Skalerbar fabrikasjon av elastisk, dobbelt kanalen, Microfluidic Organ Chips
Summary
Her presenterer vi en protokoll som beskriver den fabrikasjon av elastisk, dual channel, orgel chip microfluidic celle kultur enheter for recapitulating organ-nivå funksjonalitet i vitro.
Abstract
Et betydelig antall føre forbindelser mislykkes i farmasøytiske rørledningen fordi dyrestudier ofte ikke forutsi kliniske tiltak i menneskelige pasienter. Human Organ-on-a-Chip (orgel Chip) microfluidic celle kultur enheter, som gir en eksperimentell i vitro plattform for å vurdere effekt, giftighet og farmakokinetiske (PK) profiler i mennesker, kan være bedre prediktorer av terapeutiske effekten og sikkerhet i klinikken sammenlignet dyrestudier. Disse enhetene kan brukes å modellere funksjonen av nesten alle orgel type og fluidically kan kobles gjennom felles endotelet linjert microchannels å utføre i vitro studier menneskelige organ-nivå og hele kroppen-nivå fysiologi uten å utføre eksperimenter på folk. Disse Organ Chips består av to parfyme microfluidic kanaler med en gjennomtrengelig cellegummi membran organ-spesifikke parenchymal celler på den ene siden og mikrovaskulær endothelium, som kan strekkes syklisk å gi organ-spesifikke mekanisk signaler (f.eks puste bevegelser i lunge). Denne protokollen detaljer fabrikasjon av fleksible, dual channel, orgel Chips gjennom deler med 3D trykt formene, slik at kombinasjonen av flere støping og etterbehandling trinnene. Porøse poly (dimethyl siloxane) (PDMS) membraner er støpt med mikrometer store gjennom-hullene ved hjelp silisium pilar matriser under komprimering. Fabrikasjon og samlingen av orgel Chips innebærer utstyr og skritt som kan gjennomføres utenfor en tradisjonell renrom. Denne protokollen gir forskere med tilgang til orgel Chip teknologi for i vitro orgel – og body-nivå studier i stoffet funnet, sikkerhet og effekt testing, samt mekanistisk studier av grunnleggende biologiske prosesser.
Introduction
Her beskriver vi fabrikasjon tokanals, Stangeriaceae Organ-på-Chip (orgel Chip) microfluidic kultur enheter bruker en skalerbar protokoll mottakelig for bruk av forskningsgrupper mangler tilgang til renrom og tradisjonelle myk litografi verktøy. Disse enhetene er utviklet for å recapitulate human organ-nivå funksjoner for forståelse normal og sykdom fysiologi, samt stoff svar i vitro1,2. Kritisk til engineering denne funksjonaliteten er to parfyme microfluidic kanaler med et halvt gjennomtrengelig membran (figur 1). Denne utformingen kan rekreasjon av vev-vev grensesnitt mellom minst to typer vev, vanligvis organ parenchymal celler på én side av porøs membran og vaskulære endotelet på den andre, samt sin eksponering væskestrøm. I tillegg fordi den elastiske polymer, poly (dimethyl siloxane) (PDMS), brukes til å dikte Organ Chip kroppen og membran komponenter, syklisk mekanisk belastning kan brukes på hele konstruert vev-vev grensesnitt via elastiske membran å etterligne den naturlige fysisk microenvironment av levende organer, som bevegelser i lungene og peristalsis i tarmen.
Figur 1: orgel Chip tverrsnitt. Orgel Chips består av to kanaler med en porøs, elastisk membran som kan være plantet med celler på begge sider. Topp kanalen tverrsnitt er 1 mm bred x 1 mm høy, bunnen kanal tvers delene er 1 mm bred x 0.2 mm høy, og vakuum kanaler i både og nedre deler er 0,3 mm bred 0,5 mm høy og linjeavstand 0.3 mm fra fluidic kanalene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Disse elastisk, dual kanal, orgel Chips har blitt brukt for å vise virkningen av puste bevegelse hydrogenion absorpsjon i lungene og narkotikainduserte lungeødem3,4; effekter av peristaltiske bevegelser på differensiering5 og bakteriell overgrowth i tarmen5,6,7; og påvirkning av syklisk forvrengning på grunn av pulsering hjertets på differensiering og modning av glomerular podocytes i nyre8. I tillegg, disse to-lumen enheter som inneholder en endotelet linjert vaskulær kanal atskilt med en ekstracellulær matrix (EFM)-belagt membran fra parenchymal celler i en separat tilgjengelig kanal er godt egnet for karakteristikk av narkotika PK parametere og nye mål funn, som har vært begrenset i enkelt perfusjon kanal systemer. Dessuten flere Organ Chips kan kobles sammen via deres vaskulær kanaler effektivt opprette en menneskelig kropp-på-chips, som kan tilby en attraktiv menneskelige i vitro plattform for therapeutics utvikling9, 10. I motsetning til de fleste mikro-fysiologiske systemer (MPS)11,12,13inneholde orgel Chips to microfluidic kanaler med en porøs membran som forenkler vaskulær-parenchymal vekselsvirkningene til recapitulate i vivo organfunksjon. Dette forenkler ikke bare kobling av ulike organer sammen ved perfusing en vanlig medium kanalene vaskulær, men compartmentalization av vev og væsker etterligner i vivo funksjoner og støtter farmakokinetiske eksperimentering og modellering og i vitro–i vivo ekstrapolering9,10 som er vanskelig eller umulig i enkeltkanals MPS14,15,16. Populariteten til PDMS i microfluidic enheter har ført til utvikling av verktøy å overvinne materialets iboende evne til å absorbere små molekyler10,17. Men nødvendiggjør det store antallet sjetonger som kreves for å støtte biologiske studier der bruk av mikrobielle agens og PDMS-absorberende forbindelser gjør gjenbruk av orgel Chips vanskelig en skalerbar produksjonsprosess for små forskningsgrupper. Protokollen beskrevet her presenterer en metode for enheten fabrikasjon egnet for bruk i akademiske laboratorier, inkludert de mangler tilgang til renrom og myke litografi. Denne protokollen skal utvide tilgang til orgel Chips med et bredt spekter av forskere søker å bruke elastisk, tokanals enhetene for å utforske grunnleggende biologiske prosesser samt translasjonsforskning terapeutiske utvikling.
Leveraging beste praksis fra micromanufacturing felt kombinert med design for produksjon, ble en robust tilnærming utviklet for fabrikasjon Organ Chip enheter i store mengder med høy reproduserbarhet og avkastning. Fabrikasjon protokollen beskrevet her gir en skalerbar metode for orgel Chip produksjon. Vi beskriver bruk av en valgfri Mold-på-plass Jig (MiP, designdetaljer i Tilleggsresultater materialer) kombinert med pakning strimler aktivere skalere opp Casting PDMS komponenter. Den skinnende siden av polyuretan strimler produserer optisk glatt PDMS deler mens teksturerte siden forenkler demolding. Vi beskriver også bruk av en valgfri automatisert membran Fabricator (AMF) som gir ensartet komprimering av membran wafer muggsopp ved herding fabrikere opptil 24 membraner per satsvis. Designen er bredt aktuelt for studier av organer som består av vev som mekanisk belastning og perfusjon og disse brikkene kan produseres med lave chip til chip variasjon i mengder som kreves for å møte behovene til små og store forskning grupper. Arbeidsflyten er mottakelig for et parti- eller samlebånd format og lett kompatibel med kvalitet vurdering protokoller for kontroll over produksjonsprosessen, opplæring og forståelsesfull feilsøking. Vi håper at denne protokollen vil utvide tilgang til funksjonene i tokanals, elastisk, orgel sjetonger for grunnleggende og translasjonsforskning forskning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fabrikasjon prosessen er avhengig av høyoppløselig 3D trykt former for mønster PDMS øverst og nederst Organ Chip kroppen komponentene sammen med micromolded porøse PDMS membraner. Denne kritiske tilnærming ble valgt grunn å prototyping kombinert med rask overgang inn skalert opp fabrikasjon og utskifting av verktøy. Topp komponent formene er utformet for mønster porter i nøyaktig steder med definerte vertikale profiler under støping trinnet. Dette ikke bare unngår arbeidskraft involvert i manuelt punching til…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker M. Rousseau og S. Kroll for hjelp med fotografering og videography og M. Ingram, J. Nguyen, D. Shea og N. Wen for bidrag til første fabrikasjon protokollutvikling. Denne forskningen ble sponset av Wyss Institutt for biologisk inspirert i Engineering ved Harvard University og Defense Advanced Research Projects Agency under samarbeidende avtaler #W911NF-12-2-0036 og #W911NF-16-C-0050 og FDA gi # HHSF223201310079C, NIH tilskudd #R01-EB020004 og #UG3-HL141797-01, og Bill og Melinda Gates Foundation gir #OPP1163237 og #OPP1173198 til DEI. Synspunkter og konklusjoner finnes i dette dokumentet er de av forfatterne, og bør ikke tolkes som representerer de offisielle politikk, enten direkte eller indirekte, av Defense Advanced Research Projects Agency, Food and Drug Administration, den National Institutes of Health, eller den amerikanske regjeringen.
Materials
| Personal Protective Equipment | |||
| Hairnet | VWR | 89107-770 | |
| Tyvek lab coat | VWR | 13450-506 | |
| Extended cuff gloves | VWR | 89521-898 | |
| Equipment | |||
| Cutting mat | VWR | 102096-430 | |
| Tile cutter | McMaster-Carr | 26765A31 | |
| Mold-in-place (MIP) top molds | Protolabs, Inc. | custom | printed in Prototherm 12120 |
| Mold-in-place (MIP) bottom molds | Protolabs, Inc. | custom | printed in Prototherm 12121 |
| Duckbill curved forceps | VWR | 63041-864 | |
| Sharp tipped forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | |
| Metal spatula | VWR | 82027-528 | |
| Deep reactive ion etch (DRIE) pillar array wafers | Sensera, Inc. | custom | Four 50 x 50 mm pillar arrays per wafer; pillars 7 um wide, 50 um tall, spaced hexagonally 40 um apart |
| Textured polycarbonate .01” thick | McMaster-Carr | 85585K33 | cut to 45 mm square |
| PDMS blocks (40 x 40 x 5 mm) | n/a | custom | |
| Laminar flow hood | Germfree | BVBI | cast in-house |
| Air gun | |||
| 60°C level oven | |||
| Vacuum desiccator | |||
| Mass balance | accuracy to 0.1 g | ||
| Plasma machine | Diener | Nano | oxygen plasma capability is critical |
| Supplies | |||
| Sylgard 184 poly (dimethylsiloxane) (PDMS) base/curing agent kit | Ellsworth Adhesives | 4019862 | |
| Mixing cup | Ensure adequate ventilation when handling prepolymer due to low levels of ethylbenzene | ||
| 1 mL syringe | VWR | 10099-395 | |
| Cleanroom wipes | VWR | TWTX1080 | |
| 25 x 75 mm glass microscope slides | VWR | 48311-703 | |
| Packing tape | VWR | 500043-724 | |
| Scotch tape | VWR | 500026-873 | |
| Die-cut Polyurethane (PU) strips | Atlantic Gasket, Inc. | custom: AGWI2X3 | 1/8” thick; 60 Durometer Black Polyurethane; 2” x 3” |
| Polycarbonate film .005” thick | McMaster-Carr | 85585K102 | |
| 100 x 100 x 15 mm square gridded petri dishes | VWR | 60872-480 | |
| Aluminum foil | |||
| Optional Equipment | |||
| Thinky PDMS Mixer | Thinky | ARE-310 | |
| Mold-in place (MIP) jig | in-house | screw clamp compression jig | |
| Automated membrane fabricator (AMF) | in-house | pneumatic compression piston array with programmable heater |
References
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Benam, K. H., et al. Engineered In vitro Disease Models. Annual Review of Pathology Mechanisms of Disease. 10 (1), 195-262 (2015).
- Huh, D., et al. A Human Disease Model of Drug Toxicity-Induced Pulmonary Edema in a Lung-on-a-Chip Microdevice. Science Translational Medicine. 4 (159), 159ra147 (2012).
- Huh, D., et al. Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab on a Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).
- Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-Chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integrative Biology. 5 (9), 1130-1140 (2013).
- Kim, H. J., Li, H., Collins, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), E7-E15 (2016).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1 (5), s41551-017-0069–017 (2017).
- Somayaji, M. R., Das, D., Przekwas, A. Computational approaches for modeling and analysis of human-on-chip systems for drug testing and characterization. Drug Discovery Today. 21 (12), 1859-1862 (2016).
- Prantil-Baun, R., et al. Physiologically Based Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis Enabled by Microfluidically Linked Organs-on-Chips. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 58 (1), 37-64 (2018).
- Mahler, G. J., Esch, M. B., Stokol, T., Hickman, J. J., Shuler, M. L. Body-on-a-chip systems for animal-free toxicity testing. Alternatives to laboratory animals: ATLA. 44 (5), 469-478 (2016).
- Miller, P. G., Shuler, M. L. Design and demonstration of a pumpless 14 compartment microphysiological system. Biotechnology and Bioengineering. 113 (10), 2213-2227 (2016).
- Coppeta, J. R., et al. A portable and reconfigurable multi-organ platform for drug development with onboard microfluidic flow control. Lab Chip. 17 (1), 134-144 (2016).
- Wikswo, J. P., et al. Scaling and systems biology for integrating multiple organs-on-a-chip. Lab on a Chip. 13 (18), 3496-3511 (2013).
- Sung, J. H., et al. Using PBPK guided "Body-on-a-Chip" Systems to Predict Mammalian Response to Drug and Chemical Exposure. Experimental biology and medicine (Maywood, N.J.). 239 (9), 1225-1239 (2014).
- Stokes, C., Cirit, M., Lauffenburger, D. Physiome-on-a-Chip: The Challenge of "Scaling" in Design, Operation, and Translation of Microphysiological Systems. CPT: Pharmacometrics & Systems Pharmacology. 4 (10), 559-562 (2015).
- Shirure, V. S., George, S. C. Design considerations to minimize the impact of drug absorption in polymer-based organ-on-a-chip platforms. Lab Chip. , (2017).
- Huh, D., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nature Protocols. 8 (11), 2135-2157 (2013).
- Tran, T. T., et al. Exact kinetic analysis of passive transport across a polarized confluent MDCK cell monolayer modeled as a single barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 93 (8), 2108-2123 (2004).
- Henry, O. Y. F., et al. Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function. Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).
- Maoz, B. M., et al. Organs-on-Chips with combined multi-electrode array and transepithelial electrical resistance measurement capabilities. Lab on a Chip. 17 (13), 2294-2302 (2017).
- Benam, K. H., et al. Matched-Comparative Modeling of Normal and Diseased Human Airway Responses Using a Microengineered Breathing Lung Chip. Cell Systems. 3 (5), 456-466 (2016).
