Multiplex-therapeutisches Drug Monitoring von Isotop-Verdünnung HPLC-MS/MS von Antibiotika in der kritischen Krankheiten
Summary
Hier präsentieren wir ein Tandem Massenspektrometrie-basierte Protokoll für die Quantifizierung von häufig verwendeten Antibiotika auf Intensivstationen, nämlich Hemmhof, Meropenem, Ciprofloxacin, Moxifloxacin, Linezolid und Piperacillin.
Abstract
Es gibt eine steigende Nachfrage für das therapeutisches Drug monitoring von Antibiotika in vielen klinischen Einrichtungen, insbesondere im Hinblick auf die Umsetzung des Krankenhaus Antibiotika Stewardship-Programme.
Bei den laufenden Arbeiten präsentieren wir ein Multiplex-leistungsstarke flüssige Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (HPLC-MS/MS)-Protokoll für die Quantifizierung der Hemmhof, Meropenem, Ciprofloxacin, Moxifloxacin, Linezolid und Piperacillin, häufig verwendet Antibiotika auf Intensivstationen. Die Methode wurde bereits umfassend nach der Richtlinie der Europäischen Arzneimittel-Agentur überprüft.
Nach einer rasanten Probe Bereinigung Analyten getrennt auf einem C8-Reverse-Phase-HPLC-Säule innerhalb von 4 Minuten und mit der entsprechenden stabilen Isotopen-Label internen Standards in der Elektrospray-Ionisation (ESI +) Massenspektrometrie in mehreren Reaktion quantifiziert Zeit mit der Überwachung (MRM). Die vorgestellte Methode verwendet eine einfache Instrumentierung mit einheitlicher chromatographische Bedingungen einstellen, so dass für das tägliche und robuste Antibiotika therapeutisches Medikament monitoring in klinischen Labors. Die Eichkurve erstreckt sich über die pharmakokinetischen Konzentrationsbereich, damit einschließlich Antibiotika Beträge in der Nähe der minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC) der Bakterien anfällig und Konzentrationen (Cmax), die mit Bolus abgerufen werden Verwaltung-Schemata. Ohne die Notwendigkeit der Serum-Verdünnung vor der Probe-Bereinigung erhalten Sie durch mehrere Messungen der Fläche unter der Kurve für ein Antibiotikum verabreicht.
Introduction
Obwohl Antibiotika die medizinische Praxis revolutioniert haben, bleiben schwere bakterielle Infektionen eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität bei kritischen Krankheiten1. In diesem Zusammenhang ist die schnelle Verwaltung der einen passenden Antiinfektiva in ein ausreichender Dosierung von größter Bedeutung für Disease Control2.
Eine wachsende Zahl von beweisen zeigt, dass die empirische Behandlung mit Breitbandantibiotika mit der Komplexität der Patientenpopulationen zunehmend problematisch wird. Dies gilt insbesondere für die Intensivstation (ICU), wo eine große interindividuelle Variabilität der Schlüsselparameter pharmakokinetischen (PK) häufig beobachtet wird,3,4. Dementsprechend sind Intensivpatienten drohende Gefahr Sub therapeutischen Spiegel mit der Gefahr einer unzureichenden Therapieerfolg5,6. Dann wieder sind Patienten unnötig zu hohe antibiotische Konzentrationen ausgesetzt, die zu schwerwiegenden unerwünschten Ereignisse mit keine klinischen Vorteile7führen kann. Die Antibiotika Missbrauch und die unzureichende Dosierung haben auch die Verbreitung von Antibiotika-Resistenzen, angeheizt werdenden eine wachsende Bedrohung für die öffentliche Gesundheit8.
Um den Einsatz von Antibiotika zu verbessern und ihre Effectivenessas zu bewahren hat lange wie möglich, der World Health Organization einen globalen Aktionsplan zur Antibiotikaresistenz in 20159ins Leben gerufen. Antibiotikum Stewardship-Programme sind einen wesentlichen Eckpfeiler des umsichtigen antimikrobielle Einsatz in national Public Health Strategien10helfen Kliniker, die Qualität der Patientenversorgung11 und zur gleichen Zeit erheblich zu verbessern Reduktion der Antibiotika-Resistenz-12. Antimikrobiellen Dosierung bei einzelnen Patienten durch die Anwendung von therapeutischen Drug monitoring (TDM) ist ein zentrales Instrument in diesem Zusammenhang13.
Bis heute im Handel erhältlichen TDM sind Tests nur für Glycopeptide Antibiotika und Aminoglykoside. Die Quantifizierung von Substanzen aus anderen Klassen erfordert häufig eine Hausmethode Entwicklung oder Validierung, die umständlich sein kann. Daher präsentieren wir, im Detail das Protokoll für eine robuste Massenspektrometrie-basierte Test, die für die Quantifizierung der wichtigsten Antibiotika auf der Intensivstation innerhalb ihrer klinischen relevanten Konzentration reicht14verwendet werden kann. Die Methode wurde vor kurzem in unserem Massenspektrometrie gegründet und gilt seitdem für die Routine TDM auf der Intensivstation. Das Verfahren nutzt eine unkomplizierte und einfache analytische Einstellung mit einem einheitlichen Muster-Bereinigung, ermöglicht die schnelle Umsetzung von Antibiotika TDM in vielen Einrichtungen mit Massenspektrometrie-Funktionen.
Das hier beschriebene Protokoll wurde optimiert für die Quantifizierung der Hemmhof, Meropenem, Ciprofloxacin, Moxifloxacin, Linezolid und Piperacillin in humanem Serum mit Isotop Verdünnung Flüssigchromatographie (LC) in Kombination mit einem Tandem Mass Massenspektrometrie (MS/MS). Für das Isotop Verdünnung LC-MS/MS-Methode sind stabile Isotopen-markierte Verbindungen auf eine Stichprobe von Interesse mit einer bestimmten Matrix (z.B. Serum) hinzugefügt. Isotopen-markierte Normen können von ihren unbeschriftete Gegenstück, nämlich der Analyten von Interesse, durch verschiedene Molekulargewichte natürliches Molekül und deren Fragmentierung Produkte, bezeichnet einen übergeordneten Ion, Tochter Ion Übergang unterschieden werden. Isotopen-markierte Verbindungen eine fast identische insgesamt physikalisch-chemischen Verhalten im Vergleich zu ihren unbeschriftete Gegenstück haben, sind sie ideale interne Standards für MS/MS, ermöglicht eine nahezu Matrix-unabhängige Analyten Quantifizierung mit einem hohen Maß an Genauigkeit-15. Heutzutage sind viele stabile Isotopen-Label interne Standards, die für die kleinen-Molekül Quantifizierung, einschließlich der TDM von Antibiotika, einsetzbar im Handel erhältlich.
Die chromatographische Trennung der Antibiotika Analyten in der beschriebenen Protokoll erfolgt mit einem C8 Alkyl-Kettenlänge Reverse-Phase Trennsäule (100 mm x 2,1 mm, 3 µm-Partikelgröße). Während der Methodenentwicklung war der interne standard normalisierten Matrix Faktoren für alle Analyte 94,6 % bis 105,4 %, mit einem Variationskoeffizienten von ≤8.3 %14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir berichten in diesem Manuskript, das Protokoll für eine einfache und robuste Tandem-Massenspektrometrie-basierte Methode zur Quantifizierung der häufig verwendeten Antibiotika in ICU19, nämlich Hemmhof, Meropenem, Ciprofloxacin, Moxifloxacin, Linezolid, und Piperacillin14. Eine Tabellenkalkulation begleitet das Manuskript für die Zubereitung von Antibiotika Stammlösungen, Kalibratoren und Qualitätskontrollen, unter Berücksichtigung der Reinheit der Antibiotika und…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Dr. Schütze für seine Hilfe bei der Einrichtung der vorgestellten Methode und Dr. Zoller für den wertvollen Input in Bezug auf die korrekte Kalibrierung-Palette. Die Autoren erkennen auch das technische Personal der Massenspektrometrie Anlage.
Materials
| cefepime hydrochloride | Sigma-Aldrich | 1097636 | USP Reference Standard |
| meropenem trihydrate | Sigma-Aldrich | Y0001252 | EP Reference Standard |
| ciprofloxacin | Sigma-Aldrich | 17850 | |
| moxifloxacin hydrochloride | Sigma-Aldrich | SML1581 | |
| linezolid | Toronto Research Chemicals | L466500 | |
| piperacillin sodium salt | Sigma-Aldrich | 93129 | |
| cefepime-13C12D3 sulfate | Alsachim | C1297 | Isotope labelled internal standard for cefepime |
| meropenem-D6 | Toronto Research Chemicals | M225617 | Isotope labelled internal standard for meropenem |
| ciprofloxacin-D8 | Toronto Research Chemicals | C482501 | Isotope labelled internal standard for ciprofloxacin |
| moxifloxacin-13C1D3 hydrochloride | Toronto Research Chemicals | M745003 | Isotope labelled internal standard for moxifloxacin |
| linezolid-D3 | Toronto Research Chemicals | L466502 | Isotope labelled internal standard for linezolid |
| piperacillin-D5 | Toronto Research Chemicals | P479952 | Isotope labelled internal standard for piperacillin |
| methanol | JT Baker | 8402 | |
| HPLC grade water | JT Baker | 4218 | |
| formic acid | Biosolve | 6914132 | |
| acetic acid | Biosolve | 1070501 | |
| ammonium formate | Sigma-Aldrich | 70221-25G-F | |
| tert-Butyl methyl ether | Merck | 101845 | |
| Fortis 3 μm C8 100 * 2.1 mm | Fortis | F08-020503 | |
| Ti-PEEK-encased Prifilter (2 μm) | Chromsystems | 15011 | |
| 2795 Alliance HPLC system | Waters | 176000491 | |
| Quattro micro API Tandem Quadrupole System | Waters | 720000338 | |
| QuanLynx 4.1 software | Waters | / | Data evaluation software provided by the mass spectrometer manufacturer |
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