Fabbricazione scalabile di Stretchable, Dual Channel, organo di Microfluidic chip
Summary
Qui, presentiamo un protocollo che descrive la fabbricazione di estensibile, bicanale, dispositivi organo chip microfluidici cella cultura per ricapitolare la funzionalità a livello dell’organo in vitro.
Abstract
Un numero significativo di composti del piombo non riuscire nella pipeline farmaceutica perché gli studi sugli animali, spesso non riescono a predire le risposte cliniche in pazienti umani. Umano dell’organo-on-a-Chip (Chip organo) cella cultura dispositivi microfluidici, che forniscono una piattaforma sperimentale in vitro per valutare efficacia, tossicità e farmacocinetica (PK) profili in esseri umani, possono essere meglio predittori di efficacia terapeutica e sicurezza nella clinica rispetto a studi sugli animali. Questi dispositivi possono essere utilizzati per la funzione di praticamente qualsiasi tipo di organo di modello e possono essere collegati fluidically attraverso comuni microcanali endotelio-allineate per eseguire gli studi in vitro sulla fisiologia umana di intero corpo-livello e organo senza dover condurre esperimenti sulle persone. Questi chip di organo sono costituiti da due canali microfluidici irrorato separati da una membrana elastomerica permeabile con organo-specifiche cellule parenchimatiche su un lato ed endotelio microvascolare da altro, che possono essere allungata ciclicamente a fornire organo-specifiche meccaniche cues (ad es., movimenti nel polmone respiratori). Questo protocollo dettaglia la fabbricazione di flessibile, bicanale, Chips di organo attraverso la fusione delle parti utilizzando 3D stampato stampi, consentendo la combinazione di colata più e passaggi di post-elaborazione. Poroso poli (silossano dimetilico) membrane (PDMS) sono espressi con micrometro dimensioni fori utilizzando matrici di pilastro di silicio sotto compressione. Fabbricazione e assemblaggio di organo chip coinvolge attrezzature e passaggi che possono essere attuate di fuori di una camera bianca tradizionale. Questo protocollo fornisce ai ricercatori con accesso alla tecnologia Chip organo per in vitro studi di organo e corpo-livello nella scoperta della droga, sicurezza e prove di efficacia, come pure gli studi meccanicistici di processi biologici fondamentali.
Introduction
Qui, descriviamo la fabbricazione di doppio canale, vascolarizzati dispositivi di cultura microfluidici organo-on-a-Chip (Chip organo) utilizza un protocollo scalabile favorevole per l’utilizzo di gruppi di ricerca non hanno accesso alle camere bianche e agli strumenti tradizionali litografia soft. Questi dispositivi sono stati sviluppati per ricapitolare le funzioni a livello di organo umane per comprensione normale e fisiologia di malattia, come pure la droga le risposte in vitro1,2. Critica all’ingegneria questa funzionalità sono due canali microfluidici irrorato separati da una membrana semipermeabile (Figura 1). Questo design consente di ricreazione delle interfacce di tessuto-tessuto tra almeno due tipi di tessuti, in genere cellule parenchimali dell’organo su un lato della membrana porosa e l’endotelio vascolare da altro, come pure loro esposizione al flusso del fluido. Inoltre, poiché il polimero elastomerico, poli (silossano dimetilico) (PDMS), viene utilizzato per fabbricare il corpo organo Chip e componenti della membrana, sforzo meccanico ciclico possono essere applicati all’intero progettato tessuto-tessuto interfaccia tramite l’elastico membrana per imitare il microambiente fisico naturale di organi viventi, come respiratori mozioni nel polmone e peristalsi nell’intestino.
Figura 1: sezione trasversale organo Chip. Chips di organo è composto da due canali separati da una membrana porosa, elastica che può essere seminata con cellule su entrambi i lati. Canale superiore le sezioni trasversali sono 1 mm di larghezza x 1 mm alta, fondo canale croce sezioni sono di 1 mm di larghezza x 0,2 mm alta e vuoto canali in entrambi e parti inferiori sono 0,3 mm di larghezza, 0.5 mm di altezza e distanziati 0,3 mm dai canali fluidici. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Questi stretchable, doppio canale, organo Chips sono stati utilizzati per dimostrare l’impatto della respirazione movimento sull’assorbimento delle nanoparticelle nel polmone ed edema polmonare droga-indotto3,4; effetti di movimento peristaltico sulla differenziazione5 e crescita eccessiva batterica in intestino5,6,7; influenza delle deformazioni ciclici dovuto la pulsazione del cuore sulla differenziazione e maturazione dei Glomerulare podociti nel rene8. Inoltre, questi dispositivi di due lumi che contengono un canale vascolare endotelio-allineate, separato da una matrice extracellulare (ECM)-membrana rivestita da cellule parenchimali all’interno di un canale separatamente accessibile sono adatti per la caratterizzazione di droga PK parametri e nuova scoperta di destinazione, che è stato limitato nell’aspersione singolo canale sistemi. Inoltre, Chips di organo multiple possono essere collegate insieme tramite loro scanalature vascolari per creare efficacemente un umano corpo-on-chip, in grado di offrire una piattaforma attraente umana in vitro per terapie sviluppo9, 10. A differenza di più micro-fisiologici sistemi (MPS)11,12,13, i chip di organo contiene due canali microfluidici separati da una membrana porosa che facilita le interazioni vascolare parenchimale a ricapitolare in vivo funzione dell’organo. Questo non solo semplifica il collegamento di diversi organi insieme irrorando un mezzo comune attraverso le scanalature vascolari, ma la compartimentazione di tessuti e fluidi imita in vivo funzioni e supporta la sperimentazione farmacocinetica e modellazione così come in vitro–in vivo estrapolazione9,10 che è difficile o impossibile a canale singolo MPS14,15,16. La popolarità di PDMS in dispositivi microfluidici ha portato allo sviluppo di strumenti per superare la capacità del materiale di assorbire piccole molecole10,17. Tuttavia, i grandi numeri dei chip necessari per supportare gli studi biologici, dove l’uso di agenti microbici e PDMS-assorbendo composti fanno riutilizzare di organo chip difficile richiedono un processo di fabbricazione scalabile anche per piccoli gruppi di ricerca. Il protocollo descritto qui presenta un metodo per la fabbricazione di dispositivi adatto all’impiego in laboratori accademici, compresi quelli non hanno accesso a camere bianche e litografia soft. Questo protocollo mira a estendere l’accesso ai circuiti integrati dell’organo da una vasta gamma di ricercatori che cercano di utilizzare i dispositivi stretchable, dual-channel per esplorare i processi biologici fondamentali così come sviluppo terapeutico traslazionale.
Sfruttando consigliate dai campi micromanufacturing accoppiati con design per la produzione, è stato sviluppato un approccio robusto per fabbricare dispositivi organo Chip in grandi quantità con resa e alta riproducibilità. Il protocollo di fabbricazione descritto qui fornisce un metodo scalabile per la produzione di Chip di organo. Descriviamo l’uso di un opzionale Mold-in-Place Jig (MiP; dettagli di design in Materiali supplementari) accoppiato con le strisce di guarnizione in poliuretano per consentire la scalabilità di PDMS componenti del pezzo fuso. Il lato lucido del poliuretano strisce produrre otticamente liscia PDMS parti mentre il lato strutturato facilita la sformatura. Inoltre descriviamo l’uso di un opzionale automatizzato membrana Fabricator (AMF) che fornisce una compressione uniforme di stampi di wafer di membrana durante la polimerizzazione per fabbricare fino a 24 membrane per ogni batch. Il design è ampiamente applicabile per gli studi degli organi che sono composti di tessuti che l’esperienza di sollecitazioni meccaniche e perfusione, e questi chip possono essere prodotto con bassa variabilità di truciolo-truciolo in quantità necessaria per soddisfare le esigenze di piccole e grandi gruppi di ricerca allo stesso modo. Il flusso di lavoro è favorevole a un formato batch o linea di assemblaggio e compatibili con protocolli di valutazione di qualità per il controllo dei processi di produzione, formazione del personale e la risoluzione reattivo. Ci auguriamo che questo protocollo si espanderà l’accesso alle funzionalità di doppio canale, estensibile, patatine di organo per la ricerca di base e traslazionale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il processo di fabbricazione si basa sulle muffe stampato 3D di alta risoluzione per modello i componenti corpo PDMS superiore e inferiore dell’organo Chip accoppiati con micromolded membrane porose di PDMS. Questo approccio critico è stato selezionato dovuta alla facilità di prototipazione combinato con rapida transizione in scalabilità fabbricazione e sostituzione degli utensili. Gli stampi di componente superiore sono progettati per porte modello in posizioni precise con profili verticali definiti durante la fase d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo M. Rousseau e S. Kroll per aiuto con fotografia e videografia e M. Ingram, J. Nguyen, D. Shea e N. Wen per i contributi allo sviluppo del protocollo di montaggio iniziale. Questa ricerca è stata sponsorizzata dall’Istituto Wyss per biologicamente ispirato ingegneria presso l’Università di Harvard e la Defense Advanced Research Projects Agency sotto accordi di cooperativa n #W911NF-12-2-0036 e n #W911NF-16-C-0050 e FDA concedere n. HHSF223201310079C, NIH concede n #R01-EB020004 e n #UG3-HL141797-01, e Bill e Melinda Gates Foundation concede #OPP1163237 e #OPP1173198 a DEI. Le viste e le conclusioni contenute nel presente documento sono quelle degli autori e non deve essere interpretati come rappresentare le politiche ufficiali, sia espressa o implicita, della Defense Advanced Research Projects Agency, Food and Drug Administration, la Istituti nazionali di salute, o di governo degli Stati Uniti.
Materials
| Personal Protective Equipment | |||
| Hairnet | VWR | 89107-770 | |
| Tyvek lab coat | VWR | 13450-506 | |
| Extended cuff gloves | VWR | 89521-898 | |
| Equipment | |||
| Cutting mat | VWR | 102096-430 | |
| Tile cutter | McMaster-Carr | 26765A31 | |
| Mold-in-place (MIP) top molds | Protolabs, Inc. | custom | printed in Prototherm 12120 |
| Mold-in-place (MIP) bottom molds | Protolabs, Inc. | custom | printed in Prototherm 12121 |
| Duckbill curved forceps | VWR | 63041-864 | |
| Sharp tipped forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | |
| Metal spatula | VWR | 82027-528 | |
| Deep reactive ion etch (DRIE) pillar array wafers | Sensera, Inc. | custom | Four 50 x 50 mm pillar arrays per wafer; pillars 7 um wide, 50 um tall, spaced hexagonally 40 um apart |
| Textured polycarbonate .01” thick | McMaster-Carr | 85585K33 | cut to 45 mm square |
| PDMS blocks (40 x 40 x 5 mm) | n/a | custom | |
| Laminar flow hood | Germfree | BVBI | cast in-house |
| Air gun | |||
| 60°C level oven | |||
| Vacuum desiccator | |||
| Mass balance | accuracy to 0.1 g | ||
| Plasma machine | Diener | Nano | oxygen plasma capability is critical |
| Supplies | |||
| Sylgard 184 poly (dimethylsiloxane) (PDMS) base/curing agent kit | Ellsworth Adhesives | 4019862 | |
| Mixing cup | Ensure adequate ventilation when handling prepolymer due to low levels of ethylbenzene | ||
| 1 mL syringe | VWR | 10099-395 | |
| Cleanroom wipes | VWR | TWTX1080 | |
| 25 x 75 mm glass microscope slides | VWR | 48311-703 | |
| Packing tape | VWR | 500043-724 | |
| Scotch tape | VWR | 500026-873 | |
| Die-cut Polyurethane (PU) strips | Atlantic Gasket, Inc. | custom: AGWI2X3 | 1/8” thick; 60 Durometer Black Polyurethane; 2” x 3” |
| Polycarbonate film .005” thick | McMaster-Carr | 85585K102 | |
| 100 x 100 x 15 mm square gridded petri dishes | VWR | 60872-480 | |
| Aluminum foil | |||
| Optional Equipment | |||
| Thinky PDMS Mixer | Thinky | ARE-310 | |
| Mold-in place (MIP) jig | in-house | screw clamp compression jig | |
| Automated membrane fabricator (AMF) | in-house | pneumatic compression piston array with programmable heater |
References
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