Fabricación escalable de elástico, doble canal, Chips microfluídicos órgano
Summary
Aquí, presentamos un protocolo que describe la fabricación de elástico, doble canal, órgano chip microfluídico célula cultura dispositivos Recapitulando a nivel órgano funcionalidad in vitro.
Abstract
Un número importante de compuestos de plomo falla en la tubería farmacéutica porque estudios en animales a menudo no logran predecir la respuesta clínica en pacientes humanos. Humanos órgano-en-un-Chip (Chip de órgano) de la célula cultura dispositivos microfluídicos, que proporcionan una plataforma experimental en vitro para evaluar la eficacia, toxicidad y perfiles farmacocinéticos (PK) en seres humanos, pueden ser mejores predictores de eficacia terapéutica y seguridad en la clínica en comparación con los estudios en animales. Estos dispositivos pueden utilizarse para modelar la función de prácticamente cualquier tipo de órgano y fluídicamente pueden vincularse a través de microcanales de revestimiento de endotelio común para llevar a cabo estudios en vitro en fisiología humana nivel de órgano y conjunto a nivel de cuerpo sin tener que realizar experimentos en la gente. Estos Chips de órgano consisten en dos canales de microfluidos perfusión separados por una membrana elastomérica permeable con células parenquimatosas de órganos específicos en un lado y el endotelio microvascular, que puede estirar cíclicamente para proporcionar órgano-específicas señales mecánicas (p. ej., respiración de movimientos en el pulmón). Este protocolo detalla la fabricación de canal dual, flexible, Chips de órgano a través de la fundición de piezas utilizando 3D impreso moldes, permitiendo la combinación de varios casting y pasos de procesamiento posterior. Polietileno poroso (siloxano dimethyl) membranas (PDMS) se echan con micrómetro de tamaño agujeros utilizando silicio Pilar bajo compresión. Fabricación y montaje de órganos consiste en equipos y medidas que pueden aplicarse fuera de una sala tradicional. Este protocolo ofrece a los investigadores acceso a tecnología de Chip de órgano en vitro estudios a nivel de órganos y cuerpo en el descubrimiento de medicamentos, seguridad y eficacia de prueba, así como estudios mecanicistas de los procesos biológicos fundamentales.
Introduction
Aquí, describimos la fabricación de doble canal, dispositivos de cultura microfluídicos de órgano-en-un-Chip (Chip de órgano) vascularizados mediante un protocolo escalable dispuesto para el uso de grupos de investigación que carecen de acceso a salas blancas y herramientas de litografía blanda tradicional. Estos dispositivos se han desarrollado para recapitular humanas funciones órgano de comprensión normal y fisiología de la enfermedad, así como droga las respuestas in vitro1,2. Crítica a la ingeniería de esta funcionalidad son dos canales de microfluidos perfundidos, separados por una membrana semipermeable (figura 1). Este diseño permite la recreación de interfaces tejido entre al menos dos tipos de tejidos, por lo general células parenquimatosas de órganos en un lado de la membrana porosa y endotelio vascular en el otro, así como su exposición al flujo de fluidos. Además, porque el polímero elastomérico, poly (siloxano dimethyl) (PDMS), se utiliza para fabricar el cuerpo del órgano Chip y componentes de la membrana, tensiones mecánicas cíclicas pueden aplicarse a toda la ingeniería del tejido interfaz vía el elástico membrana para imitar el microambiente físico natural de los órganos de la vida, como respiración movimientos en el pulmón y la peristalsis en el intestino.
Figura 1: sección de órgano Chip. Órgano Chips consisten en dos canales separados por una membrana porosa y elástica que puede ser sembrada con células en ambos lados. Canal superior las secciones transversales son 1 mm de ancho x fondo alto, 1 m m del canal transversal secciones son 1 mm de ancho x 0.2 mm alto y vacío canales ambos y partes inferiores son de 0,3 mm de ancho, 0,5 mm de altura y espaciados 0,3 mm de los canales fluídicos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Estos estirable, doble canal, órgano Chips han sido utilizados para demostrar el impacto de la respiración el movimiento en la absorción de nanopartículas en el pulmón y el edema pulmonar inducido por drogas3,4; efectos del movimiento peristáltico en diferenciación5 y sobrecrecimiento bacteriano en el intestino5,6,7; y la influencia de las deformaciones cíclicas debido a las pulsaciones del corazón en la diferenciación y maduración de los podocytes glomerulares en el riñón8. Además, estos dispositivos de dos luces que contienen un canal vascular endotelio alineado, separado por una matriz extracelular (ECM)-membrana revestida de células parenquimatosas en un canal de acceso por separado están bien adaptadas para caracterización de drogas PK parámetros y nuevo descubrimiento de blanco, que ha sido limitado en perfusión única canal de sistemas. Por otra parte, múltiples Chips de órgano puede vincularse a través de sus canales vasculares para efectivamente crear un humano cuerpo-on-chips, que podrían ofrecer una plataforma atractiva humanos en vitro para el desarrollo de la terapéutica9, 10. A diferencia de micro-fisiológico más sistemas (MPS)11,12,13, las virutas de órgano contienen dos canales de microfluidos separados por una membrana porosa que facilita interacciones vascular parénquima recapitular en vivo la función del órgano. Esto no sólo simplifica la vinculación de los diferentes órganos juntos por perfundiendo un medio común a través de los canales vasculares, pero la compartimentalización de tejidos y fluidos imita en vivo las funciones y soporta experimentación farmacocinético y modelado y en vitro–en vivo extrapolación9,10 que es difícil o imposible en solo canal MPS14,15,16. La popularidad de PDMS en dispositivos microfluídicos ha llevado al desarrollo de herramientas para superar la capacidad inherente del material para absorber moléculas pequeñas10,17. Sin embargo, el gran número de fichas necesario para los estudios biológicos, donde el uso de agentes microbianos y compuestos absorbentes de PDMS que reutilizar fichas órgano difícil requiere un proceso de fabricación escalable incluso para grupos pequeños. El protocolo descrito aquí presenta un método para la fabricación de dispositivo adecuado para el uso en laboratorios académicos, los que carecen de acceso a salas limpias y litografía blanda incluidos. Este protocolo tiene como objetivo ampliar el acceso a fichas de órgano por una amplia gama de investigadores que buscan utilizar los dispositivos elásticos, canales para explorar procesos biológicos básicos, así como desarrollo terapéutico traslacional.
Aprovechando las mejores prácticas de microfabricación campos juntados con el diseño para la fabricación, un robusto enfoque fue desarrollado para la fabricación de dispositivos de Chip de órgano en grandes cantidades con rendimiento y alta reproducibilidad. El protocolo de fabricación descrito aquí proporciona un método escalable para la producción de la viruta del órgano. Describimos el uso de un opcional molde en lugar plantilla (MiP, detalles de diseño en Materiales complementarios) juntada con las tiras de poliuretano Junta para ampliación de bastidor componentes PDMS. El lado brillante de las tiras de poliuretano produce piezas PDMS ópticamente lisas mientras que el lado texturado facilita el desmoldeo. También describimos el uso de una opcional automática membrana fabricante (AMF) que proporciona la compresión uniforme de moldes de oblea de membrana durante el curado para la fabricación de hasta 24 membranas por lote. El diseño es ampliamente aplicable para estudios de órganos que se componen de tejidos que experimentan tensiones mecánicas y la perfusión, y estos chips se pueden producir con poca variabilidad de chip a chip en cantidades necesarias para satisfacer las necesidades de pequeñas y grandes grupos de investigación por igual. El flujo de trabajo es susceptible de un formato por lotes o línea de montaje y fácilmente compatible con protocolos de evaluación de calidad para el control de procesos de producción, formación de personal y resolución de problemas capacidad de respuesta. Esperamos que este protocolo ampliará acceso a las capacidades de doble canal, estirable, Chips de órgano para la investigación básica y traslacional.
Protocol
Representative Results
Discussion
El proceso de fabricación se basa en moldes impresos 3D de alta resolución al patrón el PDMS superior e inferior órgano cuerpo componentes junto con membranas PDMS porosas micromolded. Este enfoque crítico fue seleccionado debido a la facilidad de prototipos combinado con la rápida transición hacia mayor fabricación y sustitución de herramientas. Los moldes principales componentes están diseñados para puertos de patrón en lugares precisos con perfiles definidos durante la etapa de fundición. Esto no sólo ev…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a M. Rousseau y S. Kroll para obtener ayuda con la fotografía y videografía Ingram M., J. Nguyen, D. Shea y Wen N. contribuciones al desarrollo de protocolo de fabricación inicial. Esta investigación fue patrocinada por el Instituto Wyss para biológicamente inspirado de ingeniería en la Universidad de Harvard y la Defense Advanced Research Projects Agency bajo acuerdos cooperativo #W911NF-12-2-0036 y #W911NF-16-C-0050 y FDA concesión # HHSF223201310079C, subvenciones de NIH R01-EB020004 # y #UG3-HL141797-01, y la Fundación Bill y Melinda Gates concede #OPP1163237 y #OPP1173198 a DEI. Las opiniones y conclusiones contenidas en este documento son las de los autores y no debe interpretarse como que representa la política oficial, ya sea expresa o implícita, de la Defense Advanced Research Projects Agency, Food and Drug Administration, la Institutos nacionales de salud, o el gobierno de Estados Unidos.
Materials
| Personal Protective Equipment | |||
| Hairnet | VWR | 89107-770 | |
| Tyvek lab coat | VWR | 13450-506 | |
| Extended cuff gloves | VWR | 89521-898 | |
| Equipment | |||
| Cutting mat | VWR | 102096-430 | |
| Tile cutter | McMaster-Carr | 26765A31 | |
| Mold-in-place (MIP) top molds | Protolabs, Inc. | custom | printed in Prototherm 12120 |
| Mold-in-place (MIP) bottom molds | Protolabs, Inc. | custom | printed in Prototherm 12121 |
| Duckbill curved forceps | VWR | 63041-864 | |
| Sharp tipped forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | |
| Metal spatula | VWR | 82027-528 | |
| Deep reactive ion etch (DRIE) pillar array wafers | Sensera, Inc. | custom | Four 50 x 50 mm pillar arrays per wafer; pillars 7 um wide, 50 um tall, spaced hexagonally 40 um apart |
| Textured polycarbonate .01” thick | McMaster-Carr | 85585K33 | cut to 45 mm square |
| PDMS blocks (40 x 40 x 5 mm) | n/a | custom | |
| Laminar flow hood | Germfree | BVBI | cast in-house |
| Air gun | |||
| 60°C level oven | |||
| Vacuum desiccator | |||
| Mass balance | accuracy to 0.1 g | ||
| Plasma machine | Diener | Nano | oxygen plasma capability is critical |
| Supplies | |||
| Sylgard 184 poly (dimethylsiloxane) (PDMS) base/curing agent kit | Ellsworth Adhesives | 4019862 | |
| Mixing cup | Ensure adequate ventilation when handling prepolymer due to low levels of ethylbenzene | ||
| 1 mL syringe | VWR | 10099-395 | |
| Cleanroom wipes | VWR | TWTX1080 | |
| 25 x 75 mm glass microscope slides | VWR | 48311-703 | |
| Packing tape | VWR | 500043-724 | |
| Scotch tape | VWR | 500026-873 | |
| Die-cut Polyurethane (PU) strips | Atlantic Gasket, Inc. | custom: AGWI2X3 | 1/8” thick; 60 Durometer Black Polyurethane; 2” x 3” |
| Polycarbonate film .005” thick | McMaster-Carr | 85585K102 | |
| 100 x 100 x 15 mm square gridded petri dishes | VWR | 60872-480 | |
| Aluminum foil | |||
| Optional Equipment | |||
| Thinky PDMS Mixer | Thinky | ARE-310 | |
| Mold-in place (MIP) jig | in-house | screw clamp compression jig | |
| Automated membrane fabricator (AMF) | in-house | pneumatic compression piston array with programmable heater |
References
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Benam, K. H., et al. Engineered In vitro Disease Models. Annual Review of Pathology Mechanisms of Disease. 10 (1), 195-262 (2015).
- Huh, D., et al. A Human Disease Model of Drug Toxicity-Induced Pulmonary Edema in a Lung-on-a-Chip Microdevice. Science Translational Medicine. 4 (159), 159ra147 (2012).
- Huh, D., et al. Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab on a Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).
- Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-Chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integrative Biology. 5 (9), 1130-1140 (2013).
- Kim, H. J., Li, H., Collins, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), E7-E15 (2016).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1 (5), s41551-017-0069–017 (2017).
- Somayaji, M. R., Das, D., Przekwas, A. Computational approaches for modeling and analysis of human-on-chip systems for drug testing and characterization. Drug Discovery Today. 21 (12), 1859-1862 (2016).
- Prantil-Baun, R., et al. Physiologically Based Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis Enabled by Microfluidically Linked Organs-on-Chips. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 58 (1), 37-64 (2018).
- Mahler, G. J., Esch, M. B., Stokol, T., Hickman, J. J., Shuler, M. L. Body-on-a-chip systems for animal-free toxicity testing. Alternatives to laboratory animals: ATLA. 44 (5), 469-478 (2016).
- Miller, P. G., Shuler, M. L. Design and demonstration of a pumpless 14 compartment microphysiological system. Biotechnology and Bioengineering. 113 (10), 2213-2227 (2016).
- Coppeta, J. R., et al. A portable and reconfigurable multi-organ platform for drug development with onboard microfluidic flow control. Lab Chip. 17 (1), 134-144 (2016).
- Wikswo, J. P., et al. Scaling and systems biology for integrating multiple organs-on-a-chip. Lab on a Chip. 13 (18), 3496-3511 (2013).
- Sung, J. H., et al. Using PBPK guided "Body-on-a-Chip" Systems to Predict Mammalian Response to Drug and Chemical Exposure. Experimental biology and medicine (Maywood, N.J.). 239 (9), 1225-1239 (2014).
- Stokes, C., Cirit, M., Lauffenburger, D. Physiome-on-a-Chip: The Challenge of "Scaling" in Design, Operation, and Translation of Microphysiological Systems. CPT: Pharmacometrics & Systems Pharmacology. 4 (10), 559-562 (2015).
- Shirure, V. S., George, S. C. Design considerations to minimize the impact of drug absorption in polymer-based organ-on-a-chip platforms. Lab Chip. , (2017).
- Huh, D., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nature Protocols. 8 (11), 2135-2157 (2013).
- Tran, T. T., et al. Exact kinetic analysis of passive transport across a polarized confluent MDCK cell monolayer modeled as a single barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 93 (8), 2108-2123 (2004).
- Henry, O. Y. F., et al. Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function. Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).
- Maoz, B. M., et al. Organs-on-Chips with combined multi-electrode array and transepithelial electrical resistance measurement capabilities. Lab on a Chip. 17 (13), 2294-2302 (2017).
- Benam, K. H., et al. Matched-Comparative Modeling of Normal and Diseased Human Airway Responses Using a Microengineered Breathing Lung Chip. Cell Systems. 3 (5), 456-466 (2016).
