Multiplex suivi thérapeutique pharmacologique par dilution isotopique HPLC-MS/MS des antibiotiques dans les maladies graves
Summary
Nous présentons ici un protocole de basé sur la spectrométrie de masse en tandem pour la quantification des antibiotiques fréquemment utilisés dans les unités de soins intensifs, nommément céfépime, méropénem, ciprofloxacine, la moxifloxacine, linézolide et pipéracilline.
Abstract
Il y a une demande croissante pour le suivi thérapeutique pharmacologique des antibiotiques dans de nombreuses installations cliniques, en particulier en ce qui concerne la mise en œuvre de programmes d’intendance aux antibiotiques de l’hôpital.
Dans les travaux en cours, nous présentons un Protocole multiplex haute performance liquid chromatography-spectrométrie de masse (HPCL-MS/MS) pour la quantification du céfépime, méropénem, ciprofloxacine, la moxifloxacine, linézolide et pipéracilline, couramment utilisés antibiotiques dans les unités de soins intensifs. La méthode était déjà complètement validée conformément aux lignes directrices de l’Agence européenne des médicaments.
Après un nettoyage rapide d’échantillon, les analytes sont séparés sur une colonne CLHP en phase inverse C8 en 4 minutes et quantifiés avec stables isotopes marqués internes normes correspondantes dans électrospray (ESI +) spectrométrie de masse en réaction multiples le temps de surveillance (MRM). La méthode présentée utilise une instrumentation simple offrant des conditions chromatographiques uniformes, ce qui permet le suivi quotidien et robuste thérapeutique antibiotique dans les laboratoires cliniques. La courbe d’étalonnage s’étend sur la plage de concentration pharmacocinétiques, donc y compris les montants antibiotiques à proximité de la concentration minimale inhibitrice (CMI) des bactéries sensibles et les concentrations maximales (Cmax) qui sont obtenues avec un bolus schémas d’administration. Sans la nécessité de la dilution du sérum avant le nettoyage de l’échantillon, l’aire sous la courbe pour un antibiotique administré peut être obtenue par le biais de mesures multiples.
Introduction
Bien que les antibiotiques ont révolutionné la pratique de la médecine, des infections bactériennes sévères demeurent des principales causes de morbidité et de mortalité dans les maladies graves1. À cet égard, l’administration rapide d’un anti-infectieux adapté à un dosage adéquat est de l’importance supérieure pour maladie contrôle2.
Un corps croissant d’évidence montre que le traitement empirique avec des antibiotiques à large spectre devient de plus en plus problématique avec la complexité des populations de patients. Ceci est particulièrement vrai pour les unités de soins intensifs (USI), où une énorme variabilité interindividuelle des principaux paramètres pharmacocinétiques de (PK) est fréquemment observée3,4. Par conséquent, les patients ICU courent un risque imminent de niveaux sous thérapeutiques avec le danger d’un succès thérapeutique insuffisant5,6. Là encore, les patients sont inutilement exposés à des concentrations d’antibiotique excessivement élevées pouvant entraîner des événements indésirables graves avec aucun des avantages cliniques7. L’abus d’antibiotiques et de la posologie insuffisante ont également alimenté la diffusion de la résistance aux antibiotique, qui devient une menace croissante pour la santé publique8.
D’améliorer l’utilisation des antibiotiques et de préserver leur effectivenessas longtemps que possible, l’Organisation mondiale de la santé a lancé un plan d’action global sur la résistance antimicrobienne en 20159. Programmes d’intendance antibiotiques constituent une pierre essentielle angulaire d’utilisation prudente des antimicrobiens en national de santé publique stratégies10, aider les cliniciens à améliorer sensiblement la qualité des soins aux patients11 et, en même temps, la réduire la résistance aux antibiotiques12. Antimicrobiens chez chaque patient par le biais de l’application du médicament thérapeutique suivi (TDM) est un instrument clé dans ce contexte13.
À ce jour, disponible dans le commerce TDM essais sont uniquement disponibles pour les antibiotiques glycopeptides et aminoglycosides. La quantification des substances des autres classes nécessite généralement un développement de la méthode interne ou une validation qui peut être encombrante. Nous avons, par conséquent, présenter en détail le protocole pour un dosage basé sur la spectrométrie de masse solide qui peut être utilisé pour la quantification des antibiotiques plus pertinents aux soins intensifs au sein de leurs gammes de concentration pertinente clinique14. La méthode a récemment mis en place dans nos installations de spectrométrie de masse et a été appliquée pour la TDM en réanimation de routine depuis lors. La procédure utilise un cadre analytique simple et direct avec un nettoyage uniforme échantillon, permettant la mise en oeuvre rapide des antibiotiques TDM dans de nombreuses installations avec des capacités de spectrométrie de masse.
Le protocole décrit ici a été optimisé pour la quantification du céfépime, méropénem, ciprofloxacine, la moxifloxacine, linézolide et pipéracilline dans le sérum humain, en utilisant la chromatographie liquide (LC) à dilution isotopique en combinaison avec un tandem mass spectrométrie (MS/MS). Pour la dilution isotopique méthodologie LC-MS/MS, composés marqués isotopes stables sont ajoutés à un échantillon d’intérêt avec une matrice spécifique (p. ex., sérum). Isotopes marqués normes peuvent distinguer de leurs homologues non étiquetées, à savoir l’analyte d’intérêt, en raison de différents poids moléculaires de la molécule naturelle et leurs produits de fragmentation, appelés une transition ion-pour-fille-ion parent. Comme composés marqués isotopes ont un comportement physico-chimique globalement presque identique par rapport à leurs homologues non étiquetées, ils sont des étalons internes idéales pour la SM/SM, ce qui permet une quantification de l’analyte presque indépendante de matrice avec un degré élevé de 15de précision. De nos jours, nombreux stables isotopes marqués normes interne qui peuvent être utilisés pour la quantification de petites molécules, y compris la TDM d’antimicrobiens, sont disponibles dans le commerce.
La séparation chromatographique de l’antibiotique analyser dans le protocole décrit est réalisée avec une colonne en phase inversée C8 alkyl-longueur de la chaîne analytique (100 mm x 2,1 mm, 3 µm taille des particules). Au cours du développement de la méthode, les éléments de la matrice normalisée standard interne pour tous les analytes était de 94,6 % à 105,4 %, avec un coefficient de variation de ≤8.3 %14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce manuscrit, les auteurs rapportent le protocole pour une méthode de basé sur la spectrométrie de masse tandem simple et robuste pour la quantification des antibiotiques fréquemment utilisés à l’ICU19, nommément céfépime, méropénem, ciprofloxacine, la moxifloxacine, linézolide, et pipéracilline14. Une feuille de calcul accompagne le manuscrit pour la préparation des solutions mères antibiotiques, calibrateurs et contrôles de qualité, compte tenu de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Dr Schütze pour son aide à l’établissement de la méthode présentée et Dr. Zoller pour la précieuse contribution en ce qui concerne la gamme d’étalonnage approprié. Les auteurs remercient également le personnel technique de l’installation de spectrométrie de masse.
Materials
| cefepime hydrochloride | Sigma-Aldrich | 1097636 | USP Reference Standard |
| meropenem trihydrate | Sigma-Aldrich | Y0001252 | EP Reference Standard |
| ciprofloxacin | Sigma-Aldrich | 17850 | |
| moxifloxacin hydrochloride | Sigma-Aldrich | SML1581 | |
| linezolid | Toronto Research Chemicals | L466500 | |
| piperacillin sodium salt | Sigma-Aldrich | 93129 | |
| cefepime-13C12D3 sulfate | Alsachim | C1297 | Isotope labelled internal standard for cefepime |
| meropenem-D6 | Toronto Research Chemicals | M225617 | Isotope labelled internal standard for meropenem |
| ciprofloxacin-D8 | Toronto Research Chemicals | C482501 | Isotope labelled internal standard for ciprofloxacin |
| moxifloxacin-13C1D3 hydrochloride | Toronto Research Chemicals | M745003 | Isotope labelled internal standard for moxifloxacin |
| linezolid-D3 | Toronto Research Chemicals | L466502 | Isotope labelled internal standard for linezolid |
| piperacillin-D5 | Toronto Research Chemicals | P479952 | Isotope labelled internal standard for piperacillin |
| methanol | JT Baker | 8402 | |
| HPLC grade water | JT Baker | 4218 | |
| formic acid | Biosolve | 6914132 | |
| acetic acid | Biosolve | 1070501 | |
| ammonium formate | Sigma-Aldrich | 70221-25G-F | |
| tert-Butyl methyl ether | Merck | 101845 | |
| Fortis 3 μm C8 100 * 2.1 mm | Fortis | F08-020503 | |
| Ti-PEEK-encased Prifilter (2 μm) | Chromsystems | 15011 | |
| 2795 Alliance HPLC system | Waters | 176000491 | |
| Quattro micro API Tandem Quadrupole System | Waters | 720000338 | |
| QuanLynx 4.1 software | Waters | / | Data evaluation software provided by the mass spectrometer manufacturer |
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