تصنيع قابلة المط ومزدوجة القناة، رقائق موائع جزيئية الجهاز
Summary
نقدم هنا، بروتوكول يصف تلفيق قناة المط، مزدوج، الجهاز رقاقة موائع جزيئية خلية الثقافة الأجهزة لأتصدى وظائف الجهاز-مستوى المختبر.
Abstract
فشل عدد كبير من مركبات الرصاص في خط الأنابيب الصيدلانية نظراً لأن الدراسات الحيوانية غالباً ما تعجز عن التنبؤ بالاستجابات السريرية في المرضى البشرية. قد يكون الجهاز على-رقيقة (الجهاز رقاقة) البشرية موائع جزيئية خلية الثقافة الأجهزة التي توفر منصة تجريبية في المختبر لتقييم فعالية وسمية، وملامح (PK) الحرائك الدوائية في البشر، تنبؤ أفضل من الفعالية العلاجية و السلامة في العيادة بالمقارنة مع الدراسات الحيوانية. يمكن استخدام نموذج الدالة من أي نوع الجهاز لهذه الأجهزة، ويمكن ربط فلويديكالي من خلال المشترك ميكروتشانيلس البطانة المبطنة لإجراء الدراسات في المختبر على علم وظائف الأعضاء البشرية على مستوى الجسم كله وعلى مستوى الجهاز دون الحاجة إلى إجراء تجارب على الناس. هذه “الرقائق الجهاز” تتألف من قناتين perfused موائع جزيئية مفصولة نفاذية الأغشية المرنة مع الخلايا الخاصة بالجهاز متني على جانب واحد والبطانة microvascular الأخرى، التي يمكن أن تمتد دورياً لتوفير الإشارات الميكانيكية الخاصة بالجهاز (مثل التنفس الالتماسات في الرئة). تفاصيل هذا البروتوكول تلفيق قناة مرنة، مزدوج، “رقائق الجهاز” عن طريق صب أجزاء باستخدام 3D طباعة قوالب، تمكن مجموعة من صب متعددة وتجهيز الخطوات. بولي المسامية (ثنائي ميثيل siloxane) ويلقي الأغشية (PDMS) مع ميكرومتر الحجم باستخدام صفائف عنصر السيليكون تحت ضغط من خلال الثقوب. تصنيع وتجميع “رقائق الجهاز” ينطوي على المعدات والخطوات التي يمكن أن تنفذ خارج تنظيم تقليدية. يوفر هذا البروتوكول الباحثين مع إمكانية الوصول إلى تكنولوجيا “رقاقة الجهاز” في المختبر الدراسات على مستوى الجهاز والهيئة في اكتشاف المخدرات والسلامة واختبار فعاليتها، فضلا عن الدراسات الميكانيكية للعمليات البيولوجية الأساسية.
Introduction
هنا، يمكننا وصف تلفيق قناة مزدوجة، أجهزة الثقافة vascularized موائع جزيئية الجهاز–على–رقيقة (الجهاز رقاقة) استخدام بروتوكول قابلة قابلة للاستخدام من قبل المجموعات البحثية التي تفتقر إلى الوصول إلى الأدوات التقليدية في الطباعة الحجرية الناعمة وكليانرومس. وقد وضعت هذه الأجهزة أن الخص وظائف الجهاز البشري لفهم عادي وفسيولوجيا الأمراض، فضلا عن المخدرات الردود في المختبر1،2. حاسمة بالنسبة للهندسة هذه الوظيفة قناتين perfused موائع جزيئية مفصولة بغشاء شبه منفذ (الشكل 1). يتيح هذا التصميم الترفيه واجهات الأنسجة الأنسجة بين نوعين على الأقل من الأنسجة، وعادة خلايا الجهاز متني على جانب واحد من الغشاء المسامية وبطانة الأوعية الدموية الأخرى،، فضلا عن تعرضهم لتدفق السوائل. وبالإضافة إلى ذلك، نظراً لأن البوليمر المرنة، بولي (ثنائي ميثيل siloxane) (PDMS)، ويستخدم لاختلاق الجسم “رقاقة الجهاز” ومكونات الغشاء، سلالة الميكانيكية دوري يمكن تطبيقها على كامل هندسيا الأنسجة الأنسجة واجهة عبر المرونة غشاء لتقليد المكروية الفيزيائية الطبيعية للأجهزة الحية، مثل التنفس الالتماسات في الرئة والتمعج في الأمعاء.
رقم 1: رقاقة الجهاز عبر الباب. رقائق الجهاز تتألف من قناتين مفصولة بغشاء المسامية، المرونة التي يمكن أن تبذر مع الخلايا على كلا الجانبين. قناة أعلى المقاطع العرضية 1 مم × 1 مم عالية، أسفل القناة عبر أقسام هي 1 مم × 0.2 مم قنوات عالية، وفراغ في كليهما والأجزاء السفلي هي 0.3 مم، 0.5 ملم عالية، والتباعد بين 0.3 مم من القنوات فلويديك. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
وقد استخدمت هذه القناة المط، مزدوج، “رقائق الجهاز” لإظهار تأثير التنفس الحركة على امتصاص نانوحبيبات في الرئة وذمة الرئة الناجمة عن المخدرات3،4؛ تأثيرات الحركة تحوي على التمايز5 وفرط البكتيرية في الأمعاء5،،من67؛ وتأثير التشوهات دوري سبب نبض القلب على تمايز ونضج بودوسيتيس الكبيبي في الكلي8. بالإضافة إلى ذلك، هذه الأجهزة اثنين-التجويف التي تحتوي على قناة مبطنة بطانة الأوعية الدموية مفصولة بمصفوفة خارج الخلية (ECM)-المغلفة غشاء من الخلايا متني داخل قناة موجوداً بشكل منفصل، أيضا مناسبة لتوصيف المخدرات PK المعلمات وهدف الاكتشاف الجديد، الذي اقتصر في نضح واحد قناة النظم. وعلاوة على ذلك، قد تكون مرتبطة متعددة “الجهاز رقائق” معا عن طريق قنواتهم الأوعية الدموية لفعالية إنشاء بشرية هيئة-على-رقائق، التي يمكن أن توفر منصة جذابة بشرية في المختبر للمداواة التنمية9، 10. خلافا الصغرى-الفسيولوجية أكثر النظم (MPS)11،12،13، تتضمن “رقائق الجهاز” قناتين موائع جزيئية مفصولة بغشاء مسامية تسهل التفاعلات الوعائية متني إلى الخص في فيفو وظيفة الجهاز. هذا يبسط ليس فقط الربط بين الأجهزة المختلفة معا بيرفوسينج متوسطة مشتركة من خلال القنوات والأوعية الدموية، ولكن التجزئة من الأنسجة والسوائل يحاكي وظائف في فيفو ويدعم التجريب الحرائك الدوائية و النمذجة وكذلك في المختبر–في فيفو استقراء9،10 التي من الصعب أو المستحيل في قناة واحدة من أعضاء البرلمان14،،من1516. شعبية PDMS في أجهزة موائع جزيئية قد أدى إلى تطوير أدوات للتغلب على هذه المواد المتأصلة قدرة على استيعاب جزيئات صغيرة10،17. ومع ذلك، يقتضي أعدادا كبيرة من رقائق المطلوبة لدعم الدراسات البيولوجية حيث جعل استخدام العوامل الميكروبية ومركبات امتصاص PDMS إعادة استخدام رقائق الجهاز صعبة عملية قابلة تصنيع حتى بالنسبة لمجموعات صغيرة للبحث. البروتوكول هو موضح هنا يقدم طريقة لتصنيع الجهاز مناسب للاستخدام في المختبرات الأكاديمية، بما في ذلك تلك التي تفتقر إلى الوصول إلى كلينرومس والطباعة الحجرية الناعمة. ويهدف هذا البروتوكول إلى توسيع نطاق الوصول إلى “رقائق الجهاز” بمجموعة واسعة من الباحثين تسعى إلى استخدام الأجهزة المط، مزدوجة القناة لاستكشاف العمليات البيولوجية الأساسية، فضلا عن التنمية العلاجية متعدية الجنسيات.
الاستفادة من أفضل الممارسات المستمدة من حقول ميكرومانوفاكتورينج إلى جانب التصميم للتصنيع، تم تطوير نهج قوية لاختلاق أجهزة “رقاقة الجهاز” بكميات كبيرة مع إمكانية تكرار نتائج عالية والعائد. ويوفر البروتوكول تلفيق الموصوفة هنا طريقة قابلة لإنتاج “الرقائق الجهاز”. يصف لنا استخدام الاختياري العفن في مكان الرقصة (MiP؛ وتفاصيل التصميم في مواد تكميلية) مقترنة بشرائط البولي يوريثان طوقا تمكينا للارتقاء بصب المكونات PDMS. الجانب اللامع من شرائط البولي يوريثان تنتج السلس بصريا PDMS أجزاء بينما الجانب محكم يسهل ديمولدينج. ونحن أيضا وصف الاستخدام للاختياري الآلي غشاء المفترى (صندوق النقد العربي) يوفر ضغط موحدة من العفن ويفر الغشاء أثناء علاج لاختلاق ما يصل إلى 24 الأغشية كل دفعة. التصميم الواجب التطبيق على نطاق واسع للدراسات المتعلقة بالأجهزة التي تتكون من الأنسجة التي تعاني من إجهاد الميكانيكية ونضح، ويمكن أن تنتج هذه الرقائق مع تقلب رقاقة رقاقة انخفاض في الكميات المطلوبة لتلبية الاحتياجات الكبيرة والصغيرة المجموعات البحثية على حد سواء. سير العمل قابلة لشكل دفعي أو خط التجميع، وسهولة متوافق مع بروتوكولات تقييم الجودة للسيطرة على عمليات الإنتاج وتدريب الموظفين، واستكشاف الأخطاء وإصلاحها متجاوبة. ونأمل أن هذا البروتوكول سيتم توسيع نطاق الوصول إلى قدرات مزدوجة القناة، المط، “رقائق الجهاز” للبحوث الأساسية ومتعدية الجنسيات.
Protocol
Representative Results
Discussion
عملية التصنيع تعتمد على قوالب المطبوعة 3D عالية الدقة لنمط مكونات الجسم PDMS “رقاقة الجهاز” أعلى وأسفل مقترنة بالأغشية PDMS المسامية ميكرومولديد. واختير هذا النهج النقدي الواجب للتخفيف من النماذج جنبا إلى جنب مع التحول السريع إلى تلفيق المحجمة عن واستبدال الأدوات. قوالب العنصر الأعلى مصممة لن…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر روسو م. و. س. كرول للحصول على التعليمات مع التصوير الفوتوغرافي بالفيديو وانجرام م. J. نغوين، شي د وون أ. مساهمات لتطوير بروتوكول التصنيع الأولية. هذا البحث كان تحت رعاية المعهد ويس “بيولوجيا الهم الهندسة” في جامعة هارفارد، ووكالة مشاريع البحوث المتقدمة الدفاع ضمن “الاتفاقات التعاونية” #W911NF-12-2-0036 ورقم W911NF-16-ج-0050، ومنح إدارة الأغذية والعقاقير # HHSF223201310079C، والمعاهد الوطنية للصحة يمنح #R01-EB020004 ورقم UG3-HL141797-01، وبيل وميليندا غيتس يمنح #OPP1163237 و #OPP1173198 DEI. الآراء والاستنتاجات الواردة في هذه الوثيقة هي آراء المؤلفين، ويجب أن لا تفسر على أنها تمثل السياسات الرسمية، سواء كانت صريحة أو ضمنية، وكالة مشاريع البحوث المتقدمة الدفاع والغذاء و “الدواء”، المعاهد الوطنية للصحة، أو الحكومة الأمريكية.
Materials
| Personal Protective Equipment | |||
| Hairnet | VWR | 89107-770 | |
| Tyvek lab coat | VWR | 13450-506 | |
| Extended cuff gloves | VWR | 89521-898 | |
| Equipment | |||
| Cutting mat | VWR | 102096-430 | |
| Tile cutter | McMaster-Carr | 26765A31 | |
| Mold-in-place (MIP) top molds | Protolabs, Inc. | custom | printed in Prototherm 12120 |
| Mold-in-place (MIP) bottom molds | Protolabs, Inc. | custom | printed in Prototherm 12121 |
| Duckbill curved forceps | VWR | 63041-864 | |
| Sharp tipped forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | |
| Metal spatula | VWR | 82027-528 | |
| Deep reactive ion etch (DRIE) pillar array wafers | Sensera, Inc. | custom | Four 50 x 50 mm pillar arrays per wafer; pillars 7 um wide, 50 um tall, spaced hexagonally 40 um apart |
| Textured polycarbonate .01” thick | McMaster-Carr | 85585K33 | cut to 45 mm square |
| PDMS blocks (40 x 40 x 5 mm) | n/a | custom | |
| Laminar flow hood | Germfree | BVBI | cast in-house |
| Air gun | |||
| 60°C level oven | |||
| Vacuum desiccator | |||
| Mass balance | accuracy to 0.1 g | ||
| Plasma machine | Diener | Nano | oxygen plasma capability is critical |
| Supplies | |||
| Sylgard 184 poly (dimethylsiloxane) (PDMS) base/curing agent kit | Ellsworth Adhesives | 4019862 | |
| Mixing cup | Ensure adequate ventilation when handling prepolymer due to low levels of ethylbenzene | ||
| 1 mL syringe | VWR | 10099-395 | |
| Cleanroom wipes | VWR | TWTX1080 | |
| 25 x 75 mm glass microscope slides | VWR | 48311-703 | |
| Packing tape | VWR | 500043-724 | |
| Scotch tape | VWR | 500026-873 | |
| Die-cut Polyurethane (PU) strips | Atlantic Gasket, Inc. | custom: AGWI2X3 | 1/8” thick; 60 Durometer Black Polyurethane; 2” x 3” |
| Polycarbonate film .005” thick | McMaster-Carr | 85585K102 | |
| 100 x 100 x 15 mm square gridded petri dishes | VWR | 60872-480 | |
| Aluminum foil | |||
| Optional Equipment | |||
| Thinky PDMS Mixer | Thinky | ARE-310 | |
| Mold-in place (MIP) jig | in-house | screw clamp compression jig | |
| Automated membrane fabricator (AMF) | in-house | pneumatic compression piston array with programmable heater |
References
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Benam, K. H., et al. Engineered In vitro Disease Models. Annual Review of Pathology Mechanisms of Disease. 10 (1), 195-262 (2015).
- Huh, D., et al. A Human Disease Model of Drug Toxicity-Induced Pulmonary Edema in a Lung-on-a-Chip Microdevice. Science Translational Medicine. 4 (159), 159ra147 (2012).
- Huh, D., et al. Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab on a Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).
- Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-Chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integrative Biology. 5 (9), 1130-1140 (2013).
- Kim, H. J., Li, H., Collins, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), E7-E15 (2016).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1 (5), s41551-017-0069–017 (2017).
- Somayaji, M. R., Das, D., Przekwas, A. Computational approaches for modeling and analysis of human-on-chip systems for drug testing and characterization. Drug Discovery Today. 21 (12), 1859-1862 (2016).
- Prantil-Baun, R., et al. Physiologically Based Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis Enabled by Microfluidically Linked Organs-on-Chips. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 58 (1), 37-64 (2018).
- Mahler, G. J., Esch, M. B., Stokol, T., Hickman, J. J., Shuler, M. L. Body-on-a-chip systems for animal-free toxicity testing. Alternatives to laboratory animals: ATLA. 44 (5), 469-478 (2016).
- Miller, P. G., Shuler, M. L. Design and demonstration of a pumpless 14 compartment microphysiological system. Biotechnology and Bioengineering. 113 (10), 2213-2227 (2016).
- Coppeta, J. R., et al. A portable and reconfigurable multi-organ platform for drug development with onboard microfluidic flow control. Lab Chip. 17 (1), 134-144 (2016).
- Wikswo, J. P., et al. Scaling and systems biology for integrating multiple organs-on-a-chip. Lab on a Chip. 13 (18), 3496-3511 (2013).
- Sung, J. H., et al. Using PBPK guided "Body-on-a-Chip" Systems to Predict Mammalian Response to Drug and Chemical Exposure. Experimental biology and medicine (Maywood, N.J.). 239 (9), 1225-1239 (2014).
- Stokes, C., Cirit, M., Lauffenburger, D. Physiome-on-a-Chip: The Challenge of "Scaling" in Design, Operation, and Translation of Microphysiological Systems. CPT: Pharmacometrics & Systems Pharmacology. 4 (10), 559-562 (2015).
- Shirure, V. S., George, S. C. Design considerations to minimize the impact of drug absorption in polymer-based organ-on-a-chip platforms. Lab Chip. , (2017).
- Huh, D., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nature Protocols. 8 (11), 2135-2157 (2013).
- Tran, T. T., et al. Exact kinetic analysis of passive transport across a polarized confluent MDCK cell monolayer modeled as a single barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 93 (8), 2108-2123 (2004).
- Henry, O. Y. F., et al. Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function. Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).
- Maoz, B. M., et al. Organs-on-Chips with combined multi-electrode array and transepithelial electrical resistance measurement capabilities. Lab on a Chip. 17 (13), 2294-2302 (2017).
- Benam, K. H., et al. Matched-Comparative Modeling of Normal and Diseased Human Airway Responses Using a Microengineered Breathing Lung Chip. Cell Systems. 3 (5), 456-466 (2016).
