Multiplex monitoraggio terapeutico del farmaco da diluizione dell'isotopo HPLC-MS/MS di antibiotici in malattie critiche
Summary
Qui presentiamo un protocollo basati sulla spettrometria di massa tandem per la quantificazione degli antibiotici frequentemente utilizzati nelle unità di cura intensiva, cioè cefepime, meropenem, ciprofloxacina, moxifloxacina, linezolid e piperacillina.
Abstract
C’è una domanda sempre crescente per il monitoraggio terapeutico del farmaco di antibiotici in molte strutture cliniche, soprattutto per quanto riguarda l’attuazione di programmi di stewardship antibiotica ospedaliera.
Nel lavoro attuale, presentiamo un protocollo multiplex ad alte prestazioni liquido cromatografia-spettrometria di massa tandem (HPCL-MS/MS) per la quantificazione di cefepime, meropenem, ciprofloxacina, moxifloxacina, linezolid e piperacillina, comunemente usato antibiotici in terapia intensiva. Il metodo è stato convalidato in precedenza completamente secondo le linee guida dell’Agenzia europea dei medicinali.
Dopo una pulizia rapida campione, gli analiti sono separati su una colonna HPLC di inverso-fase C8 entro 4 minuti e quantificati con il corrispondente stabile isotopo-etichetta standard interni in spettrometria di massa electrospray ionizzazione (ESI +) nella reazione più tempo di monitoraggio (MRM). Il metodo proposto utilizza una strumentazione semplice impostazione con condizioni cromatografiche uniforme, consentendo il monitoraggio terapeutico del farmaco antibiotico giornaliero e robusto in laboratori clinici. La curva di taratura si estende la gamma di concentrazione farmacocinetiche, compresi quindi gli importi antibiotici vicino la concentrazione inibitoria minima (MIC) di batteri sensibili e le concentrazioni di picco (Cmax) che si ottengono con bolo regimi di somministrazione. Senza la necessità della diluizione del siero prima la pulizia del campione, l’area sotto la curva per un antibiotico somministrato può essere ottenuta attraverso misurazioni multiple.
Introduction
Anche se gli antibiotici hanno rivoluzionato la pratica della medicina, gravi infezioni batteriche rimangono delle cause principali di morbilità e mortalità in malattie critiche1. A questo proposito, la gestione rapida di un antinfettivo adatto in una dose adeguata è dell’importanza più in alto per controllo di malattia2.
Un corpo crescente di prova dimostra che il trattamento empirico con antibiotici ad ampio spettro sta diventando sempre più problematico con la complessità delle popolazioni di pazienti. Questo è particolarmente vero per le unità di terapia intensiva (ICU), dove un’enorme variabilità inter-individuale dei principali parametri di farmacocinetica (PK) è osservata frequentemente3,4. Di conseguenza, pazienti in terapia intensiva sono a rischio imminente di livelli subterapeutici con il pericolo di un successo terapeutico insufficiente5,6. Poi di nuovo, i pazienti sono inutilmente esposti a eccessivamente alte concentrazioni di antibiotiche che possono causare gravi eventi avversi con nessun benefici clinici7. Sia l’abuso di antibiotici e il dosaggio insufficiente inoltre hanno alimentato la diffusione della resistenza agli Antibiotico, che sta diventando una crescente minaccia alla salute pubblica8.
Per migliorare l’uso di antibiotici e di preservare la loro effectivenessas a lungo possibile, l’organizzazione mondiale della sanità ha lanciato un piano d’azione globale sulla resistenza agli antimicrobici nel 20159. Programmi di stewardship antibiotica costituiscono un caposaldo essenziale dell’uso prudente antimicrobico in sanità pubblica nazionale strategie10, aiutando i medici a migliorare significativamente la qualità di cura del paziente11 e, allo stesso tempo, riducendo la resistenza antibiotica12. Antimicrobica di dosaggio nei singoli pazienti attraverso l’applicazione di farmaci terapeutici monitoraggio (TDM) è uno strumento fondamentale in questo contesto13.
Ad oggi, disponibili in commercio TDM dosaggi distano solo per gli antibiotici glicopeptidi e aminoglicosidi. La quantificazione di sostanze da altre classi comunemente richiede una convalida che può essere ingombrante o lo sviluppo del metodo in-House. Quindi, presentiamo in dettaglio il protocollo per una robusta analisi basati sulla spettrometria di massa che può essere utilizzato per la quantificazione degli antibiotici più rilevanti in terapia intensiva all’interno di loro clinica rilevante concentrazione gamme14. Il metodo è stato recentemente istituito nella nostra struttura di spettrometria di massa ed è stato applicato per la routine TDM in terapia intensiva da allora. La procedura utilizza un’impostazione analitica lineare e semplice con una pulizia uniforme del campione, permettendo la rapida attuazione dell’antibiotico TDM in molti servizi con funzionalità di spettrometria di massa.
Il protocollo descritto qui è stato ottimizzato per la quantificazione di cefepime, meropenem, ciprofloxacina, moxifloxacina, linezolid e piperacillina nel siero umano, mediante cromatografia liquida (LC) a diluizione dell’isotopo in combinazione con un tandem massa spettrometria (MS/MS). Per la diluizione dell’isotopo metodologia di LC-MS/MS, composti stabili dell’isotopo-identificati vengono aggiunti ad un campione di interesse con una matrice specifica (ad es., siero). Isotopo-etichetta standard possono essere distinti dalla loro controparte senza etichetta, vale a dire l’analita di interesse, a causa di diversi pesi molecolari della molecola naturale e loro prodotti di frammentazione, definiti una transizione di genitore-ion-a-figlia-ion. Come isotopo-labeled composti hanno un comportamento nel complesso fisico-chimico quasi identico rispetto alla loro controparte senza etichetta, sono standard interni ideale per il MS/MS, che permette una quantificazione quasi indipendente dalla matrice analita con un elevato grado di precisione15. Al giorno d’oggi, molti stabile dell’isotopo-etichetta interno standard che può essere utilizzato per la quantificazione della piccolo-molecola, tra cui il TDM di antimicrobici, sono disponibili in commercio.
La separazione cromatografica degli analiti antibiotici nel protocollo descritto viene eseguita con una colonna di inverso-fase di C8–lunghezza della catena alchilica analitica (100 mm x 2,1 mm, 3 µm granulometria). Durante lo sviluppo del metodo, i fattori interni matrix standard normalizzato per tutti gli analiti era tra 94,6% e 105,4%, con un coefficiente di variazione di ≤8.3%14.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo manoscritto, segnaliamo il protocollo per un metodo basati sulla spettrometria di massa tandem semplice e robusto per la quantificazione degli antibiotici utilizzati di frequente in ICU19, vale a dire cefepime, meropenem, ciprofloxacina, moxifloxacina, linezolid, e La piperacillina14. Un foglio di calcolo accompagna il manoscritto per la preparazione di soluzioni stock di antibiotici, calibratori e controlli di qualità, tenendo conto la purezza degli antibiotici …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il Dr. Schütze per il suo aiuto con la creazione del metodo presentato e Dr. Zoller per il prezioso contributo per quanto riguarda l’intervallo di calibrazione corretta. Gli autori riconoscono anche lo staff tecnico della struttura di spettrometria di massa.
Materials
| cefepime hydrochloride | Sigma-Aldrich | 1097636 | USP Reference Standard |
| meropenem trihydrate | Sigma-Aldrich | Y0001252 | EP Reference Standard |
| ciprofloxacin | Sigma-Aldrich | 17850 | |
| moxifloxacin hydrochloride | Sigma-Aldrich | SML1581 | |
| linezolid | Toronto Research Chemicals | L466500 | |
| piperacillin sodium salt | Sigma-Aldrich | 93129 | |
| cefepime-13C12D3 sulfate | Alsachim | C1297 | Isotope labelled internal standard for cefepime |
| meropenem-D6 | Toronto Research Chemicals | M225617 | Isotope labelled internal standard for meropenem |
| ciprofloxacin-D8 | Toronto Research Chemicals | C482501 | Isotope labelled internal standard for ciprofloxacin |
| moxifloxacin-13C1D3 hydrochloride | Toronto Research Chemicals | M745003 | Isotope labelled internal standard for moxifloxacin |
| linezolid-D3 | Toronto Research Chemicals | L466502 | Isotope labelled internal standard for linezolid |
| piperacillin-D5 | Toronto Research Chemicals | P479952 | Isotope labelled internal standard for piperacillin |
| methanol | JT Baker | 8402 | |
| HPLC grade water | JT Baker | 4218 | |
| formic acid | Biosolve | 6914132 | |
| acetic acid | Biosolve | 1070501 | |
| ammonium formate | Sigma-Aldrich | 70221-25G-F | |
| tert-Butyl methyl ether | Merck | 101845 | |
| Fortis 3 μm C8 100 * 2.1 mm | Fortis | F08-020503 | |
| Ti-PEEK-encased Prifilter (2 μm) | Chromsystems | 15011 | |
| 2795 Alliance HPLC system | Waters | 176000491 | |
| Quattro micro API Tandem Quadrupole System | Waters | 720000338 | |
| QuanLynx 4.1 software | Waters | / | Data evaluation software provided by the mass spectrometer manufacturer |
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