1I) 합니다.
- 2 피트 튜브 (2.1.3 단계)에서 각 decellularization 챔버/병 뚜껑 (그림 1 L)에 여성 Luer 자물쇠 머리의 다른 끝을 연결 합니다.
- 250 mL 설정 heparinized PBS (PBS의 200 mL)와 함께 병 병 뚜껑 및 decellularization c에 연결 된 2 피트 튜브 교체 선단부에 삽입 정 맥 세트 (그림 1D)의 근 위 끝으로 스탠드에 거꾸로 병 거 여 hamber/병 PA 끝 (그림 1B). 난 병이 2 피트 튜브를 연결 합니다.
참고: 병 설정 됩니다 마분지에 그림 1과 같이. 정 맥 관 폐 비 계에 시 약을 분배 하 거 병 온다.
- 병 뚜껑에 두 개의 구멍을 관통 하 고 여성 루어 (그림 1A 및 1B) 구멍에 스냅 하 여 각 decellularization 챔버/병을 준비 합니다. 다른 쪽에 검은 나일론 반지와 보안. 마찬가지로, 정 맥 설정된 첨부 파일 (그림 1C)에 대 한 또 다른 병 뚜껑에 단일 구멍을 드릴 합니다.
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폐 decellularization 프로세스
- Decellularization 챔버/병에서 자유롭게 흐름 때까지 30 mm Hg (그림 1 K)의 생리 관류 압력 heparinized PBS를 실행 하 고, 다음, 파 정을 통해 PA 끝에 심장-폐 블록을 연결.
- Decellularization 챔버/병 안에 어떤 초과 버퍼/솔루션 삭제 되 면 펌프를 지속적으로, 실행을 유지.
- 통해 초기 세척 (그림 1 K)에 대 한 30 mm Hg의 관류 압력에 15 분 동안 PA heparinized PBS를 실행 합니다.
- 0.1% 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS)에 이온된 수와 heparinized PBS 병을 장착 하 고 perfuse는 decellularization에 대 한 2 시간에 대 한 폐.
- Decellularization, 후 15 분 동안 폐 비 계를 통해 이온된 압력가 수 perfuse.
- 그런 다음, perfuse 이온된 수 10 분에 1% 비 이온 세제.
- Decellularization 챔버/병 걸려 폐 병 내부 캡으로 그대로 유지 압력가 PBS 1 x 항생제 (페니실린 스 암포), 보충의 500 mL 바꿉니다.
- 정 맥, decellularization 챔버의 폐 동맥 끝에 다시 버린 컨테이너에 연결 된 2 피트 튜브를 넣어 놓고 6 mL/min (그림 1 L)에서 펌프를 실행을 삭제 합니다.
- 72 h에 대 한 폐를 perfuse 하 고 항생제 마다 12 h와 PBS를 변경 유지.
참고: acellular 폐는 즉시 사용할 준비가. 그것은 필요할 때까지-80 ˚C에 저장할 수 있습니다. 분홍색 반점 또는 혈액 혈전 폐 엽에 명확 하 게 구상 될 수 있다, 만약 폐기 폐. 그것은 무작위로 DNA 또는 histopathology 테스트 수 있습니다. 완전 한 acellular 폐 세포와 DNA의 99.9%는 떨어져 세척 될 것입니다 표시 되지 않습니다.
참고: 세포 폐 모델로 작업 하는 경우는 decellularization를 건너뜁니다. 수확된 폐 (1 단계)는 생물 반응 기에서 직접 설정할 수 있습니다.
3. 생물 설정
- 생물 병 및 설정에 필요한 항목을 준비 합니다.
- 동등한 거리에 한 500 mL 병 뚜껑에 3 개의 구멍을 드릴 및 검은 나일론 고리 (그림 2A 와 2B)를 사용 하 여 모든 3 개의 구멍에서 여성 루어를 수정.
참고: 두 개의 구멍에 Luer 잠금 종료 얼굴 외부, 한쪽 병의 내부를 직면 하는 동안. - 생물 당 펌프 튜브에 6, 관에서 2, 6, 1.5 피트 튜브, 2 피트 튜브와 10 피트 oxygenator 튜브를 잘라.
- 18 G-스테인리스 바늘 잘라내어, 다시, tracheal 정에 대 한 생체 튜브 끝 연결.
- 오토 클레이 브 테이프 (그림 2C)를 사용 하 여 솔레노이드 철 망에 끝에 Luer 잠금 커넥터 oxygenator 튜브를 바꿈.
- 위에서 언급 한 오토 클레이 브 및 계속 그들에 UV 빛 10 분.
- 동등한 거리에 한 500 mL 병 뚜껑에 3 개의 구멍을 드릴 및 검은 나일론 고리 (그림 2A 와 2B)를 사용 하 여 모든 3 개의 구멍에서 여성 루어를 수정.
- 500 mL 병에 쉽게 맞게 트레이 사이의 적절 한 간격이 일반 셀 문화 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2) 내부 펌프를 설정 합니다.
- 펌프 카트리지에 70% 에탄올을 스프레이 하 고 펌프 튜브 펌프에 양쪽 끝에 여성 Luer 잠금 커넥터와 연결.
- 펌프 튜브와는 생물에서 1.5 피트 튜브와 다른 쪽 끝에는 oxygenator의 한쪽 (유출)를 연결 하 여 솔레노이드 와이어 메쉬 셀 문화 인큐베이터 안에 감싸 oxygenator를 설정 합니다.
- 무 균 조건 캐비닛에 biosafety 생물 병을 설정 합니다.
- 하나는 아빠를 통해 흐름을 제어 하 여 손잡이의 머리에 3 방향 자 지 (노란색)를 첨부
- 기도 (그림 2F) 통해 시드 셀에 대 한 또 다른 여성 Luer 잠금 칸막이를 단방향 자 지 (파란색)를 연결 합니다.
- 2 외부에 튜브에서를 연결 (흰색)와 6 개 미디어 순환 병의 내부에 튜브. 2 피트 튜브를 남성 Luer 잠금 적합 하 고 여성 Luer 러 그 스타일을 추가 하거나 아무것도 제거 액세스를 제공 하는 티를 연결 합니다.
- 3 방향 커넥터 (여성 Luer 러 그 스타일 티)의 구멍 중 하나를 단방향 자 지를 연결 합니다.
- 남성 Luer 잠금 및 여성 Luer 잠금 2 피트 튜브에 연결 합니다.
- 10 %FBS 1% 항생제 세포 배양 매체 (셀 요구 사항에 따라 다름)와 RPMI1640의 200 mL를 추가 하 고 인큐베이터에는 생물을 전송. (단방향 자 지와 티 커넥터) 폐쇄 루프 생물 수 있도록 두 개의 열린 끝에 oxygenator 튜브를 연결 합니다.
- 사전 실행 펌프 oxygenator와 튜브를 채우기 셀 문화 미디어와 셀 문화 인큐베이터 안에 6 mL/min에서 아무 공기 방울 튜브에 존재.
- 튜브 미디어 채워진다, 일단은 자 지 닫고는 oxygenators 생물 병의 양쪽 끝에서 분리 하 여 인큐베이터에서 생물 병을 제거 합니다.
- biosafety 캐비닛 생물 병을 넣어, 자 지를 통해 문화 미디어를 통과 하 고 남성 Luer 커넥터를 통해 자 지를 폐 비 계 (acellular 또는 세포)의 PA 정을 연결.
참고: 여기 그것은 (decellularization 과정 다음) acellular 모델 또는 갓 수확된 심장-폐 블록을 사용 하 여 (즉, 휴대 전화 모델, 그것은 네이티브 쥐 세포 유지). - 어떤 공기를 제거 하 여 기도에 실크 스레드 tracheal 정 넥타이 단방향 자 지 통해 문화 미디어를 전달 합니다.
- PA와 기관지의 모든 왜곡을 피하기 위해 있는지 확인 합니다. 가까운 폐와 생물 병 뚜껑 내부 발판, 다시, aseptically 인큐베이터에는 생물 반응 기를 전송 하 고 6 mL/min 속도로 펌프를 시작.
- 실행 되도록 10-15 분에 대 한 문화 미디어 모든 돌출부 비정상적 얻을 하 고 폐 (그림 2G) 좋은 형태로 보인다.
4. 전이 모델 및 셀 시드
참고: 기본 종양 성장 연구에 대 한 위의 폐 모델 시드 셀로 이동 합니다. 다음과 같이 전이성 모델에 대 한 폐 비 계 (acellular 또는 세포)를 수정 합니다.
- 인큐베이터에서 폐 비와 함께 생물을 꺼내와 캐비닛는 biosafety에 넣어.
- 기도 통해 문화 미디어의 5 mL을 통과 하 고 교수형으로 생물 뚜껑을 열고를 Luer 잠금 주사기를 사용 하 여 폐 비 계 (그림 2F).
- 이 단계에서 더 많은 사람이 폐의 전이성 모델 수정에 도움이 필요 합니다.
- 실크 2-0 준비 하 고 각도 집게 분기 지점에서 기도 통해 패스를 사용 하 여 얻을.
- 분기 지점에서 오른쪽 폐에가 하는 기도 고 문화 미디어를 전달 하 여 왼쪽된 폐에 기관지를 통해 미디어의 자유로운 흐름을 확인 하십시오.
참고: 기관 분기 지점에 연결 되 면 기도 통해 시드 셀 자동으로 이동 됩니다 왼쪽된 돌출부에 씨. 그것은 기도 통해 추진 문화 미디어에 의해 셀을 뿌리기 전에 테스트할 수 있습니다. 전이성 모델에서 미디어는 팽창 것입니다 왼쪽된 엽만, 및 오른쪽 엽10을 이동 합니다. - 20 mL Luer 잠금 주사기 tracheal 정 위에 설정 하 고 RPMI1640 완전 한 문화 미디어 (그림 2F) 50 mL에 ATCC 폐암 세포 (A549, H1299)를 추가 합니다.
- 셀 biosafety 캐비닛에 시드를 수행 합니다. 셀의 15 mL 주사기에 추가 하 고 중력에 의해 폐 엽을 통과 하자. 어떤 기포를 통과 하기 전에 셀의 나머지를 추가 합니다.
- Acellular 폐 시드에서 생물 병에 떨어지는 perfused 미디어를 수집 하 고 다시 3 배는 기관지를 통과 하자.
참고: perfused 미디어는 때로는 시드 암 세포는. 따라서, 효율적인 시드에 넣어 다시 미디어 다시 기도에 주사기를 통해. - 일단 시드, 주사기를 제거, 15 분 동안 기다려, 신선한 미디어, 추가 그리고는 생물 인큐베이터 다시 돌아갑니다. 튜브에서 모든 기포를 제거 합니다.
- 펌프 6 mL/min에서 미디어 perfuse를 시작 합니다.
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Representative Results
폐 쥐에서 수확 그대로 맥 관 구조 및 포11 (그림 3A 와 3B)를 유지 합니다. Decellularization, 시 등의 콜라겐, fibronectin, 엘라 스 틴, acellular 폐의 세포 외 기질 구성 요소11 (그림 3C, 3D, 3E및 3F) 유지 됩니다. decellularization 연결 되며 고 오신 (H & E)에 의해 관찰 될 수 있는 폐에 네이티브 쥐 세포의 완전 한 제거 및 DNA 분석11 DNA 양을 ( 에 있는 감소를 보여주는 셀의 부재를 보여주는 얼룩 3D 그림 및 3 세대). Ex vivo 4 차원 폐 모델 부착 셀12의 어떤 종류를 성장 사용할 수 있습니다. 폐암, 폐 섬유, 유방암 및 육 종 세포 기관11,,1213시드 여 성장 했다. 전이 모델 lobectomy10다른 시간 간격 기본 종양 조직과 CTCs, 전이성 병 변의 컬렉션에 대 한 수 있습니다. 직물의 H & E 염색 그대로 맥 관 구조 및 포 모두 휴대 하 고 acellular 모델에 (그림 3 H 와 3I) 보여주었다. Acellular 4 차원 폐 모델은 microenvironment의 다른 구성 요소 간의 상호 작용을 공부 하는 추가 기능 모델은. 4 차원 폐 세포 모델 없이 면역 세포14그대로 폐 microenvironment을 제공합니다. 면역 세포는 종양의 성장에 미치는 영향 및 종양 세포와 상호 작용을 공부 하는 맥 관 구조를 통해이 모델에 추가할 수 있습니다. 재현성 및 품질 모델의 중복에서 모델을 실행 하 고 H & E와 immunohistochemistry 셀 전용 마커를 사용 하 여 조직/세포를 분석 하 여 평가 될 수 있다. 그림 4 는 비보 전 4 차원 폐 모델 생성에 관련 된 주요 단계를 나타내는 회로도 보여준다.
그림 1: 폐 비의 decellularization 단위에 대 한 항목을 필요한. (A 와 B) 500 mL 병 뚜껑을 뚫고는 및 여성 Luer 커넥터 설정 배관 decellularization 병을 만드는. (C) 다른 병 뚜껑 하나만 구멍 정 맥 폐 비의 폐 동맥을 통해 시 약 흐름에 대 한 설정 (D)를 설정 하려면 필요 합니다. 펌프 펌프 머리, 그리고 (G)는 카트리지 (F) 펌프, (E) 설정 됩니다. (H) 펌프는 각 끝, (나) 커넥터 및 (J)에서 여성 Luer 커넥터와 커넥터 양쪽 끝에 decellularization 단위 (K)를 설정 하는 데 필요한 남성 루어 튜브 튜브. (L) 폐 건설 기계 3-5 d 1 x 항생제 antimycotic PBS와 폐쇄 루프 시스템에서 세척 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 생물 반응 기 설치는 비보 전 4 차원 폐 세포 배양에 대 한. (A 와 B) 생물 병 (500ml) 뚜껑을 뚫고는 및 3 명의 여성 Luer 잠금 커넥터 삽입 되 고 검은 나일론 링으로 고정. (C) oxygenator의 10 피트 튜브를 양쪽 끝에 남성 루어 필수 잠금 고리와 와이어 메쉬 솔레노이드 감싸. (D) A 폐 동맥 정 맥 및 (E) tracheal 정 18 G 바늘 및 펌프 튜브를 사용 하 여 준비가 되어 있습니다. (F) A 20 mL 주사기 폐 비의 상피 공간에 셀을 시드하 단방향 기관 커넥터 설정 됩니다. (G) 폐쇄 루프 생물 세포 문화 인큐베이터 관류 및 종양 성장에 대 한 내부 설정 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 대표 모델의 이미지는 ex vivo 4 차원 폐 전이 대 한. (A)는 그대로 심장-폐 블록 4를 6-1 주일-오래 된 쥐에서 수확 이다. (B) Histopathology 포 pneumocytes 보여줍니다. (C) Decellularization 폐 세포의 완전 한 제거에 지도 한다. (D) Histopathology acellular 폐와 그대로 지하실 멤브레인을 보여줍니다. (E 와 F) Movat의 pentachrome과 엘라 스 틴 얼룩 콜라겐, 섬유 소, 그리고 그대로 맥 관 구조와 기관지 엘라 스 틴의 존재를 계시 한다. (G) DNA 분석 99% 이상의 DNA 콘텐츠 감소를 보여줍니다. (H) 셀룰러 폐 세포 배양에는 생물 반응 기에서 직접 사용할 수 있습니다와 (나)는 조직학 분석 종양 성장의 존재를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 주요 보여주는 회로도 비보 전 4 차원 폐 모델의 생성에서 단계. 1 단계에서는 심장-폐 블록은 쥐에서 수확 이다. 2 단계에서 연구 필요 조건에 의하여 폐 세포 모델로 직접 사용 되거나 수 또는 기본 셀을 제거 하려면 decellularized 수 있습니다. 다음 단계에서 생물 및 셀 시드 폐 모델 설정 포함 됩니다. 마지막으로, 생물 반응 기 세포 배양에 대 한 인큐베이터에서 설정 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
Ex vivo 4 차원 폐 종양 성장 및 전이 실험실 설정에서 공부 하는 기회를 제공 한다. 네이티브 폐 매트릭스는 복잡 한 시스템 정상 조직에 지원을 제공 하 고 유지 하는 세포 세포 상호 작용, 세포-매트릭스 상호 작용, 세포 분화, 그리고 조직 조직입니다. 그것은 종양의 성장에 미치는 영향 및 다른 세포와의 상호 작용 연구를 어떤 종양 microenvironment 구성 요소를 추가 하는 기회를 제공 한다.
폐 수확 비보 전 4 차원 폐 모델에 대 한 중요 한 단계입니다. decellularization 동안는 시 약의 자유로운 흐름에 영향을 미칠 수 있습니다 폐에 혈액 응고 흉부 개통 후 헤 파 린 주입 관리에 지연 될 수 있습니다. 적절 한 홍 조 heparinized PBS를 가진 무색 액체 환기에서 올 때까지 하는 것이 세포 모델과 특히 중요 합니다. 뛰어난 베 나 정 맥의 주의 절단은는 실바에 게 어떤 해 든 지 방지 하는 것이 중요 Decellularization 과정을 폐 비 계를 이동 하는 공기 방울을 피하기 위해 매우 중요 하다. 공기 방울의 존재는 천천히 또는 시 약의 흐름을 중지 고 부적절 한 decellularization을 수 있습니다. 거품 거품 10-20 mL 주사기를 사용 하 여 밖으로 빠는 하 여 제거할 수 있습니다. 그것은 매우 PA 정 안 꼬인 다는 것을 확인 하는 것이 중요입니다. 생물 설정 동안 모든 튜브에 왜곡 수 있습니다 커넥터에서 팝업 고 인큐베이터 안에 완전 한 혼란에서 발생. 정에 왜곡을 방지 하려면 정/바늘 삭감 될 수 있다 하 고 연결을 방해 하지 않고는 정 회전 하는 데 필요한 유연성을 제공 하는 생체 튜브를 사용 하 여 다시 연결. 인큐베이터 안에 문화 미디어의 모든 누설 더 전문적인 청소 해야 합니다. 전이 모델을 만드는 동안 주의 봉합이 필요 기관 분기 사이트에서 합니다. 폐 나 기관지의 모든 빵 꾸 셀과 일치 하지 않는 결과의 새 이어질 수 있습니다.
Acellular 및 셀룰러 비보 전 4 차원 폐 모델 일부의 장점이 기존의 3D 세포 배양 암 진행을 이해 하기에 추가적인 전이 주요 생물학 단계를 공부 하는 기회를 제공 하는 그들은 흐름의 차원입니다. 두 모델 종양 성장 및 전이의 생물학을 모방 하 고 유전자 서명, 치료, 응답 및 약물 저항의 개발을 보다 잘 이해 하려면 암 성장의 다른 단계에서 종양 세포를 수집 하는 기회를 제공 합니다. 그것은 폐 매트릭스, 설립된 셀 라인 및 1 차 셀의 범위를 성장 가능성이 있다. Ex vivo 4 차원 모델의 제한 전이 공부 하 시드 > 10 백만 셀의 요구 사항입니다. 낮은 증식 잠재력 셀 전이성 병 변 표시 시간이 오래 걸릴 수 있습니다. 또한,이 모델 일단 셀 시드 더 무 균 조건을 필요 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
P. 김 민 두 번째 존 W. Kirklin 연구 장학금, 흉부 수술, 그레이엄 연구 재단, 휴스턴 감 리 전문 의사 그룹 그랜트, 및 마이클 M. Joann H. 콘 연구 수상 미국 협회에서에서 보조금 지원을 받았다. 우리는 언어의 원고 편집에 대 한 앤 Saikin 감사 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague Dowley rat | Harlan | 206M | Male |
| Chlorhexidine swab | Prevantics, NY, USA | NDC 10819-1080-1 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals, Schaumburg, IL, USA | NDC 25021-400-10 | |
| 18-gauge needle | McMaster Carr, USA | 75165A249 | |
| 2-0 silk tie | Ethicon, San Angelo, TX, USA | A305H | |
| Masterflex L/S pump | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | EW-07554-80 | |
| Masterflex L/S pump head | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | EW-07519-05 | |
| Masterflex L/S pump cartridge | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | EW-07519-70 | |
| Tygon Tube | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 14171211 | |
| MasterFlex Pump tube | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 06598-16 | |
| Female luer lock connectors | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 45508-34 | 75165A249 |
| Male luer lock connectors | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 45513-04 | |
| black nylon ring | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | EW-45509-04 | |
| Intravenous set | CareFusion | 41134E | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | CAS151-21-3 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-1L | |
| Antibiotics | Gibco | 15240-062 | |
| Silicone oxygenator | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | ABW00011 | Saint-GoBain- |
| Wire mesh | 1164610105 | Lowes | New York Wire |
| Female luer Lug Style TEE | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 45508-56 | |
| Male luer integral lock ring to 200series Barb | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 45518-08 | |
| Female luer thread style coupler | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 45508-22 | |
| Clave connector | ICU Medical | 11956 | |
| Hi-Flo ™4-way Stopcock w/swivel male luer lock | smith Medical | MX9341L | |
| MasterFlex Pump tube | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 06598-13 | for cannula |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Torre, L. A., Siegel, R. L., Jemal, A.
- Lallo, A., Schenk, M. W., Frese, K. K., Blackhall, F., Dive, C. Circulating tumor cells and CDX models as a tool for preclinical drug development. Translational Lung Cancer Research. 6 (4), 397-408 (2017).
- Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. Mouse models for tumor metastasis. Methods in Molecular Biology. 928, 221-228 (2012).
- Bissell, M. J., Hines, W. C. Why don't we get more cancer? A proposed role of the microenvironment in restraining cancer progression. Nature Medicine. 17 (3), 320-329 (2011).
- Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nature Reviews Cancer. 11 (2), 135-141 (2011).
- Mishra, D. K., et al. Human lung cancer cells grown in an ex vivo 3D lung model produce matrix metalloproteinases not produced in 2D culture. PloS One. 7 (9), e45308 (2012).
- Vishnoi, M., Mishra, D. K., Thrall, M. J., Kurie, J. M., Kim, M. P. Circulating tumor cells from a 4-dimensional lung cancer model are resistant to cisplatin. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 148 (3), discussion 1063-1064 1056-1063 (2014).
- Mishra, D. K., et al. Gene expression profile of A549 cells from tissue of 4D model predicts poor prognosis in lung cancer patients. International Journal of Cancer. Journal International du Cancer. , (2013).
- Mishra, D. K., et al. Ex vivo four-dimensional lung cancer model mimics metastasis. The Annals of Thoracic Surgery. 99 (4), 1149-1156 (2015).
- Mishra, D. K., et al. Human lung cancer cells grown on acellular rat lung matrix create perfusable tumor nodules. The Annals of Thoracic Surgery. 93 (4), 1075-1081 (2012).
- Pence, K. A., Mishra, D. K., Thrall, M., Dave, B., Kim, M. P. Breast cancer cells form primary tumors on ex vivo four-dimensional lung model. Journal of Surgical Research. 210, 181-187 (2017).
- Mishra, D. K., et al. Human Lung Fibroblasts Inhibit Non-Small Cell Lung Cancer Metastasis in Ex Vivo 4D Model. The Annals of Thoracic Surgery. 100 (4), discussion 1174 1167-1174 (2015).
- Mishra, D. K., Miller, R. A., Pence, K. A., Kim, M. P. Small cell and non small cell lung cancer form metastasis on cellular 4D lung model. BMC Cancer. 18 (1), 441 (2018).
