Skalerbar fabrikation af elastisk, Dual Channel, mikrofluid orgel Chips
Summary
Vi præsenterer her, en protokol, der beskriver fabrikation af elastisk, dual channel, orgel chip mikrofluid celle kultur enheder for recapitulating orgel-niveau funktionalitet in vitro.
Abstract
Et betydeligt antal af blyforbindelser mislykkes i den farmaceutiske pipeline, fordi dyreforsøg undlader ofte at forudsige klinisk respons i menneskelige patienter. Menneskelige orgel-on-a-Chip (orgel Chip) mikrofluid celle kultur enheder, som giver en eksperimentel in vitro- platform for at vurdere effekten, toksicitet og farmakokinetiske (PK) profiler hos mennesker, kan være bedre prædiktorer for terapeutiske virkning og sikkerhed i klinikken i forhold til dyreforsøg. Disse enheder kan bruges til at modellere funktion af stort set enhver type, orgel og fluidically kan forbindes via fælles endotel-foret microchannels til at udføre in vitro- undersøgelser på menneskelige orgel- og hele kroppen-niveau fysiologi uden at skulle udføre eksperimenter på mennesker. Disse orgel Chips består af to perfunderet mikrofluid kanaler adskilt af en gennemtrængelig elastomere membran med orgel-specifikke parenkymalt celler på den ene side og mikrovaskulære endotelet på den anden side, som kan strækkes cyklisk at give orgel-specifikke mekaniske stikord (fx vejrtrækning bevægelser i lunge). Denne protokol detaljer fabrikation af fleksible, dual channel, orgel Chips gennem støbning af dele ved hjælp af 3D trykte forme, muliggør kombination af flere støbning og efterbehandling skridt. Porøse poly (dimethyl siloxan) (PDMS) membraner er støbt med mikrometer størrelse gennem huller ved hjælp af silicium søjle arrays under komprimering. Fabrikation og montering af orgel Chips omfatter udstyr og trin, der kan gennemføres uden for en traditionel renrum. Denne protokol giver forskere med adgang til orgel Chip teknologi til in vitro- orgel – og krop-niveau undersøgelser i drug discovery, sikkerhed og effektivitetsforsøgene samt Mekanistiske undersøgelser af grundlæggende biologiske processer.
Introduction
Her beskriver vi fabrikation af dual channel, vaskulariserede orgel-on-a-Chip (orgel Chip) mikrofluid kultur enheder ved hjælp af en skalerbar protokol modtagelig for brug af forskningsgrupper mangler adgang til renrum og traditionelle blødt litografi værktøjer. Disse enheder er udviklet til at sammenfatte menneskelige orgel-niveau funktioner for forståelse normal samt sygdom fysiologi og medicin svar in vitro-1,2. Kritisk til ingeniør denne funktionalitet er to perfunderet mikrofluid kanaler adskilt af en semipermeabel membran (figur 1). Dette design giver mulighed for genskabelse af væv-væv grænseflader mellem mindst to typer af væv, typisk orgel parenkymalt celler på den ene side af den porøse membran og vaskulære endotel på den anden, samt deres eksponering for flydende flow. Hertil kommer, fordi elastomere polymeren, poly (dimethyl siloxan) (PDMS), der bruges til at fabrikere orgel Chip kroppen og membran komponenter, cyklisk mekanisk belastning kan anvendes på hele manipuleret væv-væv interface via elastiske membran til at efterligne den naturlige fysiske mikromiljø af levende organer, såsom vejrtrækning bevægelser i lungen og peristaltikken i tarmen.
Figur 1: orgel Chip tværsnit. Orgel Chips består af to kanaler adskilt af en porøs, elastisk membran, der kan være seedet med celler på begge sider. Top channel tværsnit er 1 mm bred x 1 mm høj, nederste kanal tværs sektioner er 1 mm bred x 0,2 mm høj og vakuum kanaler i både og nederste dele er 0,3 mm bred, 0,5 mm høj, og fordelte 0.3 mm fra fluidic kanaler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Disse elastisk, dual channel, orgel Chips har været brugt til demonstrerer virkningen af vejrtrækning motion på nanopartikel absorption i lunge og narkotika-induceret lungeødem3,4; virkningerne af peristaltiske bevægelser på differentiering5 og bakteriel overvækst i tarmen5,6,7; og indflydelse af cykliske deformationer på grund af pulsering i hjertet på differentiering og modning af glomerulær podocytes i nyre8. Desuden, disse to-lumen-enheder, der indeholder en endotel-foret vaskulære kanal adskilt af en ekstracellulære matrix (ECM)-coated membran fra parenkymalt celler i en separat tilgængelige kanal er velegnet til karakterisering af lægemiddel PK parametre og nye mål discovery, som har været begrænset i enkelt perfusion kanal systemer. Desuden flere orgel Chips kan kobles sammen via deres vaskulære kanaler til effektivt skabe en menneskelig krop-på-chips, som kunne tilbyde en attraktiv menneskelige in vitro- platform for therapeutics udvikling9, 10. I modsætning til de fleste mikro-fysiologiske systemer (MPS)11,12,13indeholder orgel Chips to mikrofluid kanaler adskilt af en porøse membran, der letter kar-parenkymalt interaktioner til sammenfatte i vivo organfunktion. Dette ikke kun forenkler sammenkobling af forskellige organer sammen af perfusing en fælles medium gennem de vaskulære kanaler, men opdelingen i væv og væsker efterligner i vivo funktioner og understøtter farmakokinetiske forsøg og modellering og i in vitro–i vivo ekstrapolering9,10 , der er vanskeligt eller umuligt i én kanal MPS14,15,16. Populariteten af PDMS i mikrofluid enheder har ført til udvikling af redskaber til at overvinde materialets iboende evne til at absorbere små molekyler10,17. Men det store antal chips skal støtte biologiske undersøgelser hvor brugen af mikrobielle agenser og PDMS-absorberende forbindelser gøre genbrug af orgel Chips vanskeligt nødvendiggør en skalerbar fremstillingsprocessen selv for små forskergrupper. Protokollen beskrevet her præsenterer en metode for enheden fabrikation egnet til brug i akademiske laboratorier, herunder dem, der mangler adgang til renrum og bløde litografi. Denne protokol har til formål at udvide adgangen til orgel Chips af en lang række forskere søger at bruge de elastisk, dual-channel enheder for at udforske grundlæggende biologiske processer samt translationel terapeutisk udvikling.
Bedste løftestangsvirkningen fra micromanufacturing felter kombineret med design for manufacturing, blev en robust tilgang udviklet for at fabrikere orgel Chip enheder i store mængder med høj reproducerbarhed og udbytte. Fabrikation protokollen beskrevet her giver en skalerbar metode for orgel Chip produktion. Vi beskriver brugen af en valgfri skimmel-in-Place Jig (MiP; designdetaljer i Supplerende materialer) kombineret med polyurethan pakning strips til at aktivere optrapning af casting PDMS komponenter. Den blanke side af polyurethan strimler producere optisk glat PDMS dele, mens den ru side letter demolding. Vi beskriver også brug af en valgfri automatiserede membran fabrikator (AMF) der giver ensartet komprimering af membran wafer skimmelsvampe under hærdning for opdigte op til 24 membraner pr. parti. Designet er generelt gældende for undersøgelser af organer, der er sammensat af væv, der oplever mekanisk belastning og perfusion, og disse chips kan produceres med lave chip til chip variabilitet i mængder, der kræves til at opfylde behovene i små og store forskningsgrupper ens. Arbejdsprocessen er indstillet til en batch eller samlebånd format, og vanskeligt kan forenes med kvalitet vurdering protokoller til styring af produktionsprocesser, personaleuddannelse og lydhør fejlfinding. Vi håber, at denne protokol vil udvide adgangen til mulighederne i dual channel, elastisk, orgel Chips for grundlæggende og Translationel forskning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fabrikationsproces bygger på høj opløsning 3D trykte forme til mønster PDMS top og bund orgel Chip organ komponenter kombineret med micromolded porøse PDMS membraner. Denne kritiske tilgang blev valgt skulle lette prototyping kombineret med hurtig overgang til skaleret op fabrikation og udskiftning af værktøj. Top komponent forme er designet til mønster havne i præcise steder med definerede lodrette profiler under trinnet støbning. Dette ikke kun undgår arbejdskraft involveret i manuelt stansning adgang til ha…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker M. Rousseau og S. Kroll hjælp til fotografering og Videografi og M. Ingram, J. Nguyen, D. Shea og N. Wen for bidrag til indledende fabrikation protokol udvikling. Denne forskning blev sponsoreret af Wyss Institut for biologisk inspirerede Engineering ved Harvard University og Defense Advanced Research Projects Agency under Cooperative aftaler #W911NF-12-2-0036 og #W911NF-16-C-0050, og FDA yde # HHSF223201310079C, NIH tilskud #R01-EB020004 og #UG3-HL141797-01, og Bill og Melinda Gates Foundation giver #OPP1163237 og #OPP1173198 DEI. De synspunkter og konklusioner er indeholdt i dette dokument er dem af forfatterne og bør ikke fortolkes som repræsenterer den officielle politik, hverken udtrykt eller underforstået, af Defense Advanced Research Projects Agency, Food and Drug Administration, den Nationale kontorer i sundhed, eller den amerikanske regering.
Materials
| Personal Protective Equipment | |||
| Hairnet | VWR | 89107-770 | |
| Tyvek lab coat | VWR | 13450-506 | |
| Extended cuff gloves | VWR | 89521-898 | |
| Equipment | |||
| Cutting mat | VWR | 102096-430 | |
| Tile cutter | McMaster-Carr | 26765A31 | |
| Mold-in-place (MIP) top molds | Protolabs, Inc. | custom | printed in Prototherm 12120 |
| Mold-in-place (MIP) bottom molds | Protolabs, Inc. | custom | printed in Prototherm 12121 |
| Duckbill curved forceps | VWR | 63041-864 | |
| Sharp tipped forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | |
| Metal spatula | VWR | 82027-528 | |
| Deep reactive ion etch (DRIE) pillar array wafers | Sensera, Inc. | custom | Four 50 x 50 mm pillar arrays per wafer; pillars 7 um wide, 50 um tall, spaced hexagonally 40 um apart |
| Textured polycarbonate .01” thick | McMaster-Carr | 85585K33 | cut to 45 mm square |
| PDMS blocks (40 x 40 x 5 mm) | n/a | custom | |
| Laminar flow hood | Germfree | BVBI | cast in-house |
| Air gun | |||
| 60°C level oven | |||
| Vacuum desiccator | |||
| Mass balance | accuracy to 0.1 g | ||
| Plasma machine | Diener | Nano | oxygen plasma capability is critical |
| Supplies | |||
| Sylgard 184 poly (dimethylsiloxane) (PDMS) base/curing agent kit | Ellsworth Adhesives | 4019862 | |
| Mixing cup | Ensure adequate ventilation when handling prepolymer due to low levels of ethylbenzene | ||
| 1 mL syringe | VWR | 10099-395 | |
| Cleanroom wipes | VWR | TWTX1080 | |
| 25 x 75 mm glass microscope slides | VWR | 48311-703 | |
| Packing tape | VWR | 500043-724 | |
| Scotch tape | VWR | 500026-873 | |
| Die-cut Polyurethane (PU) strips | Atlantic Gasket, Inc. | custom: AGWI2X3 | 1/8” thick; 60 Durometer Black Polyurethane; 2” x 3” |
| Polycarbonate film .005” thick | McMaster-Carr | 85585K102 | |
| 100 x 100 x 15 mm square gridded petri dishes | VWR | 60872-480 | |
| Aluminum foil | |||
| Optional Equipment | |||
| Thinky PDMS Mixer | Thinky | ARE-310 | |
| Mold-in place (MIP) jig | in-house | screw clamp compression jig | |
| Automated membrane fabricator (AMF) | in-house | pneumatic compression piston array with programmable heater |
References
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Benam, K. H., et al. Engineered In vitro Disease Models. Annual Review of Pathology Mechanisms of Disease. 10 (1), 195-262 (2015).
- Huh, D., et al. A Human Disease Model of Drug Toxicity-Induced Pulmonary Edema in a Lung-on-a-Chip Microdevice. Science Translational Medicine. 4 (159), 159ra147 (2012).
- Huh, D., et al. Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab on a Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).
- Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-Chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integrative Biology. 5 (9), 1130-1140 (2013).
- Kim, H. J., Li, H., Collins, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), E7-E15 (2016).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1 (5), s41551-017-0069–017 (2017).
- Somayaji, M. R., Das, D., Przekwas, A. Computational approaches for modeling and analysis of human-on-chip systems for drug testing and characterization. Drug Discovery Today. 21 (12), 1859-1862 (2016).
- Prantil-Baun, R., et al. Physiologically Based Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis Enabled by Microfluidically Linked Organs-on-Chips. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 58 (1), 37-64 (2018).
- Mahler, G. J., Esch, M. B., Stokol, T., Hickman, J. J., Shuler, M. L. Body-on-a-chip systems for animal-free toxicity testing. Alternatives to laboratory animals: ATLA. 44 (5), 469-478 (2016).
- Miller, P. G., Shuler, M. L. Design and demonstration of a pumpless 14 compartment microphysiological system. Biotechnology and Bioengineering. 113 (10), 2213-2227 (2016).
- Coppeta, J. R., et al. A portable and reconfigurable multi-organ platform for drug development with onboard microfluidic flow control. Lab Chip. 17 (1), 134-144 (2016).
- Wikswo, J. P., et al. Scaling and systems biology for integrating multiple organs-on-a-chip. Lab on a Chip. 13 (18), 3496-3511 (2013).
- Sung, J. H., et al. Using PBPK guided "Body-on-a-Chip" Systems to Predict Mammalian Response to Drug and Chemical Exposure. Experimental biology and medicine (Maywood, N.J.). 239 (9), 1225-1239 (2014).
- Stokes, C., Cirit, M., Lauffenburger, D. Physiome-on-a-Chip: The Challenge of "Scaling" in Design, Operation, and Translation of Microphysiological Systems. CPT: Pharmacometrics & Systems Pharmacology. 4 (10), 559-562 (2015).
- Shirure, V. S., George, S. C. Design considerations to minimize the impact of drug absorption in polymer-based organ-on-a-chip platforms. Lab Chip. , (2017).
- Huh, D., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nature Protocols. 8 (11), 2135-2157 (2013).
- Tran, T. T., et al. Exact kinetic analysis of passive transport across a polarized confluent MDCK cell monolayer modeled as a single barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 93 (8), 2108-2123 (2004).
- Henry, O. Y. F., et al. Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function. Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).
- Maoz, B. M., et al. Organs-on-Chips with combined multi-electrode array and transepithelial electrical resistance measurement capabilities. Lab on a Chip. 17 (13), 2294-2302 (2017).
- Benam, K. H., et al. Matched-Comparative Modeling of Normal and Diseased Human Airway Responses Using a Microengineered Breathing Lung Chip. Cell Systems. 3 (5), 456-466 (2016).
