Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

İzotop seyreltme HPLC-MS/MS kritik hastalıklar içinde antibiyotik ile tedavi edici ilaç izleme multiplex

doi: 10.3791/58148 Published: August 30, 2018

Summary

Burada bir tandem kütle spektrometresi tabanlı protokol sık kullanılan antibiyotikler miktar yoğun bakım üniteleri, yani cefepime, meropenem, Siprofloksasin, moxifloxacin, linezolid ve piperacillin mevcut.

Abstract

Tedavi edici ilaç antibiyotik hastane antibiyotik yönetim programlarının uygulanması açısından özellikle birçok klinik tesislerinde izlemek için artan bir talep var.

Geçerli çalışma, biz cefepime, meropenem, Siprofloksasin, moxifloxacin, linezolid ve piperacillin, yaygın olarak kullanılan miktar için bir çok katmanlı yüksek performanslı sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometresi (HPCL-MS/MS) iletişim kuralı mevcut yoğun bakım ünitelerinde antibiyotik. Yöntemi daha önce kapsamlı bir şekilde Avrupa İlaç Ajansı kılavuz göre doğrulandı.

Hızlı örnek temizleme sonra analitler 4 dakika içinde bir C8 ters fazlı HPLC sütun ayrılmış ve karşılık gelen kararlı izotop etiketli iç standartları ile electrospray iyonlaşma (ESI +) kütle spektrometresi birden çok tepki sayılabilir (MRM) izlemeye zaman. Sunulan yöntemi ile Tekdüzen kromatografik koşulları ayarlama, günlük ve güçlü antibiyotik tedavi edici ilaç klinik laboratuarlarda izlemek için izin veren bir basit araçları kullanır. Kalibrasyon eğrisi böylece minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC) yakın antibiyotik miktarda duyarlı bakteri ve bolus ile elde edilen en yüksek konsantrasyonları (Cmax) dahil olmak üzere farmakokinetik konsantrasyon aralığı aşıyor Yönetim rejimleri. Örnek temizleme önce serum seyreltme zorunluluk yönetilen bir antibiyotik için eğri altındaki alan birden fazla ölçümleri elde edilebilir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Her ne kadar antibiyotik tıp pratiği devrim, şiddetli bakteriyel enfeksiyonlar önde gelen nedenidir morbidite ve mortalite kritik hastalıklar1kalır. Bu bağlamda, komut istemi bir uygun anti infective yeterli dozda en üstte yer alan önemli hastalık denetim2için bir ilçedir.

Kanıt büyüyen bir vücudun geniş spektrumlu antibiyotik ile ampirik tedavi hasta nüfus karmaşıklığı ile giderek daha sorunlu hale geliyor gösterir. Bu özellikle yoğun bakım üniteleri (ICU), nerede anahtar farmakokinetik (PK) parametreleri muazzam bir arası bireysel değişkenliği sık3,4görülmektedir doğrudur. Buna göre ICU hastaların yakın alt terapötik düzeylerinin yetersiz tedavi başarı5,6tehlikesi ile etkilenir. Sonra tekrar, hastalara gereksiz yere hiçbir klinik yarar7ile ciddi advers olaylar neden olabilir aşırı yüksek antibiyotik konsantrasyonları maruz kalır. Antibiyotik kötüye ve yetersiz dozaj halk sağlığı8için büyüyen bir tehdit haline geliyor antibiyotik direnci yayılması da yol açtı.

Mümkün olduğunca uzun süre antibiyotik kullanımı artırmak için ve kendi effectivenessas korumak için Dünya Sağlık Örgütü 20159antimikrobiyal direnç bir küresel eylem planı başlattı. Antibiyotik yönetim programları Ulusal Halk Sağlığı stratejileri10hasta bakımı11 ve aynı zamanda kalitesini önemli ölçüde artırmak için klinisyenler yardım, ihtiyatlı antibiyotik kullanımının temel bir temel taşı teşkil antibiyotik direnci12azaltılması. Antimikrobiyal tedavi edici ilaç uygulanması yoluyla bireysel hastalarda dozlama (TDM) izleme bir anahtar bu bağlam13' te aracıdır.

Bugüne kadar piyasada bulunan TDM deneyleri glycopeptide antibiyotik ve aminoglikozitler için kullanılabilirdir. Diğer sınıflardan maddelerin miktar yaygın bir in-house Yöntem geliştirme veya hantal olabilir doğrulama gerektirir. Biz, bu nedenle, kendi klinik ilgili toplama aralıkları14içinde yoğun bakımda antibiyotikler en uygun miktar için kullanılan güçlü bir kütle spektrometresi tabanlı tahlil için protokol ayrıntılı olarak mevcut. Yöntem kütle spektrometresi tesisimizde son zamanlarda kuruldu ve o zamandan beri rutin yoğun bakımda TDM için uygulanan. Yordamı kütle spektrometresi yetenekleri ile birçok tesislerinde antibiyotik TDM hızlı uygulama için izin veren bir üniforma örnek Temizleme ile kolay ve basittir analitik ayarını kullanır.

Burada açıklanan protokol cefepime, meropenem, Siprofloksasin, moxifloxacin, linezolid ve piperacillin bir tandem ile birlikte İzotop seyreltme sıvı kromatografi (LC) kullanarak insan serumda miktar için optimize edildi kitle spektrometresi (MS/MS). İzotop seyreltme için LC-MS/MS metodoloji kararlı izotop etiketli bileşikler (Örneğin, serum) belirli bir matris ile ilgi bir örnek eklenir. İzotop etiketli standartları yani analit doğal molekül ve bir üst iyon kızı iyon geçiş olarak adlandırdığı parçalanma ürünlerinin farklı molekül ağırlıkları nedeniyle ilgi onların etiketlenmemiş karşılığından ayrılır. İzotop etiketli bileşikler için etiketlenmemiş kendi meslektaşı karşılaştırıldığında hemen hemen aynı bir genel olarak fizikokimyasal davranış var onlar MS/MS, hemen hemen matris bağımsız analit miktar yüksek düzeyde izin için ideal kendi standartlarına şunlardır doğruluk15. Günümüzde, antimicrobials, TDM dahil olmak üzere küçük molekül miktar için kullanılabilecek pek çok kararlı izotop etiketli kendi standartlarına ticari olarak kullanılabilir.

Açıklanan protokolündeki antibiyotik analitler kromatografik ayırma bir analitik C8 alkil-zincir-uzunluk ters fazlı sütun (100 mm x 2.1 mm, 3 µm parçacık boyutu) gerçekleştirilir. Yöntem geliştirme sırasında bütün analitler için iç standart normalleştirilmiş matris etkenler %94.6 ve %105.4, ≤8.3%14varyasyon katsayısı ile arasında yapıldı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Not: Bu bir duman mahallede metanol gibi organik çözücü işlerken çalışmak için tavsiye edilir. Tüm arabellekleri ve mobil aşamaları hacimsel şişeler içinde hazır olun. Başka şekilde belirtildiği takdirde çözümleri oda sıcaklığında 1 ay sonra hazırlık için saklanır.

1. hazırlanması Kalibratörler ve kalite kontrol örnekleri

Not: Stok ve spike çözümleri hazırlanması için karşılık gelen bir veri analizi sayfasında Ek dosyaverilir. İzlenebilirlik nedenlerden dolayı üretici, katalog numarası ve bir lot numarası her antibiyotik karşılık gelen sütunları ekleyin. 4 ° C soğuk depoda tüm antibiyotiklere dağıtılması ve çalışma zamanı olabildiğince kısa tutmak.

  1. 100 mL % 25 metanol su hazırlamak: mutlak metanol ile 25 mL 100 mL volumetric flask prefill ve ilâ 100 mL distile su ile doldurun.
  2. 10 mL suda 200 mM asetik asitin hazırlamak: 10 mL volumetric flask HPLC sınıf su ile 9 mL prefill, buzul asetik asit (% 99.5 saflıkta, 17.4 M) 115 µL eklemek ve distile su ilave 10 mL.
  3. 25 mL suda ıslatın ve 20 mM asetik asit % 25 metanol hazırlamak: 2.5 mL sulu 200 mM asetik asit çözeltisi ile 25 mL volumetric flask prefill, mutlak metanol 6.25 mL ekleyin ve şişeye 25 ml distile su ile doldurunuz.
  4. 15 mL konik tüpler antibiyotik uygun miktarda Ek dosya Başlangıç Ağırlıksütun içinde açıklandığı gibi tartmak için bir hassas ölçek kullanın.
  5. Fluorkinonlar, Siprofloksasin ve 20 mM asetik asit de dahil olmak üzere % 25 metanol-su moxifloxacin hisse senedi çözümleri hazırlayın. Bunu yapmak için ilgili birimin ağırlıklı miktarları "son hacim" sütununa Ek dosya açıklandığı gibi ekleyin. Hızla bir ultrason banyo 2 min için ve yoğun vortexing tarafından florokinolon antibiyotik geçiyoruz.
  6. Cefepime, meropenem, linezolid ve piperacillin % 25 metanol suda hisse senedi çözümleri hazırlayın. Bunu yapmak için ilgili birimin ağırlıklı miktarları Ek dosya sütun son hacim içinde açıklandığı gibi ekleyin ve hızla antibiyotikler tarafından yoğun vortexing geçiyoruz. Meropenem son madde olarak geçiyoruz.
  7. Tüm antibiyotiklere hisse senedi çözümleri on kat konsantre spike-çözümler vermeye Ek dosya karşılık gelen hisse senedi çözüm hacmi grafikte açıklandığı gibi birleştirin.
  8. Uyuşturucu ücretsiz serum dokuz birimleri ile serum Kalibratörler 0-7 elde etmek için on kat konsantre spike çözümleri bir güç spike ve kalite kontrol (QC) A – ö. Örneğin, 10 mL polipropilen tüp içinde serum 4.5 mL 0.5 mL spike çözeltisi ekleyin ve 15 dakika 50 rpm bir silindir karıştırıcı 4 ° C soğuk depoda kuluçkaya.
  9. Tekrarlayan bir pipet Kalibratörler ve QCs 100 µL aliquots 1,5 mL polipropilen tüplerde oluşturmak için kullanın.
  10. Kalibratörler, kalite kontrol ve-80 ° C'de antibiyotik hisse senedi çözümler altı aya kadar depolar.
  11. Her antibiyotik için Ayrıca 1000 mg/L tek bir antibiyotik içeren bir temiz çözüm hazırlayın. (Örneğin, Siprofloksasin, % 25 metanol-su kullanımı da dahil olmak üzere 20 mM asetik asit için) uygun bir eritici karşılık gelen hisse senedi çözümle sulandırmak.
    Not: Düzgün antibiyotik çözümleri araç ayarlamak için gerekli olan sadece.

2. kendi standartlarına karışımı hazırlanması

Not: Kendi standartlarına izotop etiketli karşıtları, bir örnek için örnek temizleme sırasında eklenen analitler ilgi vardır. Kendi standartlarına etiketlenmemiş karşılıkları için hemen hemen aynı genel olarak Fizikokimyasal özellikleri gibi belirli bir örnek matris etkileri için telafi etmek.

  1. Bir 10 mL sallamak şişesi 5 mL mutlak metanol de ekleyerek 10 mL % 50 metanol su hazırlamak ve ilâ 10 mL distile su ile doldurun.
  2. 10 mL % 50 metanol 20 mM asetik asit de dahil olmak üzere su hazırlamak. Bunu yapmak için bir 10 mL şişesi 200 mM asetik asit 1 mL ekleyin, mutlak metanol 5 mL ekleyin ve ilâ 10 mL distile su ile doldurun.
  3. 1000 mg/L doğrudan üretici tarafından sağlanan şişeleri ile kendi standartlarına (IS) hisse senedi çözümler üretmek. Cefepime -13C12D3 sülfat distile su, meropenem-D6, linezolid-D3ve piperacillin-D%5 50 metanol-su çözümünde geçiyoruz. 20 mM asetat ve moxifloxacin hidroklorid -13C1D3 ' te 20 mM asetat ile distile su ile Siprofloksasin-D%8 50 metanol-suda çözülür.
  4. Beş kat yoğun iç standart karışımı vermeye 1,5 mL polipropilen boru IS hisse senedi çözümlerinde birleştirin. Cefepime -13C12D3, meropenem-D6, Siprofloksasin-D8, moxifloxacin hidroklorid -13C1D3, 2 µL linezolid-d 2 µL 1 µL 10 µL 10 µL Ekle 3ve piperacillin-D5 965 µL % 25 metanol-su için 10 µL.
  5. İç standart stok çözümleri ve beş kat konsantre IS karışımı-80 ° C'de depolayın

3. hasta örnek depolama

Not: serum kısa sürede elde edilir ve donmuş numuneler soğuk zincir korunur sağlamak.

  1. Tam kan serumu koleksiyonu tüpler toplamak.
  2. Kan pıhtısı 20-30 dakika oda sıcaklığında izin.
  3. Serum Santrifüjü 2.000 x g 10 dk de tarafından kandan ayırın.
  4. Süpernatant temiz polipropilen boru için transfer.
  5. Bu denetlesinler kadar serum-80 ° C'de altı ay depolama yapar. Alternatif olarak, örnekleri-20 ° C'de 3 gün depolama yapar

4. kromatografi için arabellek hazırlık

  1. 1 M amonyum Formiat su hazırlamak için 100 mL 100 mL sallamak şişesi kullanarak HPLC sınıf su amonyum Format 6.306 g geçiyoruz. 4 ° C'de 1 ay çözüm depolama yapar
  2. Belgili tanımlık hareket eden hazırlamak [10 mM amonyum Format] su formik asit (99.9:0.1 v/v) aşama. 1000 mL volumetric flask yaklaşık 500 mL HPLC sınıf su prefill, formik asitin 1 mL ve 10 mL 1 M amonyum Formiat çözeltisi ekleyin ve 1000 mL HPLC sınıf su ile doldurun. Mobil faz A temiz cam şişe aktarmak ve HPLC sisteme bağlayın. Mağaza oda sıcaklığında 2 hafta kadar bir mobil faz.
  3. Mobil faz B. Transfer HPLC Sınıf mutlak metanol temiz cam şişe içine hazırlamak ve HPLC sisteme bağlayın.
  4. İğne solvent yıkama ve karşılık gelen tüp mobil faz B. içeren cam şişe bağlanmak gibi mutlak metanol kullanın
  5. Mühür ve tasfiye çözücü metanol-su-formik asitin esterleri (7:92.9:0.1, v/v/v) oluşturur. 1000 mL volumetric flask yaklaşık 500 mL distile su prefill, mutlak metanol, formik asit, 1 mL 70 mL ekleyin ve 1000 mL distile su ekleyin. Çözücü bir temiz cam şişe aktarmak ve HPLC sistemi ile bağlayın.
    Not: Çeşitli Otomatik Örnekleyici Sistemleri hem güçlü ve zayıf iğne yıkama çözücü kullanın. Böyle bir durumda yıkama çözümler üreticinin önerilerini göre hazırlayın. Örneğin, metanol-su-isopropylic alkol (70:20:10, v/v/v) ile güçlü yıkama ve su-metanol (95:5, v/v) ile zayıf yıkama yapın.

5. araç ayarlama

Not: Belirli bir kütle spektrometre yöntemi up için bu adım gerçekleştirilir.

  1. Temiz 1000 mg/L analit ve iç standart çözümler 1:10 veya 1: 100 Dedektör sinyal şiddetlerde bağlı olarak mobil faz A ve B (50: 50, v/v), bir karışımı oranında seyreltin. Autotune fonksiyonu ile kütle spektrometre ayar ya da aşağıdaki ana-kız iyonları geçişler14için elle ayarlama yapmak: cefepime (481.0 > 167.0/395.7), cefepime -13C12D3 (485.1 > 167.1 / 400,0), meropenem (384.1 > 114.0/141.0), meropenem-D6 (390.1 > 114.0/147.2), Siprofloksasin (332.0 > 231.0/245.0), Siprofloksasin-D8 (340.1 > 235.1/249.3), moxifloxacin (402.0 > 261.0/383.9), moxifloxacin-13 C1D3 (406.1 > 265.1/388.0), linezolid (338.0 > 235.0/296.0), linezolid-D3 (341.1 > 235.1/297.1), piperacillin (518.0 > 143.0/358.9) ve piperacillin-D5 (523.1 > 142.8/364.1).
  2. Autotuning ile aletleri için autotune fonksiyonu dedektörleri ile gerilim ve MS giriş ayarlarını otomatik olarak ayarlamak için kullanın.
  3. Optimum (genellikle maksimum) kadar (Örneğin, çarpışma gerilim ve çarpışma enerji) ayarları elle ayarlama ile aletleri ayarlamak için sinyal yoğunluğu için her üst ve kızı iyon detektörü, elde edilir. Örneğin, bir karıştırma tee takın, mobil faz A ve B (50: 50, v/v) 0.5 mL/dk teslim ve sürekli olarak temiz antibiyotik veya iç standart 0.1 mL/dk debi ile demlemek.

6. HPLC-MS/MS Set-up

Not: Özellikleri kütle spektrometre, HPLC sistemi (Otomatik Örnekleyici dahil olmak üzere) ve karşılık gelen yazılım üreticisine bağlıdır. Kütle Spektrometre parametreleri ve yıkama yordamı üreticinin önerilerini göre adapte.

  1. Kütle Spektrometre parametreleri karşılık gelen içinde saklamak 'MS ayar dosyası '. Electrospray iyonlaşma olumlu modunda (ESI +) bütün analitler için kullanın. İyon kaynağı ayarları için kullanılan araç uyum (Örneğin, 1.5 kılcal bir gerilim kV, kaynak sıcaklığı 120 ° c, 400 ° C desolvation sıcaklığını, 600 L/h bir desolvation gaz debisi, bir RF objektif voltaj 0.1 V ve 80 MS Işınma Zamanı).
  2. Analit ve kendi standartlarına ayar parametreleri (Örneğin, kapiller gerilim, çarpışma enerji) belirtin bir 'MS dosya '.
  3. Otomatik Örnekleyici koşulları aşağıdaki gibi olarak ayarla 'giriş dosyası ': numune sıcaklığı 10 ° c ile bir limit ± 5 ° C; 1 x tasfiye-yıkama-tasfiye ile 600 µL, yıkama sırası birim yedek temizle.
  4. Yukarıda bahsedilen içinde 'giriş dosyası ', set akış oranı 0,4 veya 0.5 mL/dak, çalışma süresi 4 dk, 345 bar basınç yüksek limit ve sütun sıcaklığı 30 ° c ± sınırı ile 5 ° C. Mobil Aşama A ve B solvent adını ekleyin ve bunları sırasıyla % 7 B/93% A, ayarlayın.
  5. Kromatografik degradede programı 'giriş dosyası ' aşağıdaki gibi: 0.00-0,10 min % 7 mobil faz B/93% A, 0.11-0,60 ile min ile % 65 mobil faz B/35% A, 0.61-2,10 min % 95 mobil faz B/5% A, 2.11-4,00 min % 7 mobil faz B/93% A. ile
    Not: Ekstra-sütun hacim, soygun birimi enstrümantal platform ve USP < 621 > Kromatografi kılavuz16açıklandığı gibi analit saklama faktörler için hesaplayın.

7. örnek ölçüm ana dosyası

Not: İle 'örnek ölçüm ana dosya ', hasta numuneleri belirtilir, HPLC-MS/MS Analizi başlatılır ve veri değerlendirme gerçekleştirilir. Düşük ve yüksek kalite kontrol çift de dahil olmak üzere iki ayrı şablon dosyaları oluşturulur; bir şablon QC çift A ve C, diğer bir QC çift B ve d içerir

  1. Yeni bir 'örnek ölçüm ana dosya '. Yukarıda bahsedilen seçin 'MS ayar dosyası ', 'MS dosya 've bunları her örnek satırı ekleyin ve enjeksiyon birimi ile 15 µL belirtilecek 'giriş dosyası' (Bölüm 6).
  2. Artan sırada, "örnek metni" Kalibratörler 0-7 ve kalite kontrol (QC) çift a/c veya QC çifti B/D için ekleyin.
  3. Örnek türü belirtin. Örnek türü "standart" Kalibratörler ve "QC" kalite kontrol çiftleri için seçin.
  4. Her antibiyotik madde konsantrasyonu karşılık gelen Kalibratörler ve kalite kontrol (elektronik tablo, konsantrasyon [µg/mL] Cal 7-Cal 0, QC/c veya B/D, bakın) belirtin.
  5. Program 'veri değerlendirme yöntemi '. (Bölüm 5) ayarlama aracı sırasında optimize geçişleri kullanın. Her antibiyotik karşılık gelen izotop etiketli standart (Örneğin, meropenem - meropenem-D6) ile aynı.

8. örnek temizleme ve HPLC-MS/MS Analizi

Not: her örnek toplu işlem için bir düşük ve yüksek antibiyotik konsantrasyon ile (QC A/C veya QC B/D) ayarla eşleştirilmiş bir kalite kontrol işlenen analiz ve. Farklı parçalar arasında alternatif bir sýrada eşleştirilmiş QC örnekleri kullanılır (seçin,Örneğin, 1, gün 'örnek ölçüm ana dosya ' QC dahil a/c çifti; 2 günde bir de dahil olmak üzere QC çift B/D seçin. Serum numuneleri işlenmesi Şekil 1' de gösterilmiştir.

  1. Yağış Ajan % 10 metil -terthazırlamak-bütil eter metanol (10:90, v/v) içinde (Örneğin, prefill 25 mL hacimsel şişesi ile 2.5 mL metil -tert-butil eter ve mutlak metanol ile 25 mL doldurun).
  2. C8 ters faz sütun odasına koyun. HPLC ve akış yönünde kütle spektrometre bağlayın.
  3. Örnek liste oluşturmak. Buna karşılık gelen açın 'örnek ölçüm ana dosya ' şablon ve listeye işlenmesi gereken hasta numuneleri ekleyin. 20 hasta numuneleri grupları oluşturmak ve onlara karşılık gelen kalite kontrol çift kanat.
  4. Islak-Başbakan HPCL sistemini kullanarak 'giriş dosyası ' kontrol yazılımı: "ıslak Başbakan" işlevi % 50 mobil faz A/50% B ayarla ve ıslak-Başbakan bir akış hızı 1 mL/dk ile 2 dk için.
  5. Şırınga yenileyin. Bunu yapmak için kontrol yazılımı 600 µL 6 darbeleri yürütmek.
  6. C8 ters faz sütun equilibrate. Belgili tanımlık bilgisayar yazılımı kullanarak akış içinde açmak 'giriş dosyası ' ve üstüne sifonu %7 ile mobil faz B/93% A en az 5 dk, bir akış hızı 0.5 mL/dak doğrulama kullanarak sütun sıcaklığı 30 ° c
  7. Hasta numuneleri, kalibratörler 0-7, bir aliquot ve bir kalite kontrol çift çözülme (ya A / B veya C/D).
  8. Tekrarlayan bir pipet ile bir kaç saniyeliğine 100 µL Kalibratör, QC örnek veya bir 1,5 mL polipropilen boru ve girdap tüp hastanın serum 25 µL iç standart karışımı ekleyin.
  9. Karışımı bir benchtop shaker (Örneğin, 1200 rpm) üzerinde oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
  10. Tekrarlayan bir pipet ile yağış reaktif 150 µL örnek iç standart karışıma ekleyin.
  11. Yine, girdap tüp birkaç saniye ve bir benchtop shaker (Örneğin, 1200 rpm) üzerinde oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
  12. Süspansiyon 20.000 x g masa üstü bir santrifüj 4 ° C'de 10 dakika içinde de santrifüj kapasitesi
  13. Bir cam şişe bir mikro-INSERT ile kullanma HPLC sınıf su ile süpernatant 1:3 oranında seyreltin ve Otomatik Örnekleyici olarak işlenmiş örnekleri yükleyin.
  14. HPLC-MS/MS Analizi el ile başlatma yeri 'örnek ölçüm denetim dosyası '.
    Not: uzun süreli depolama için analitik sütun üreticinin tavsiye [Örneğin, 0,5 mL/dk metanol-su (50: 50, v/v)] faz çöküşü önlemek için göre kanül.

Figure 1
Şekil 1: örnek temizleme şematik Gösterim. Protein yağış yüksek merkezkaç kuvveti, yoğun bir Pelet verir ve net süpernatant, gösteren bu protein yağış tamamlanmıştı. Tüm işlem zamanı örnek Temizleme, kromatografik ayırma ve MS/MS analizi de dahil olmak üzere yaklaşık 30 dakika var. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

9. kalite değerlendirme ve miktar

  1. Buna karşılık gelen örnekleri işlemek için açmanız 'örnek ölçüm denetim dosyası ', Kalibratörler, kalite kontrol ve hasta numuneleri seçin ve onlarla birlikte değerlendirmek 'antibiyotik miktar yöntemi '.
  2. Belirli bir analit için zirveleri düzgün entegre olup olmadığını kontrol edin. Tepeleri her Kalibratör, QC ve hasta örnek için kontrol edin ve el ile onları reintegrate temel gerekirse.
  3. Kalibrasyon eğrisi çalışma ve aşağıdaki kalite kriterleri karşılayan olup olmadığını inceleyin: a) doğrusallık tüm kalibrasyon aralığı, b) bir kalibrasyon katsayısı r2 > 0.995, c) her kalibrasyon ± % 15 içinde standart sapma nominal değer, ± % 20 gerekli olduğu miktar (LLOQ), alt sınırı dışında.
  4. Yukarıda belirtilen kriterleri ile uyumlu olmayan bir kalibrasyon standart reddetmek ve regresyon çözümlemesi dahil olmak üzere kalibrasyon eğrisi yeniden değerlendirmek.
  5. Kalite denetimleri çalışma ve sapmalar ± % 15 içinde nominal değerli olup olmadığını inceleyin.
  6. Hasta bir örnek konsantrasyonu yüksek Kalibratör konsantrasyonu aşarsa, distile su ile örnek kadar 1:5 (Örneğin, 100 µL serum artı 400 µL distile su) örnek temizleme önce oranında seyreltin. Adımları 8,8-8.14 belirli bu örnek için reperform ve bu reprocess.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Açıklanan iletişim kuralını kullanarak, tipik bir kromatografik Şekil 2' de tasvir edilir. Amerika Birleşik Devletleri Pharmacopeia (USP) Kromatografi yönergeleri16göre mevcut sistemde sütun ölü cilt ~0.22 mL ve (enjektör, boru ve bağlayıcıları içeren) ekstra sütunlu birimle ~0.08 mL, kararlıydı veren ~0.30 mL soygun hacmi. Bütün analitler için hesaplanan saklama faktörler (için cefepime) - 2,8 vardı 4.2 (için piperacillin).

Figure 2
Şekil 2: normalleştirilmiş sinyal yoğunluklarda ile tipik analitik kromatografik. Antibiyotikler aşağıdaki sıraya göre eluting: cefepime (yeşil), meropenem (kahverengi), Siprofloksasin (kırmızı), moxifloxacin (siyah), linezolid (turuncu) ve piperacillin (mor). Saklama kez hangi dakikada verilir ve analit tepe simetri, mobil aşama, akış hızı, kromatografi boru ve analitik sütun yaş tam kompozisyon bağlı olarak değişebilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3A içeren bir örnek grafik listesi için işlenmiş örnekleri Kalibratörler 0 - 7 de dahil olmak üzere, ("Kalibrator 0" - "Kalibrator 7"), kalite kontrol ve enjeksiyon numarası ile belirtilmiş olan hasta sera (#); örnek kimliği metin (Örnek metin); ölçülen konsantrasyon ın mg/L (konsantrasyonlu); boş, standart, kalite kontrol veya hasta örnek (türü); örnek türü mg/L (Standart konsantrasyon); Kalibratörler nominal konsantrasyonu Analitik tutma zamanı (RT); analit/pik alanının en yüksek alan oranıdır Yanıt IS (tepki); nominal konsantrasyon değeri (% Dev); sapma şişe pozisyon (şişe); ve satın alma saat (Acq.Time). Miktar için kullanılan anahtar parametresidir Yanıtyavaş yavaş izotop etiketli eklenen dahili standart sabit miktarı nedeniyle analit konsantrasyon ile artan.

Şekil 3B kalibrasyon eğrisi gösterir. Gerileme, belirlenmesi r2 katsayısı > 0.995 olmalıdır. Aşağıdaki kalibrasyon modeli bu yöntemde açıklanan bütün analitler için kullanılır: eğri türü doğrusal; = kaynak = dahil; Ağırlık = 1 / x; eksen dönüştürme = yok. Verilen örnekte, kalibrasyon eğrisi ve kalite denetimleri tüm kalite kriterleri yerine getirmek: r2 > 0.995 kalibrasyon eğrisi ve sapma (LLOQ dahil) Kalibratörler ve QC örnekler için nominal değeri içinde ± %15 olduğunu.

Ölçülen üst kızı iyon geçişler (MRM) Şekil 3 ciçinde dört doruklarına anda aynı saklama gösterilen verilir: iki üst tepeleri faiz analit için ölçülür iki geçiş tasvir, alt iki doruklarına temsil geçişler için karşılık gelen izotop etiketli dahili standart. Kalite değerlendirmesi için ilgili tutma zaman pencereleri analit Peaks'e görsel olarak kontrol ve el ile temel gerektiğinde reintegrated.

Minimal inhibitör konsantrasyon (MIC) bir hedef farmakokinetik/Farmakodinamik (PK/KD) oranı13,17ulaşmak için gerekli farmakokinetik pozlama tanımlama antimikrobiyal TDM merkezi bileşenidir. Buna göre hedef antibiyotik TDM konsantrasyon seviyeleri etken patojen mikrofon ile ilgili olarak ifade edilir. Beta-laktam antibiyotik eylem zamana bağımlı olduğunu göz önüne alındığında, onların etkinliğini mikrofon 4 x-5 aşan terapötik konsantrasyon başarı ile ekranı x (fT > 4-5 x Mikrofon). Bilinmeyen Bulaşıcı patojenler karşısında zaman hedef yalak toplama ücretsiz (protein bağlı olmayan) piperacillin, bu nedenle, 64 mg/L, yaklaşık 90 mg/L toplam piperacillin18için karşılık gelen aralığıdır.

İlk hasta (örnek #11) aynı zamanda Pseudomonas aeruginosagibi sorun patojenler için yeterli olduğunu 83.4 mg/L piperacillin tatmin edici yüksek serum yalak düzeyi bulunmaktadır. İkinci hasta (örnek #12) yaklaşık 0.2 mg/en düşük Kalibratör (LLOQ) altında olan M, konsantrasyonu vardır. Belki de hasta kurtarıldı ve piperacillin İdaresi kesildi. Bu nedenle, sonuç "< 0,5 mg / L" hastane bilgi sistemi bildirilmektedir. Üçüncü hasta (örnek #13) yalnızca 5,3 mg/L patojenler açık çoğunluğu için yeterli değil bir düşük piperacillin yalak konsantrasyonu vardır. Etkili antimikrobiyal kemoterapi için doktor tarafından dozu artırılmalıdır.

Figure 3
Şekil 3: örnek kalite değerlendirme ve miktar için analit piperacillin. Bu paneller kütle spektrometresi veri analizi temsil eder. (A) Bu panel kalibratörler (Standart, örnekleri #1 - #8), kalite kontrol (QC, örnekleri #9 ve #10) ve hasta sera (örnekleri #11 - #13) dahil olmak üzere örnek liste gösterir. Kalibratör 0 boş analit olmadan, ama dahili bir standart ilavesi ile ifade eder. 9951 9953 temsil QC ö. (B) Bu panel gösterir piperacillin kalibrasyon eğrisi QC B, temsil eder. Nominal Kalibratör konsantrasyonları yüzde sapmalar üst grafikte verilmiştir (y-ekseni: artık), lineer ayar aralığı alt grafik gösterilmektedir. (C) Bu panel piperacillin ve karşılık gelen iç standart piperacillin-D5 hastanın serum örneği #12 için birden fazla reaksiyon (MRM) izleme zamanı gösterir. İki ana-kız iyon geçiş onların tutma zamanı ve ilgili sinyal yoğunluklarda ile sunulmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Ek dosya. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu makale, biz ICU19, cefepime, meropenem, Siprofloksasin, moxifloxacin, linezolid, sık kullanılan antibiyotikler miktar için basit ve sağlam tandem kütle spektrometresi tabanlı yöntemi için protokol raporu ve piperacillin14. Bir elektronik tablo el yazması antibiyotik hisse senedi çözümleri, kalibratörler ve kalite kontrol, antibiyotikler saflığı ve onların counterions molekül ağırlığı dikkate alarak hazırlanması için eşlik eder. Antibiyotiklerin konsantrasyonları oldukça yüksek olduğunu göz önüne alındığında, onların miktar analitik bir bakış açısından belirli hiçbir sorun olmalıdır. Buna göre eminiz bu protokolü çeşitli MS enstrümantal platformlar için geçerlidir. Yöntemi aktarımının, kullanıcıların ekstra sütunlu birim ölçmek için teşvik edilir ve soygun birimi kromatografik sistemlerine ve gradyan başlangıç adapte zaman buna göre16. Yöntemi kurulumu sırasında sistem de etkilenmişimdir için değerlendirilmesi gerektiğini ve gerekirse, boş bir örnek yüksek antibiyotik konsantrasyonları yüksek Kalibratör ve hasta örnekleriyle sonra enjekte edilir gerekir. Kullanıcılar çok fazla iyonları tandem kütle spektrometre girdiğinizde oluşan dedektörü doygunluk olasılığını da göz önüne almalısınız. İlgili dedektörü doygunluğu daha küçük enjeksiyon birimler, daha yüksek bir analit seyreltme sırasında örnek temizleme ve/veya ararken bir hedef analitin (en iyi voltaj ayarları downgradingÖrneğin,) ile ortadan kaldırılabilir.

Diğer yöntemler aksine, hem bir miktar konsantrasyonları mikrofon duyarlı patojenlerin yakın, hem de bir bolus yönetimi ile elde edilen en yüksek konsantrasyonları (cmax) kalibrasyon aralığı sağlar. En yüksek Cmax-yetişkin ilgili profesyonel bilgi sayfalarında FDA ilaç güvenlik veritabanı üzerinde aşağıdaki gibi rapor edilen değerleri: 163.9 mg/L cefepime20, 112 mg/L meropenem21, 4.6 mg/L Siprofloksasin22 için , 4.1 mg/L moxifloxacin23, 21.2 mg/L linezolid24ve 298 mg/L piperacillin25. Hastanın kan dolaşımını antibiyotik toplama izleme sağlar dahil patojenlerin duyarlılık için bir doz ayarlaması, ama eğri farmakokinetik alanında da ile birden fazla kan örnekleme yoluyla elde edilebilir belirli iletişim kuralı.

Birçok antibiyotik (özellikle beta-laktam meropenem) bir kez çözülmüş kimyasal olarak kararsız. Bu protokolü en önemli adım, bu nedenle, hisse senedi çözümleri, kalibratörler ve kalite denetimleri altında soğuk koşulları26,27hazırlıktır. Bu açıdan, en kısa zamanda hasta numuneleri dondurmak için esastır. Serum depolama-80 ° C'de26önerilir, ancak örnekler gösterisi de olabilir bizim istikrar deneyler arka antibiyotiklerin konsantrasyonları (yalak seviyelerde bile) önemli herhangi bir azalma olmadan-20 ° C'de 3 gün saklı.

Daha önce her HPLC-MS/MS analiz hasta örnekleri (Örneğin, Kalibratör 3 ile) bir sistem uygunluk testi yapmak tavsiye. Genel olarak, bir sistem uygunluk testi LC-MS/MS sistem tekrarlanabilirlik doğrulamak için ve ayrıca yapılacak analiz için yeterli olup olmadığını görmek için kullanılır. Böylece, örneğin, azalan sinyal şiddetlerde bir kirlenme gerektiren, sonra onun ile organik bir çözücü temizlik MS süpürme koni kaynaklanır. MS kaynak temiz tutmak için onlar kütle spektrometre ulaşmadan atık için mobil faz "analit-free" kısımlarını yönlendiren Kromatografi sütun sonra aktarma Vana tanıttı olabilir. Öte yandan, genel bir artış basınç zamanla tıkanma sütun belirtebilirsiniz. Sütun artırmak için düşük maliyetli bir precolumn filtre kullanımı uzun ömürlü tavsiye. Basınç yine de bir sorun olmaya devam ederse, 0.4 mL/dak bir debi de bu protokolündeki kromatografik gradyan ile kullanılabilir.

Bir küçük bu teknik kısıtlamasıdır örnek temiz-yukarıya için üç ayrı el ile gerçekleştirilecek adımlar gerektirir, yaklaşık 30 dk toplam dönüş zamanında kaynaklanan izotop etiketli kendi standartlarına yağış aracısı eklemek bazı tasarruf edebilir işlem zamanı. Ancak, bu yalnızca yüksek örnekleme üretilen iş hızları için yapılmalıdır ve yağış ile (Örneğin,-20 ° c), soğukta da kendi standartlarına saklanmasını Ajan vitro yüksek sıcaklıklardaki bozulmasına yol açar.

Açıklanan protokol örnek standart 1,5 mL polipropilen tüplerde işleme için geliştirilmiştir. Yüksek üretim hızı antibiyotik TDM için gerekli olmalıdır, yordamı yeterli santrifüj ekler veya Filtre plakaları ile vakum bir manifold kullanarak çok iyi plaka biçimine yükseltilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Yazarlar Dr Schütze sunulan Yöntem kurma onun yardım için teşekkür ederiz ve Dr Zoller değerli giriş için uygun kalibrasyon aralığı ile ilgili. Yazarlar da kütle spektrometresi tesisinin teknik personel kabul.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
cefepime hydrochloride Sigma-Aldrich 1097636 USP Reference Standard
meropenem trihydrate Sigma-Aldrich Y0001252 EP Reference Standard
ciprofloxacin Sigma-Aldrich 17850
moxifloxacin hydrochloride Sigma-Aldrich SML1581
linezolid Toronto Research Chemicals L466500
piperacillin sodium salt Sigma-Aldrich 93129
cefepime-13C12D3 sulfate Alsachim C1297 Isotope labelled internal standard for cefepime
meropenem-D6 Toronto Research Chemicals M225617 Isotope labelled internal standard for meropenem
ciprofloxacin-D8 Toronto Research Chemicals C482501 Isotope labelled internal standard for ciprofloxacin
moxifloxacin-13C1D3 hydrochloride Toronto Research Chemicals M745003 Isotope labelled internal standard for moxifloxacin
linezolid-D3 Toronto Research Chemicals L466502 Isotope labelled internal standard for linezolid
piperacillin-D5 Toronto Research Chemicals P479952 Isotope labelled internal standard for piperacillin
methanol JT Baker 8402
HPLC grade water JT Baker 4218
formic acid Biosolve 6914132
acetic acid Biosolve 1070501
ammonium formate Sigma-Aldrich 70221-25G-F
tert-Butyl methyl ether Merck 101845
Fortis 3 μm C8 100 * 2.1 mm Fortis F08-020503
Ti-PEEK-encased Prifilter (2 μm) Chromsystems 15011
2795 Alliance HPLC system Waters 176000491
Quattro micro API Tandem Quadrupole System Waters 720000338
QuanLynx 4.1 software Waters / Data evaluation software provided by the mass spectrometer manufacturer
Supplemental File Stock Solutions

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fleischmann, C., et al. Assessment of Global Incidence and Mortality of Hospital-treated Sepsis. Current Estimates and Limitations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193, (3), 259-272 (2016).
  2. Dellinger, R. P., et al. Surviving Sepsis Campaign: international guidelines for management of severe sepsis and septic shock, 2012. Intensive Care Medicine. 39, (2), 165-228 (2013).
  3. Lodise, T. P., Drusano, G. L. Pharmacokinetics and pharmacodynamics: optimal antimicrobial therapy in the intensive care unit. Critical Care Clinics. 27, (1), 1-18 (2011).
  4. Macedo, R. S., Onita, J. H., Wille, M. P., Furtado, G. H. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of antimicrobial drugs in intensive care unit patients. Shock. 39, Suppl 1. 24-28 (2013).
  5. Petersson, J., Giske, C. G., Eliasson, E. Standard dosing of piperacillin and meropenem fail to achieve adequate plasma concentrations in ICU patients. Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 60, (10), 1425-1436 (2016).
  6. Abdul-Aziz, M. H., Lipman, J., Mouton, J. W., Hope, W. W., Roberts, J. A. Applying pharmacokinetic/pharmacodynamic principles in critically ill patients: optimizing efficacy and reducing resistance development. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine. 36, (1), 136-153 (2015).
  7. Imani, S., Buscher, H., Marriott, D., Gentili, S., Sandaradura, I. Too much of a good thing: a retrospective study of beta-lactam concentration-toxicity relationships. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 72, (10), 2891-2897 (2017).
  8. Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats. Pharmacy & Therapeutics. 40, (4), 277-283 (2015).
  9. World Health Organization. Global Action Plan on Antimicrobial Resistance. Available from: http://www.who.int/antimicrobial-resistance/global-action-plan/en (2015).
  10. Pulcini, C. Antibiotic stewardship: update and perspectives. Clinical Microbiology and Infection. 23, (11), 791-792 (2017).
  11. Cairns, K. A., et al. The impact of a multidisciplinary antimicrobial stewardship team on the timeliness of antimicrobial therapy in patients with positive blood cultures: a randomized controlled trial. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 71, (11), 3276-3283 (2016).
  12. Baur, D., et al. Effect of antibiotic stewardship on the incidence of infection and colonisation with antibiotic-resistant bacteria and Clostridium difficile infection: a systematic review and meta-analysis. Lancet Infectious Diseases. 17, (9), 990-1001 (2017).
  13. Roberts, J. A., Norris, R., Paterson, D. L., Martin, J. H. Therapeutic drug monitoring of antimicrobials. British Journal of Clinical Pharmacology. 73, (1), 27-36 (2012).
  14. Paal, M., Zoller, M., Schuster, C., Vogeser, M., Schutze, G. Simultaneous quantification of cefepime, meropenem, ciprofloxacin, moxifloxacin, linezolid and piperacillin in human serum using an isotope-dilution HPLC-MS/MS method. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 152, 102-110 (2018).
  15. Vogeser, M., Seger, C. Pitfalls associated with the use of liquid chromatography-tandem mass spectrometry in the clinical laboratory. Clinical Chemistry. 56, (8), 1234-1244 (2010).
  16. United States Pharmacopeia and National Formulary. Chapter <621>. CHROMATOGRAPHY (USP 37-NF 32 S1). United Book Press, Inc. Baltimore, MD. 6376-6385 (2014).
  17. Wong, G., Sime, F. B., Lipman, J., Roberts, J. A. How do we use therapeutic drug monitoring to improve outcomes from severe infections in critically ill patients? BMC Infectious Diseases. 14, 288 (2014).
  18. EUCAST: European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Information on clinical breakpoint tables. Available from: http://www.eucast.org/clinical_breakpoints/ (2017).
  19. Surveillance der Antibiotika-anwendung und der bakteriellen Resistenzen auf Intensivstationen. SARI information for antibiotic consumption 2016 of all intensive care units participating at SARI. Available from: http://sari.eu-burden.info/auswertung/down/AD-ZEIT.pdf (2016).
  20. Cefepime hydrochloride: Highlights of prescribing information. Available from: https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2016/050679s040lbl.pdf (2016).
  21. Meropenem: Highlights of prescribing information. Available from: https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2008/050706s022lbl.pdf (2006).
  22. Ciprofloxacin hydrochloride: Highlights of prescribing information. Available from: https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2016/019537s086lbl.pdf (2016).
  23. Moxifloxacin hydrochloride: Highlights of prescribing information. Available from: https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2010/021277s038lbl.pdf (2010).
  24. Linezolid: Highlights of prescribing information. Available from: https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2012/021130s028lbl.pdf (2011).
  25. Piperacillin and Tazobactam: Highlighs of prescribing information. Available from: https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2017/050684s88s89s90_050750s37s38s39lbl.pdf (2017).
  26. Zander, J., et al. Effects of biobanking conditions on six antibiotic substances in human serum assessed by a novel evaluation protocol. Clinical Chemistry and Laboratory. 54, (2), 265-274 (2016).
  27. Zander, J., et al. Quantification of piperacillin, tazobactam, cefepime, meropenem, ciprofloxacin and linezolid in serum using an isotope dilution UHPLC-MS/MS method with semi-automated sample preparation. Clinical Chemistry and Laboratory. 53, (5), 781-791 (2015).
İzotop seyreltme HPLC-MS/MS kritik hastalıklar içinde antibiyotik ile tedavi edici ilaç izleme multiplex
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schuster, C., Sterz, S., Teupser, D., Brügel, M., Vogeser, M., Paal, M. Multiplex Therapeutic Drug Monitoring by Isotope-dilution HPLC-MS/MS of Antibiotics in Critical Illnesses. J. Vis. Exp. (138), e58148, doi:10.3791/58148 (2018).More

Schuster, C., Sterz, S., Teupser, D., Brügel, M., Vogeser, M., Paal, M. Multiplex Therapeutic Drug Monitoring by Isotope-dilution HPLC-MS/MS of Antibiotics in Critical Illnesses. J. Vis. Exp. (138), e58148, doi:10.3791/58148 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter