Summary

Масштабируемые изготовление растягивается, двойной канал, орган Microfluidic фишки

Published: October 20, 2018
doi:

Summary

Здесь мы представляем протокол, который описывает изготовление растягивается, двойной канал, орган чип microfluidic клетки культуры устройства для изложив орган уровень функциональности в пробирке.

Abstract

Значительное количество соединений свинца не в конвейере фармацевтической, потому что исследования на животных, часто не предсказать клинической реакции человека пациентов. Человеческий орган на чипе (орган чип) microfluidic клеток культуры устройства, которые обеспечивают платформу экспериментальный в vitro оценить эффективность, токсичности и Фармакокинетические профили (PK) в организме человека, может быть лучше предикторы терапевтической эффективности и безопасность в клинике, по сравнению с исследования на животных. Эти устройства могут быть использованы для моделирования функцию практически любой орган типа и может быть fluidically связан через общие эндотелий выстроились микроканалов выполнять в vitro исследования по физиологии человека всего тела уровня и орган без необходимости проведение экспериментов на людях. Эти чипы органа состоят из двух каналов перфузии microfluidic, разделенных проницаемых эластомерных мембраны с органоспецифическая Паренхиматозный клетки на одной стороне и микрососудистой эндотелия с другой стороны, которая может циклически растягивается предоставлять органоспецифическая механические сигналы (например, дыхательные движения в легких). Этот протокол подробности изготовления гибких, двойной канал, орган чипов путем литья деталей с использованием 3D печатных форм, позволяет сочетание нескольких литья и постобработки шагов. Пористые поли (диметил силоксановых) мембраны (PDMS) отливаются с микрометра размера через отверстия с помощью кремния столба массивы под сжатие. Изготовление и монтаж чипов орган включает в себя оборудование и шаги, которые могут быть реализованы за пределами традиционной чистых помещений. Этот протокол обеспечивает исследователям доступ к технологии чипа орган в vitro исследования уровне органа и тела в лекарственных препаратах, безопасность и эффективность тестирования, а также механистический исследования основных биологических процессов.

Introduction

Здесь мы описываем изготовление двухканальной, васкуляризированной орган на чипе (орган чип) microfluidic культуры устройства с помощью поддаются масштабируемый протокол для использования исследовательских групп, не имеющих доступа к чистые помещения и средства традиционной мягкой литографии. Эти устройства были разработаны для пилки человеческих функций органа уровне для понимания нормальных и физиологии заболевания, а также наркотиков ответы в пробирке1,2. Решающее значение для инженерных эта функциональность являются два перфузии microfluidic каналы, разделенных полупроницаемой мембраны (рис. 1). Эта конструкция позволяет отдыха ткани ткани интерфейсов между по крайней мере двух видов тканей, обычно орган Паренхиматозный клетки на одной стороне пористые мембраны и эндотелия с другой, а также их подверженности потока жидкости. Кроме того потому что эластомерных полимера, поли (диметил силоксановых) (PDMS), используется для изготовления чипа орган тела и мембранных компонентов, циклические механические деформации могут быть применены к весь инженерии ткани ткани интерфейса через резинку Мембрана для имитации природных физических микроокружения живых органов, таких как дыхание движений в легких и перистальтику кишечника.

Figure 1
Рисунок 1: орган чип сечение. Орган чипы состоят из двух каналов, разделенных пористой, эластичная мембрана, которая может быть заполнена с клетки с обеих сторон. Верхний канал, сечений, 1 мм x 1 мм высокий, дно канала крест, разделы являются 1 мм в ширину x 0,2 мм высокий и вакуумных каналов в обоих и нижней части – 0,3 мм, 0,5 мм высоко и на расстоянии 0,3 мм от аэрогидродинамических каналов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Эти растягивается, двойной канал, орган чипы были использованы для демонстрации воздействия дыхательные движения на поглощение наночастиц в легких и лекарственно индуцированные отек легких3,4; эффекты перистальтические движения на дифференциации5 и бактериальных разрастание в кишечнике5,6,7; и влияние циклических деформаций благодаря пульсации сердца на дифференцировки и созревания клубочковых podocytes в почках8. Кроме того, эти устройства двух люмен, которые содержат выстроились эндотелия сосудов канала, разделенных внеклеточного матрикса (ECM)-покрытием мембраны из Паренхиматозный клеток внутри отдельно доступных каналов хорошо подходят для характеристики препарата PK параметры и новых открытий в целевой, который был ограничен в одном перфузии канал систем. Кроме того, несколько фишек орган могут быть связаны между собой через их сосудистой каналы для эффективного создания человеческого тела на чипов, которые может предложить привлекательные человека в vitro платформы для терапии развития9, 10. В отличие от наиболее микро физиологические системы (MPS)11,12,13орган фишки содержат два microfluidic каналы, разделенных пористые мембраны, которая облегчает сосудистой Паренхиматозный взаимодействия для пилки в естественных условиях функции органа. Это не только упрощает увязки различных органов вместе с perfusing общего среднего каналам сосудистой, но разделение тканей и жидкостей имитирует в естественных условиях функции и поддерживает фармакокинетические эксперименты и моделирование, а также в vitroв vivo экстраполяции9,10 , что трудно или невозможно в один канал м/с14,,1516. Популярность PDMS в microfluidic приборы привела к разработке инструментов для преодоления присущие способность материала поглощать малых молекул10,17. Однако большое количество фишек, необходимых для поддержки биологических исследований, где использование микробиологических агентов и соединений поглощающих PDMS сделать повторное использование сложных обломоков орган требует масштабируемой производственный процесс даже для небольших исследовательских групп. Протокол, описанные здесь представляет метод для изготовления устройства, пригодные для использования в научных лабораториях, включая тех, кто не имеет доступа к чистых и мягкие литографии. Этот протокол направлен на расширение доступа к орган чипов широкого круга исследователей, стремящихся использовать растягивается, двухканальные устройства для изучения основных биологических процессов, а также поступательного развития терапевтических.

Используя лучшие практики от Микропроизводственные поля в сочетании с дизайн для производства, надежный подход был разработан для изготовления устройств орган чип в больших количествах с высокой воспроизводимостью и урожайность. Протокол изготовления, описанный здесь предоставляет масштабируемый метод для органа чип производства. Мы описывают использование факультативного плесень на месте Jig (MiP; дизайн детали в Дополнительных материалов) в сочетании с прокладками полиуретановой прокладкой для включения масштабирования литья PDMS компонентов. Глянцевая сторона Полиуретановые прокладки производить оптически гладкой PDMS частей в то время как текстурированные Сторона облегчает распалубка. Мы также описывают использование из Факультативного автоматизированной мембраны Fabricator (АВФ), обеспечивает равномерное сжатие во время отверждения мембраны вафельных форм для изготовления до 24 мембраны в пакете. Дизайн широко применяется для исследования органов, которые состоят из тканей, которые испытывают механические деформации и перфузии, и эти чипы могут быть изготовлены с низкой чип на чипе изменчивости в количествах, необходимых для удовлетворения потребностей малых и больших исследовательские группы так. Рабочий процесс поддается формат пакета или сборочной линии и легко совместим с протоколами оценки качества для контроля производственных процессов, обучение персонала и отзывчивым устранение неполадок. Мы надеемся, что этот протокол будет расширяться доступ к возможностям двойной канал, растягивается, орган чипы для базовых и трансляционная исследований.

Protocol

1. Общая подготовка Чтобы избежать мусора, очистки рабочей области с помощью упаковочной ленты и уничтожить вниз с чистых протрите и изопропиловый спирт. Для всех шагов, требующих PDMS смесь PDMS в соотношении 10:1 (10 g перекрестных ссылок агент, 100 г эластомера базовый). Смешайте вру?…

Representative Results

Протокол, представленные здесь описывает масштабируемых изготовление PDMS орган чипов. Эти устройства позволяют культуры двух видов различных перфузии тканей на эластичные пористые мембраны (рис. 1). PDMS каналы отлиты использованием 3D печатной формы, кот…

Discussion

Процесс изготовления опирается на высокое разрешение 3D печатной формы в шаблон PDMS верхней и нижней орган чип компонентов тела в сочетании с micromolded пористых PDMS мембраны. Этот критический подход был выбран из-за простоты прототипов, в сочетании с быстрым переходом в масштабируется до изг…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим м. Руссо и S. Kroll за помощь с фотография и видеосъемка и M. Ingram, J. Нгуен, D. Ши и N. Wen за вклад в развитие первоначальной изготовление протокол. Это исследование было организовано Wyss институт биологически вдохновил инженерии в Гарвардском университете и обороны перспективных исследований проекты агентства в рамках совместных соглашений #W911NF-12-2-0036 и #W911NF-16-C-0050, и FDA Грант # HHSF223201310079C, низ предоставляет #R01-EB020004 и UG3-HL141797-01, а Фонд Билла и Мелинды Гейтс #OPP1163237 и #OPP1173198 дей. Мнения и выводы, содержащиеся в данном документе, принадлежат авторам и не следует толковать как отражающие официальную политику, либо явно выраженных или подразумеваемых, обороны перспективных исследований проекты агентства, продовольствия и медикаментов, Национальные институты здравоохранения, или правительства США.

Materials

Personal Protective Equipment
Hairnet VWR 89107-770
Tyvek lab coat VWR 13450-506
Extended cuff gloves VWR 89521-898
Equipment
Cutting mat VWR 102096-430
Tile cutter McMaster-Carr 26765A31
Mold-in-place (MIP) top molds Protolabs, Inc. custom printed in Prototherm 12120
Mold-in-place (MIP) bottom molds Protolabs, Inc. custom printed in Prototherm 12121
Duckbill curved forceps VWR 63041-864
Sharp tipped forceps Electron Microscopy Sciences 72700-D
Metal spatula VWR  82027-528
Deep reactive ion etch (DRIE)  pillar array wafers Sensera, Inc. custom Four 50 x 50 mm pillar arrays per wafer; pillars 7 um wide, 50 um tall, spaced hexagonally 40 um apart
Textured polycarbonate .01” thick McMaster-Carr 85585K33 cut to 45 mm square
PDMS blocks (40 x 40 x 5 mm) n/a custom
Laminar flow hood Germfree BVBI cast in-house
Air gun
60°C level oven
Vacuum desiccator
Mass balance accuracy to 0.1 g
Plasma machine Diener Nano oxygen plasma capability is critical
Supplies
Sylgard 184 poly (dimethylsiloxane) (PDMS) base/curing agent kit Ellsworth Adhesives  4019862
Mixing cup Ensure adequate ventilation when handling prepolymer due to low levels of ethylbenzene
1 mL syringe VWR 10099-395
Cleanroom wipes VWR TWTX1080
25 x 75 mm glass microscope slides VWR 48311-703
Packing tape VWR 500043-724
Scotch tape VWR 500026-873
Die-cut Polyurethane (PU) strips Atlantic Gasket, Inc. custom: AGWI2X3  1/8” thick; 60 Durometer Black Polyurethane; 2” x 3”
Polycarbonate film .005” thick McMaster-Carr 85585K102
100 x 100 x 15 mm square gridded petri dishes VWR 60872-480
 Aluminum foil
Optional Equipment
Thinky PDMS Mixer Thinky ARE-310
Mold-in place (MIP) jig in-house screw clamp compression jig
Automated membrane fabricator (AMF) in-house pneumatic compression piston array with programmable heater

References

  1. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
  2. Benam, K. H., et al. Engineered In vitro Disease Models. Annual Review of Pathology Mechanisms of Disease. 10 (1), 195-262 (2015).
  3. Huh, D., et al. A Human Disease Model of Drug Toxicity-Induced Pulmonary Edema in a Lung-on-a-Chip Microdevice. Science Translational Medicine. 4 (159), 159ra147 (2012).
  4. Huh, D., et al. Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  5. Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab on a Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).
  6. Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-Chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integrative Biology. 5 (9), 1130-1140 (2013).
  7. Kim, H. J., Li, H., Collins, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), E7-E15 (2016).
  8. Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1 (5), s41551-017-0069–017 (2017).
  9. Somayaji, M. R., Das, D., Przekwas, A. Computational approaches for modeling and analysis of human-on-chip systems for drug testing and characterization. Drug Discovery Today. 21 (12), 1859-1862 (2016).
  10. Prantil-Baun, R., et al. Physiologically Based Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis Enabled by Microfluidically Linked Organs-on-Chips. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 58 (1), 37-64 (2018).
  11. Mahler, G. J., Esch, M. B., Stokol, T., Hickman, J. J., Shuler, M. L. Body-on-a-chip systems for animal-free toxicity testing. Alternatives to laboratory animals: ATLA. 44 (5), 469-478 (2016).
  12. Miller, P. G., Shuler, M. L. Design and demonstration of a pumpless 14 compartment microphysiological system. Biotechnology and Bioengineering. 113 (10), 2213-2227 (2016).
  13. Coppeta, J. R., et al. A portable and reconfigurable multi-organ platform for drug development with onboard microfluidic flow control. Lab Chip. 17 (1), 134-144 (2016).
  14. Wikswo, J. P., et al. Scaling and systems biology for integrating multiple organs-on-a-chip. Lab on a Chip. 13 (18), 3496-3511 (2013).
  15. Sung, J. H., et al. Using PBPK guided "Body-on-a-Chip" Systems to Predict Mammalian Response to Drug and Chemical Exposure. Experimental biology and medicine (Maywood, N.J.). 239 (9), 1225-1239 (2014).
  16. Stokes, C., Cirit, M., Lauffenburger, D. Physiome-on-a-Chip: The Challenge of "Scaling&#34 in Design, Operation, and Translation of Microphysiological Systems. CPT: Pharmacometrics & Systems Pharmacology. 4 (10), 559-562 (2015).
  17. Shirure, V. S., George, S. C. Design considerations to minimize the impact of drug absorption in polymer-based organ-on-a-chip platforms. Lab Chip. , (2017).
  18. Huh, D., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nature Protocols. 8 (11), 2135-2157 (2013).
  19. Tran, T. T., et al. Exact kinetic analysis of passive transport across a polarized confluent MDCK cell monolayer modeled as a single barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 93 (8), 2108-2123 (2004).
  20. Henry, O. Y. F., et al. Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function. Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).
  21. Maoz, B. M., et al. Organs-on-Chips with combined multi-electrode array and transepithelial electrical resistance measurement capabilities. Lab on a Chip. 17 (13), 2294-2302 (2017).
  22. Benam, K. H., et al. Matched-Comparative Modeling of Normal and Diseased Human Airway Responses Using a Microengineered Breathing Lung Chip. Cell Systems. 3 (5), 456-466 (2016).

Play Video

Cite This Article
Novak, R., Didier, M., Calamari, E., Ng, C. F., Choe, Y., Clauson, S. L., Nestor, B. A., Puerta, J., Fleming, R., Firoozinezhad, S. J., Ingber, D. E. Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips. J. Vis. Exp. (140), e58151, doi:10.3791/58151 (2018).

View Video