Масштабируемые изготовление растягивается, двойной канал, орган Microfluidic фишки
Summary
Здесь мы представляем протокол, который описывает изготовление растягивается, двойной канал, орган чип microfluidic клетки культуры устройства для изложив орган уровень функциональности в пробирке.
Abstract
Значительное количество соединений свинца не в конвейере фармацевтической, потому что исследования на животных, часто не предсказать клинической реакции человека пациентов. Человеческий орган на чипе (орган чип) microfluidic клеток культуры устройства, которые обеспечивают платформу экспериментальный в vitro оценить эффективность, токсичности и Фармакокинетические профили (PK) в организме человека, может быть лучше предикторы терапевтической эффективности и безопасность в клинике, по сравнению с исследования на животных. Эти устройства могут быть использованы для моделирования функцию практически любой орган типа и может быть fluidically связан через общие эндотелий выстроились микроканалов выполнять в vitro исследования по физиологии человека всего тела уровня и орган без необходимости проведение экспериментов на людях. Эти чипы органа состоят из двух каналов перфузии microfluidic, разделенных проницаемых эластомерных мембраны с органоспецифическая Паренхиматозный клетки на одной стороне и микрососудистой эндотелия с другой стороны, которая может циклически растягивается предоставлять органоспецифическая механические сигналы (например, дыхательные движения в легких). Этот протокол подробности изготовления гибких, двойной канал, орган чипов путем литья деталей с использованием 3D печатных форм, позволяет сочетание нескольких литья и постобработки шагов. Пористые поли (диметил силоксановых) мембраны (PDMS) отливаются с микрометра размера через отверстия с помощью кремния столба массивы под сжатие. Изготовление и монтаж чипов орган включает в себя оборудование и шаги, которые могут быть реализованы за пределами традиционной чистых помещений. Этот протокол обеспечивает исследователям доступ к технологии чипа орган в vitro исследования уровне органа и тела в лекарственных препаратах, безопасность и эффективность тестирования, а также механистический исследования основных биологических процессов.
Introduction
Здесь мы описываем изготовление двухканальной, васкуляризированной орган на чипе (орган чип) microfluidic культуры устройства с помощью поддаются масштабируемый протокол для использования исследовательских групп, не имеющих доступа к чистые помещения и средства традиционной мягкой литографии. Эти устройства были разработаны для пилки человеческих функций органа уровне для понимания нормальных и физиологии заболевания, а также наркотиков ответы в пробирке1,2. Решающее значение для инженерных эта функциональность являются два перфузии microfluidic каналы, разделенных полупроницаемой мембраны (рис. 1). Эта конструкция позволяет отдыха ткани ткани интерфейсов между по крайней мере двух видов тканей, обычно орган Паренхиматозный клетки на одной стороне пористые мембраны и эндотелия с другой, а также их подверженности потока жидкости. Кроме того потому что эластомерных полимера, поли (диметил силоксановых) (PDMS), используется для изготовления чипа орган тела и мембранных компонентов, циклические механические деформации могут быть применены к весь инженерии ткани ткани интерфейса через резинку Мембрана для имитации природных физических микроокружения живых органов, таких как дыхание движений в легких и перистальтику кишечника.
Рисунок 1: орган чип сечение. Орган чипы состоят из двух каналов, разделенных пористой, эластичная мембрана, которая может быть заполнена с клетки с обеих сторон. Верхний канал, сечений, 1 мм x 1 мм высокий, дно канала крест, разделы являются 1 мм в ширину x 0,2 мм высокий и вакуумных каналов в обоих и нижней части – 0,3 мм, 0,5 мм высоко и на расстоянии 0,3 мм от аэрогидродинамических каналов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Эти растягивается, двойной канал, орган чипы были использованы для демонстрации воздействия дыхательные движения на поглощение наночастиц в легких и лекарственно индуцированные отек легких3,4; эффекты перистальтические движения на дифференциации5 и бактериальных разрастание в кишечнике5,6,7; и влияние циклических деформаций благодаря пульсации сердца на дифференцировки и созревания клубочковых podocytes в почках8. Кроме того, эти устройства двух люмен, которые содержат выстроились эндотелия сосудов канала, разделенных внеклеточного матрикса (ECM)-покрытием мембраны из Паренхиматозный клеток внутри отдельно доступных каналов хорошо подходят для характеристики препарата PK параметры и новых открытий в целевой, который был ограничен в одном перфузии канал систем. Кроме того, несколько фишек орган могут быть связаны между собой через их сосудистой каналы для эффективного создания человеческого тела на чипов, которые может предложить привлекательные человека в vitro платформы для терапии развития9, 10. В отличие от наиболее микро физиологические системы (MPS)11,12,13орган фишки содержат два microfluidic каналы, разделенных пористые мембраны, которая облегчает сосудистой Паренхиматозный взаимодействия для пилки в естественных условиях функции органа. Это не только упрощает увязки различных органов вместе с perfusing общего среднего каналам сосудистой, но разделение тканей и жидкостей имитирует в естественных условиях функции и поддерживает фармакокинетические эксперименты и моделирование, а также в vitro–в vivo экстраполяции9,10 , что трудно или невозможно в один канал м/с14,,1516. Популярность PDMS в microfluidic приборы привела к разработке инструментов для преодоления присущие способность материала поглощать малых молекул10,17. Однако большое количество фишек, необходимых для поддержки биологических исследований, где использование микробиологических агентов и соединений поглощающих PDMS сделать повторное использование сложных обломоков орган требует масштабируемой производственный процесс даже для небольших исследовательских групп. Протокол, описанные здесь представляет метод для изготовления устройства, пригодные для использования в научных лабораториях, включая тех, кто не имеет доступа к чистых и мягкие литографии. Этот протокол направлен на расширение доступа к орган чипов широкого круга исследователей, стремящихся использовать растягивается, двухканальные устройства для изучения основных биологических процессов, а также поступательного развития терапевтических.
Используя лучшие практики от Микропроизводственные поля в сочетании с дизайн для производства, надежный подход был разработан для изготовления устройств орган чип в больших количествах с высокой воспроизводимостью и урожайность. Протокол изготовления, описанный здесь предоставляет масштабируемый метод для органа чип производства. Мы описывают использование факультативного плесень на месте Jig (MiP; дизайн детали в Дополнительных материалов) в сочетании с прокладками полиуретановой прокладкой для включения масштабирования литья PDMS компонентов. Глянцевая сторона Полиуретановые прокладки производить оптически гладкой PDMS частей в то время как текстурированные Сторона облегчает распалубка. Мы также описывают использование из Факультативного автоматизированной мембраны Fabricator (АВФ), обеспечивает равномерное сжатие во время отверждения мембраны вафельных форм для изготовления до 24 мембраны в пакете. Дизайн широко применяется для исследования органов, которые состоят из тканей, которые испытывают механические деформации и перфузии, и эти чипы могут быть изготовлены с низкой чип на чипе изменчивости в количествах, необходимых для удовлетворения потребностей малых и больших исследовательские группы так. Рабочий процесс поддается формат пакета или сборочной линии и легко совместим с протоколами оценки качества для контроля производственных процессов, обучение персонала и отзывчивым устранение неполадок. Мы надеемся, что этот протокол будет расширяться доступ к возможностям двойной канал, растягивается, орган чипы для базовых и трансляционная исследований.
Protocol
Representative Results
Discussion
Процесс изготовления опирается на высокое разрешение 3D печатной формы в шаблон PDMS верхней и нижней орган чип компонентов тела в сочетании с micromolded пористых PDMS мембраны. Этот критический подход был выбран из-за простоты прототипов, в сочетании с быстрым переходом в масштабируется до изг…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим м. Руссо и S. Kroll за помощь с фотография и видеосъемка и M. Ingram, J. Нгуен, D. Ши и N. Wen за вклад в развитие первоначальной изготовление протокол. Это исследование было организовано Wyss институт биологически вдохновил инженерии в Гарвардском университете и обороны перспективных исследований проекты агентства в рамках совместных соглашений #W911NF-12-2-0036 и #W911NF-16-C-0050, и FDA Грант # HHSF223201310079C, низ предоставляет #R01-EB020004 и UG3-HL141797-01, а Фонд Билла и Мелинды Гейтс #OPP1163237 и #OPP1173198 дей. Мнения и выводы, содержащиеся в данном документе, принадлежат авторам и не следует толковать как отражающие официальную политику, либо явно выраженных или подразумеваемых, обороны перспективных исследований проекты агентства, продовольствия и медикаментов, Национальные институты здравоохранения, или правительства США.
Materials
| Personal Protective Equipment | |||
| Hairnet | VWR | 89107-770 | |
| Tyvek lab coat | VWR | 13450-506 | |
| Extended cuff gloves | VWR | 89521-898 | |
| Equipment | |||
| Cutting mat | VWR | 102096-430 | |
| Tile cutter | McMaster-Carr | 26765A31 | |
| Mold-in-place (MIP) top molds | Protolabs, Inc. | custom | printed in Prototherm 12120 |
| Mold-in-place (MIP) bottom molds | Protolabs, Inc. | custom | printed in Prototherm 12121 |
| Duckbill curved forceps | VWR | 63041-864 | |
| Sharp tipped forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | |
| Metal spatula | VWR | 82027-528 | |
| Deep reactive ion etch (DRIE) pillar array wafers | Sensera, Inc. | custom | Four 50 x 50 mm pillar arrays per wafer; pillars 7 um wide, 50 um tall, spaced hexagonally 40 um apart |
| Textured polycarbonate .01” thick | McMaster-Carr | 85585K33 | cut to 45 mm square |
| PDMS blocks (40 x 40 x 5 mm) | n/a | custom | |
| Laminar flow hood | Germfree | BVBI | cast in-house |
| Air gun | |||
| 60°C level oven | |||
| Vacuum desiccator | |||
| Mass balance | accuracy to 0.1 g | ||
| Plasma machine | Diener | Nano | oxygen plasma capability is critical |
| Supplies | |||
| Sylgard 184 poly (dimethylsiloxane) (PDMS) base/curing agent kit | Ellsworth Adhesives | 4019862 | |
| Mixing cup | Ensure adequate ventilation when handling prepolymer due to low levels of ethylbenzene | ||
| 1 mL syringe | VWR | 10099-395 | |
| Cleanroom wipes | VWR | TWTX1080 | |
| 25 x 75 mm glass microscope slides | VWR | 48311-703 | |
| Packing tape | VWR | 500043-724 | |
| Scotch tape | VWR | 500026-873 | |
| Die-cut Polyurethane (PU) strips | Atlantic Gasket, Inc. | custom: AGWI2X3 | 1/8” thick; 60 Durometer Black Polyurethane; 2” x 3” |
| Polycarbonate film .005” thick | McMaster-Carr | 85585K102 | |
| 100 x 100 x 15 mm square gridded petri dishes | VWR | 60872-480 | |
| Aluminum foil | |||
| Optional Equipment | |||
| Thinky PDMS Mixer | Thinky | ARE-310 | |
| Mold-in place (MIP) jig | in-house | screw clamp compression jig | |
| Automated membrane fabricator (AMF) | in-house | pneumatic compression piston array with programmable heater |
References
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Benam, K. H., et al. Engineered In vitro Disease Models. Annual Review of Pathology Mechanisms of Disease. 10 (1), 195-262 (2015).
- Huh, D., et al. A Human Disease Model of Drug Toxicity-Induced Pulmonary Edema in a Lung-on-a-Chip Microdevice. Science Translational Medicine. 4 (159), 159ra147 (2012).
- Huh, D., et al. Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab on a Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).
- Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-Chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integrative Biology. 5 (9), 1130-1140 (2013).
- Kim, H. J., Li, H., Collins, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), E7-E15 (2016).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1 (5), s41551-017-0069–017 (2017).
- Somayaji, M. R., Das, D., Przekwas, A. Computational approaches for modeling and analysis of human-on-chip systems for drug testing and characterization. Drug Discovery Today. 21 (12), 1859-1862 (2016).
- Prantil-Baun, R., et al. Physiologically Based Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis Enabled by Microfluidically Linked Organs-on-Chips. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 58 (1), 37-64 (2018).
- Mahler, G. J., Esch, M. B., Stokol, T., Hickman, J. J., Shuler, M. L. Body-on-a-chip systems for animal-free toxicity testing. Alternatives to laboratory animals: ATLA. 44 (5), 469-478 (2016).
- Miller, P. G., Shuler, M. L. Design and demonstration of a pumpless 14 compartment microphysiological system. Biotechnology and Bioengineering. 113 (10), 2213-2227 (2016).
- Coppeta, J. R., et al. A portable and reconfigurable multi-organ platform for drug development with onboard microfluidic flow control. Lab Chip. 17 (1), 134-144 (2016).
- Wikswo, J. P., et al. Scaling and systems biology for integrating multiple organs-on-a-chip. Lab on a Chip. 13 (18), 3496-3511 (2013).
- Sung, J. H., et al. Using PBPK guided "Body-on-a-Chip" Systems to Predict Mammalian Response to Drug and Chemical Exposure. Experimental biology and medicine (Maywood, N.J.). 239 (9), 1225-1239 (2014).
- Stokes, C., Cirit, M., Lauffenburger, D. Physiome-on-a-Chip: The Challenge of "Scaling" in Design, Operation, and Translation of Microphysiological Systems. CPT: Pharmacometrics & Systems Pharmacology. 4 (10), 559-562 (2015).
- Shirure, V. S., George, S. C. Design considerations to minimize the impact of drug absorption in polymer-based organ-on-a-chip platforms. Lab Chip. , (2017).
- Huh, D., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nature Protocols. 8 (11), 2135-2157 (2013).
- Tran, T. T., et al. Exact kinetic analysis of passive transport across a polarized confluent MDCK cell monolayer modeled as a single barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 93 (8), 2108-2123 (2004).
- Henry, O. Y. F., et al. Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function. Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).
- Maoz, B. M., et al. Organs-on-Chips with combined multi-electrode array and transepithelial electrical resistance measurement capabilities. Lab on a Chip. 17 (13), 2294-2302 (2017).
- Benam, K. H., et al. Matched-Comparative Modeling of Normal and Diseased Human Airway Responses Using a Microengineered Breathing Lung Chip. Cell Systems. 3 (5), 456-466 (2016).
