Fabrication évolutive d’étirable, Dual Channel, puces microfluidiques orgue
Summary
Nous présentons ici un protocole qui décrit la fabrication de canal extensible, double, orgue puce cell culture microfluidiques pour récapitulant les organes au niveau fonctionnalité in vitro.
Abstract
Un nombre important de composés de plomb échoue dans le pipeline pharmaceutique parce que les études chez l’animal omettent souvent de prévoir les réactions cliniques chez des patients humains. Humaine orgue-on-a-Chip (puce de l’orgue) cell culture Dispositifs microfluidiques, qui fournissent une plate-forme expérimentale in vitro pour évaluer l’efficacité, la toxicité et profils pharmacocinétiques de (PK) chez les humains, peut-être meilleurs prédicteurs de l’efficacité thérapeutique et sécurité dans la clinique par rapport aux études chez l’animal. Ces dispositifs peuvent être utilisés pour modéliser la fonction de n’importe quel type d’orgue et peuvent être assistés connectés en commun microcanaux bordées d’endothélium pour effectuer des études in vitro sur la physiologie humaine ensemble corps-niveau et orgue sans avoir à réaliser des expériences sur les personnes. Ces puces d’orgue se composent de deux canaux microfluidiques perfusé séparés par une membrane élastomère perméable avec organe-spécifiques des cellules parenchymateuses sur un côté et endothélium microvasculaire sur l’autre, qui peut être étiré de façon cyclique à fournir certains organes mécaniques cues (p. ex., respiration des requêtes dans les poumons). Ce protocole détaille la fabrication de canal flexible double, orgue puces par moulage de pièces en 3D imprimé de moules, de combiner plusieurs casting et étapes de post-traitement. Poly poreux (siloxane diméthylique) membranes (PDMS) sont coulés avec micromètre de taille à travers-trous à l’aide de tableaux de pilier de silicium sous compression. Fabrication et assemblage de puces orgue consiste à équipement et des mesures pouvant être mises en œuvre à l’extérieur de la salle blanche traditionnelle. Le présent protocole aux chercheurs accès à la technologie de la puce de l’orgue pour in vitro études niveau des organes et des corps dans la découverte de médicaments, de sécurité et de tests d’efficacité, ainsi que des études mécanistes de processus biologiques fondamentaux.
Introduction
Nous décrivons ici la fabrication de double canal, vascularisée orgue-on-a-Chip (puce de l’orgue) culture des dispositifs microfluidiques utilisant un protocole évolutif se prêtent à l’usage des groupes de recherche manque d’accès aux salles propres et aux outils de la lithographie douce traditionnelle. Ces appareils ont été développés pour récapituler les fonctions organe humaines pour compréhension normale et physiologie de la maladie, comme drogue responses in vitro1,2. Critique de génie cette fonctionnalité sont deux canaux microfluidiques perfusé, séparés par une membrane semi-perméable (Figure 1). Cette conception permet aux loisirs des interfaces un tissu entre au moins deux types de tissus, typiquement les cellules parenchymateuses orgue sur un côté de la membrane poreuse et l’endothélium vasculaire, d’autre part, ainsi que leur exposition à l’écoulement du fluide. En outre, parce que le polymère élastomère, poly (siloxane diméthylique) (PDMS), sont utilisées pour fabriquer le corps de la puce de l’orgue et constituants membranaires, des sollicitations mécaniques cycliques peuvent être appliqués à l’ensemble d’ingénierie-un tissu d’interface via l’élastique membrane pour imiter le microenvironnement physique naturel de la vie, tels que respiration des requêtes dans le poumon et le péristaltisme de l’intestin.
Figure 1 : orgue puce cross section. Orgue Chips sont constitués de deux chaînes, séparées par une membrane poreuse et élastique qui peut être ensemencée avec des cellules des deux côtés. Canal du haut sont des sections droites 1 mm de large x 1 mm en bas hauteur, canal cross sections sont de 1 mm de large x canaux 0,2 mm de haut et sous vide dans les deux et les parties inférieures sont de 0,3 mm de large, 0,5 mm de hauteur et espacés de 0,3 mm à partir des canaux fluidiques. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Ces extensible, double canal, orgue Chips ont été utilisés pour démontrer l’impact de la respiration motion sur l’absorption des nanoparticules dans le poumon et l’oedème pulmonaire induite par le médicament3,4; effets de mouvement péristaltique sur5 de la différenciation et la prolifération bactérienne dans l’intestin5,6,7; et l’influence des déformations cycliques en raison de la pulsation du cœur sur la différenciation et la maturation des podocytes glomérulaire du rein8. En outre, ces dispositifs de deux-lumen qui contiennent un canal vasculaire endothélium bordé, séparé par une matrice extracellulaire (ECM)-membrane enduite de cellules parenchymateuses dans un canal accessible séparément sont bien adaptés pour la caractérisation des drogues PK paramètres et nouvelle découverte de cible, qui a été limitée en perfusion unique canal systèmes. En outre, plusieurs organes Chips peuvent être reliés entre eux via leurs canaux vasculaires de créer efficacement un humain corps-on-Chip, qui pourrait offrir une plate-forme attractive humaine in vitro pour thérapeutique développement9, 10. Contrairement aux systèmes (MPS) plus micro-physiologiques11,12,13, les puces d’orgue contiennent deux canaux microfluidiques, séparés par une membrane poreuse qui facilite les interactions vasculaire parenchymateux à récapituler dans vivo fonction des organes. Cela simplifie non seulement lier ensemble différents organes en perfusant un moyen commun à travers les canaux vasculaires, mais le cloisonnement des tissus et les fluides imite en vivo fonctions et prend en charge l’expérimentation pharmacocinétique et la modélisation ainsi que in vitro–in vivo extrapolation9,10 qui est difficile, voire impossible à canal unique MPS14,15,16. La popularité du PDMS dans Dispositifs microfluidiques a conduit à l’élaboration d’outils pour surmonter la capacité intrinsèque du matériau à absorber les petites molécules10,17. Cependant, le grand nombre de jetons nécessaires pour appuyer les études biologiques où l’utilisation d’agents microbiens et composés absorbant les PDMS faire réutiliser des puces orgue difficile nécessite un procédé de fabrication évolutive même pour les petits groupes. Le protocole décrit ici présente une méthode pour la fabrication de dispositifs appropriée pour l’usage dans des laboratoires universitaires, y compris ceux qui manquent d’accès aux salles propres et doux lithographie. Ce protocole vise à élargir l’accès aux puces de l’orgue par un large éventail de chercheurs qui cherchent à utiliser les appareils extensibles, double canal pour explorer les processus biologiques fondamentaux ainsi que le développement de thérapeutique translationnelle.
S’appuyant sur les meilleures pratiques des champs micromanufacturing couplés avec la conception à la fabrication, de façon robuste a été développé pour la fabrication de dispositifs de puce de l’orgue en grande quantité avec un rendement et une reproductibilité élevée. Le protocole de fabrication décrit ici fournit une méthode évolutive pour la production de copeaux de l’orgue. Les auteurs décrivent l’utilisation d’une option moule en Place Jig (MiP ; détails de conception en Matériaux supplémentaires) couplé avec des bandes de joint polyuréthane pour permettre l’intensification de la coulée des composants PDMS. Le côté brillant des bandes en polyuréthane de produire des pièces PDMS optiquement lisses tandis que le côté texturé facilite le démoulage. Nous décrivons également l’utilisation d’un facultatif automatisé Membrane manufacturier (AMF) qui fournit une compression uniforme de moules de gaufrette de membrane durant le mûrissement de fabrication jusqu’à 24 membranes par lot. Le design est largement applicable pour l’étude des organes qui sont composés de tissus qui connaissent les sollicitations mécaniques et la perfusion, et ces puces peuvent être produites avec une faible variabilité puce-à-puce dans les quantités requises pour répondre aux besoins des petites et grandes groupes de recherche aussi bien. Le flux de travail est favorable à un format de lot ou de la chaîne de montage et difficilement compatibles avec les protocoles d’évaluation de qualité pour le contrôle des procédés de production, formation du personnel et le dépannage réactif. Nous espérons que ce protocole étendra l’accès aux possibilités de double canal, extensible, copeaux de l’orgue pour la recherche fondamentale et translationnelle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le procédé de fabrication s’appuie sur les moules imprimés 3D haute résolution au motif que les éléments de carrosserie de puce orgue à haut et en bas PDMS couplés avec micromolded membranes poreuses de PDMS. Cette approche critique a été sélectionnée due à la facilité de prototypage combiné avec transition rapide à plus grande échelle de fabrication et remplacement de l’outillage. Les moules de composant haut de la page sont conçus aux ports de motif dans des endroits précis avec des profils verti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions M. Rousseau et S. Kroll pour aide avec photographie et vidéographie et M. Ingram, J. Nguyen, D. Shea, N. Wen pour contribution à l’élaboration de protocoles de fabrication initiale. Cette recherche a été parrainée par l’Institut Wyss pour biologiquement inspiré Engineering à l’Université Harvard et le Defense Advanced Research Projects Agency sous accords de coopération #W911NF-12-2-0036 et #W911NF-16-C-0050, et la FDA accorde le # HHSF223201310079C, NIH accorde #R01-EB020004 et #UG3-HL141797-01, et Bill et Melinda Gates Foundation accorde #OPP1163237 et #OPP1173198 DEI. Les vues et les conclusions contenues dans ce document sont celles des auteurs et ne doit pas être interprétées comme représentant les politiques officielles, soit expresse ou implicite, de la Defense Advanced Research Projects Agency, l’alimentation et l’Administration de médicaments, la National Institutes of Health, ou le gouvernement des États-Unis.
Materials
| Personal Protective Equipment | |||
| Hairnet | VWR | 89107-770 | |
| Tyvek lab coat | VWR | 13450-506 | |
| Extended cuff gloves | VWR | 89521-898 | |
| Equipment | |||
| Cutting mat | VWR | 102096-430 | |
| Tile cutter | McMaster-Carr | 26765A31 | |
| Mold-in-place (MIP) top molds | Protolabs, Inc. | custom | printed in Prototherm 12120 |
| Mold-in-place (MIP) bottom molds | Protolabs, Inc. | custom | printed in Prototherm 12121 |
| Duckbill curved forceps | VWR | 63041-864 | |
| Sharp tipped forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | |
| Metal spatula | VWR | 82027-528 | |
| Deep reactive ion etch (DRIE) pillar array wafers | Sensera, Inc. | custom | Four 50 x 50 mm pillar arrays per wafer; pillars 7 um wide, 50 um tall, spaced hexagonally 40 um apart |
| Textured polycarbonate .01” thick | McMaster-Carr | 85585K33 | cut to 45 mm square |
| PDMS blocks (40 x 40 x 5 mm) | n/a | custom | |
| Laminar flow hood | Germfree | BVBI | cast in-house |
| Air gun | |||
| 60°C level oven | |||
| Vacuum desiccator | |||
| Mass balance | accuracy to 0.1 g | ||
| Plasma machine | Diener | Nano | oxygen plasma capability is critical |
| Supplies | |||
| Sylgard 184 poly (dimethylsiloxane) (PDMS) base/curing agent kit | Ellsworth Adhesives | 4019862 | |
| Mixing cup | Ensure adequate ventilation when handling prepolymer due to low levels of ethylbenzene | ||
| 1 mL syringe | VWR | 10099-395 | |
| Cleanroom wipes | VWR | TWTX1080 | |
| 25 x 75 mm glass microscope slides | VWR | 48311-703 | |
| Packing tape | VWR | 500043-724 | |
| Scotch tape | VWR | 500026-873 | |
| Die-cut Polyurethane (PU) strips | Atlantic Gasket, Inc. | custom: AGWI2X3 | 1/8” thick; 60 Durometer Black Polyurethane; 2” x 3” |
| Polycarbonate film .005” thick | McMaster-Carr | 85585K102 | |
| 100 x 100 x 15 mm square gridded petri dishes | VWR | 60872-480 | |
| Aluminum foil | |||
| Optional Equipment | |||
| Thinky PDMS Mixer | Thinky | ARE-310 | |
| Mold-in place (MIP) jig | in-house | screw clamp compression jig | |
| Automated membrane fabricator (AMF) | in-house | pneumatic compression piston array with programmable heater |
References
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