Multiplex de monitoramento de drogas terapêuticas por diluição isotópica HPLC-MS/MS de antibióticos em doenças críticas
Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo de massa baseado em espectrometria em tandem para a quantificação dos antibióticos usados com frequência em unidades de cuidados intensivos, nomeadamente cefepime, meropenem, ciprofloxacina, moxifloxacina, linezolida e piperacillin.
Abstract
Há uma crescente demanda para a monitorização de drogas terapêuticas de antibióticos em muitas instalações clínicas, particularmente no que se refere a implementação de programas de manejo de antibióticos de hospital.
No trabalho atual, apresentamos um protocolo multiplex alta performance líquida cromatografia-tandem espectrometria de massa (HPLC-MS/MS) para a quantificação de cefepime, meropenem, ciprofloxacina, moxifloxacina, linezolida e piperacillin, comumente usado antibióticos em unidades de terapia intensiva. O método foi validado anteriormente exaustivamente de acordo com a orientação da Agência Europeia de medicamentos.
Depois de uma limpeza rápida da amostra, os analitos são separados em uma coluna HPLC de fase reversa C8 dentro de 4 minutos e quantificados com estáveis isótopo-rotulados internas normas correspondentes em espectrometria de massa electrospray ionização (ESI +) na reação de vários tempo de monitoramento (MRM). O método apresentado utiliza uma instrumentação simples configuração com condições cromatográficas uniformes, permitindo o acompanhamento diária e robusta droga terapêutica antibiótica em laboratórios clínicos. A curva de calibração estende o intervalo de concentração farmacocinética, assim, incluindo antibióticos quantidades perto da concentração inibitória mínima (MIC) de bactérias sensíveis e concentrações de pico (Cmáx) que são obtidas com bólus regimes de administração. Sem a necessidade da diluição do soro antes da limpeza da amostra, a área sob a curva para um antibiótico administrado pode ser obtida por meio de várias medições.
Introduction
Embora os antibióticos revolucionaram a prática da medicina, infecções bacterianas graves permanecem das principais causas de morbidade e mortalidade em doenças críticas1. A este respeito, a administração imediata de um anti-infeccioso apropriado em uma dosagem adequada é da mais alta importância para doença controle2.
Um corpo crescente de evidências demonstra que o tratamento empírico com antibióticos de amplo espectro está se tornando cada vez mais problemático com a complexidade de populações de pacientes. Isto é especialmente verdadeiro para unidades de terapia intensiva (UTI), onde uma enorme variabilidade inter individual dos principais parâmetros de farmacocinética (PK) é frequentemente observada3,4. Assim, pacientes de UTI são em risco iminente de níveis sub-terapêuticos com o perigo de um sucesso terapêutico insuficiente5,6. Então, novamente, os pacientes desnecessariamente estão expostos a excessivamente altas concentrações de antibióticas que podem resultar em efeitos adversos graves com nenhum benefícios clínicos7. Tanto o abuso de antibióticos e a dosagem insuficiente também têm impulsionado a disseminação da resistência aos antibióticos, o que está se tornando uma ameaça crescente para a saúde pública8.
Para melhorar o uso de antibióticos e para preservar a sua effectivenessas o máximo possível, a Organização Mundial de saúde lançou um plano de ação global sobre a resistência antimicrobiana em 20159. Programas de manejo de antibióticos constituam um pilar essencial da utilização prudente de antimicrobianos em saúde pública estratégias10, ajudando os médicos a melhorar a qualidade do atendimento ao paciente11 e, ao mesmo tempo, significativamente reduzir a resistência aos antibióticos de12. Antimicrobiana de dosagem em pacientes individuais através da aplicação de drogas terapêuticas (TDM) de monitoramento é um instrumento-chave nesta contexto13.
Até à data, TDM disponível comercialmente ensaios estão disponíveis somente para o glicopeptídeo antibióticos e aminoglicosídeos. A quantificação de substâncias provenientes de outras classes comumente requer um desenvolvimento in-house método ou a validação que pode ser trabalhoso. Nós, portanto, apresentamos detalhadamente o protocolo para um ensaio de espectrometria de massa base robusto que pode ser usado para a quantificação dos antibióticos mais relevantes na UTI dentro de suas clínicas relevantes concentração varia14. O método foi recentemente estabelecido em nossas instalações de espectrometria de massa e tem sido aplicado para a rotina de TDM na UTI desde então. O procedimento usa uma configuração analítica simples e simples com uma limpeza da amostra uniforme, permitindo a rápida implementação de antibiótico TDM em muitas instalações com capacidades de espectrometria de massa.
O protocolo descrito aqui foi otimizado para a quantificação de cefepime, meropenem, ciprofloxacina, moxifloxacina, linezolida e piperacillin no soro humano, usando cromatografia líquida de diluição de isótopos (LC) em combinação com um tandem mass espectrometria (MS/MS). Para a diluição do isótopo metodologia de LC-MS/MS, compostos rotulados de isótopos estáveis são adicionados a uma amostra de interesse com uma matriz específica (por exemplo, o soro). Isótopo-rotulado padrões podem ser distinguidos de suas contrapartes sem rótulo, ou seja o analito de interesse, devido a diferentes pesos moleculares da molécula natural e seus produtos de fragmentação, denominados uma transição de pai-íon-para-filha-ion. Como isótopo-rotulado compostos têm um comportamento geral, físico-químico quase idêntico em comparação com suas contrapartes sem rótulo, que são padrões internos ideais para o MS/MS, permitindo uma quantificação do analito quase independente de matriz com um elevado grau de precisão de15. Hoje em dia, muitos estáveis isótopo-rotulado padrões internos que podem ser usados para quantificação da pequeno-molécula, incluindo a TDM de antimicrobianos, estão disponíveis comercialmente.
A separação cromatográfica de analitos antibióticos no protocolo descrito é executada com uma C8 alquil-comprimento cadeia reversa-fase coluna analítica (100 mm x 2,1 mm, 3 µm-tamanho de partícula). Durante o desenvolvimento do método, os fatores internos padrão normalizado matriz para todos os analitos foi entre 94,6% e 105,4%, com um coeficiente de variação de ≤8.3%14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste manuscrito, relatamos o protocolo para um método de massa baseado em espectrometria de tandem simples e robusta para a quantificação dos antibióticos usados com frequência em ICU19, cefepime, meropenem, ciprofloxacina, moxifloxacina, linezolida, e piperacillin14. Uma planilha acompanha o manuscrito para a preparação de soluções estoque antibióticas, calibradores e controles de qualidade, tendo em conta a pureza dos antibióticos e o peso molecular do seus co…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecer Dr. Schütze por sua ajuda com o que estabelece o método apresentado e Dr. Zoller pela valiosa contribuição a respeito do intervalo de calibração adequada. Os autores também reconhecem a equipe técnica do centro de espectrometria de massa.
Materials
| cefepime hydrochloride | Sigma-Aldrich | 1097636 | USP Reference Standard |
| meropenem trihydrate | Sigma-Aldrich | Y0001252 | EP Reference Standard |
| ciprofloxacin | Sigma-Aldrich | 17850 | |
| moxifloxacin hydrochloride | Sigma-Aldrich | SML1581 | |
| linezolid | Toronto Research Chemicals | L466500 | |
| piperacillin sodium salt | Sigma-Aldrich | 93129 | |
| cefepime-13C12D3 sulfate | Alsachim | C1297 | Isotope labelled internal standard for cefepime |
| meropenem-D6 | Toronto Research Chemicals | M225617 | Isotope labelled internal standard for meropenem |
| ciprofloxacin-D8 | Toronto Research Chemicals | C482501 | Isotope labelled internal standard for ciprofloxacin |
| moxifloxacin-13C1D3 hydrochloride | Toronto Research Chemicals | M745003 | Isotope labelled internal standard for moxifloxacin |
| linezolid-D3 | Toronto Research Chemicals | L466502 | Isotope labelled internal standard for linezolid |
| piperacillin-D5 | Toronto Research Chemicals | P479952 | Isotope labelled internal standard for piperacillin |
| methanol | JT Baker | 8402 | |
| HPLC grade water | JT Baker | 4218 | |
| formic acid | Biosolve | 6914132 | |
| acetic acid | Biosolve | 1070501 | |
| ammonium formate | Sigma-Aldrich | 70221-25G-F | |
| tert-Butyl methyl ether | Merck | 101845 | |
| Fortis 3 μm C8 100 * 2.1 mm | Fortis | F08-020503 | |
| Ti-PEEK-encased Prifilter (2 μm) | Chromsystems | 15011 | |
| 2795 Alliance HPLC system | Waters | 176000491 | |
| Quattro micro API Tandem Quadrupole System | Waters | 720000338 | |
| QuanLynx 4.1 software | Waters | / | Data evaluation software provided by the mass spectrometer manufacturer |
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