Schaalbare fabricage van rekbare, Dual Channel, Microfluidic orgel Chips
Summary
Hier presenteren we een protocol dat beschrijft de fabricage van rekbare, dual channel, orgel chip microfluidic cel cultuur apparaten voor Recapitulerend orgel-niveau functionaliteit in vitro.
Abstract
Een aanzienlijk aantal loodverbindingen mislukken in de farmaceutische pijpleiding omdat dierproeven niet vaak te voorspellen klinische reacties in menselijke patiënten. Menselijke orgel-on-a-Chip (orgel Chip) microfluidic cel cultuur apparaten, waarmee een experimentele in vitro -platform voor de beoordeling van de werkzaamheid, toxiciteit en farmacokinetische (PK) profielen bij de mens, kunnen beter voorspellers van therapeutische werking en veiligheid in de kliniek ten opzichte van dierproeven. Deze apparaten kunnen worden gebruikt voor de functie van vrijwel elk orgaan type model en fluidically kunnen worden gekoppeld door middel van gemeenschappelijke endotheel omzoomde microchannels in vitro studies uitvoeren op menselijke fysiologie van de orgel- en hele lichaam-niveau zonder naar uitvoering van experimenten op mensen. Deze fiches orgel bestaat uit twee geperfundeerd microfluidic kanalen gescheiden door een permeabel elastomere membraan met orgel-specifieke parenchymal cellen aan de ene kant en de microvasculaire endotheel anderzijds, die worden cyclisch uitgerekt kan te verstrekken orgel-specifieke mechanische signalen (b.v. ademhaling bewegingen in Long). Dit protocol gegevens de fabricage van flexibele, dual channel, orgel Chips door gieten van delen met behulp van 3D afgedrukt mallen, inschakelen van de combinatie van meerdere gieten en post-processing stappen. Poreuze poly (dimethyl siloxaan) (PDMS) membranen zijn uitgebracht met micrometer formaat via-holes met behulp van silicium pijler arrays onder compressie. Fabricage en assemblage van orgel Chips omvat apparatuur en stappen die kunnen worden uitgevoerd buiten een traditionele cleanroom. Dit protocol biedt onderzoekers toegang tot orgel chiptechnologie voor in vitro orgel – en lichaam-level studies drugontdekking, de veiligheid en de werkzaamheid te testen, alsook mechanistisch onderzoek van fundamentele biologische processen.
Introduction
Hier beschrijven we de fabricage van dual-channel, gevacuoliseerd orgel-on-a-Chip (orgel Chip) microfluidic cultuur apparaten met behulp van een schaalbare protocol vatbaar voor gebruik door onderzoeksgroepen die geen toegang hebben tot cleanrooms en traditionele zachte lithografie hulpmiddelen. Deze apparaten zijn ontwikkeld om te recapituleren menselijke orgel-niveau functies voor begrip normale fysiologie van de ziekte, alsmede drug reacties in vitro1,2. Cruciaal belang voor engineering deze functionaliteit zijn twee geperfundeerd microfluidic kanalen gescheiden door een semi-permeabel membraan (Figuur 1). Dit ontwerp maakt recreatie van weefsel-weefsel interfaces tussen ten minste twee soorten weefsels, gewoonlijk orgel parenchymal cellen aan de ene kant van het poreuze membraan en vasculaire endotheel anderzijds, evenals hun blootstelling aan vloeistofstromen. Bovendien, omdat het elastomere polymeer, poly (dimethyl siloxaan) (PDMS), wordt gebruikt voor het fabriceren van het orgel Chip lichaam en membraan componenten, cyclische mechanische spanning kunnen worden toegepast op de gehele ontworpen weefsel-weefsel interface via de elastische membraan om na te bootsen de natuurlijke fysieke communicatie van levende organen, zoals de ademhaling van de bewegingen in de longen en de peristaltiek in de darm.
Figuur 1: dwarsdoorsnede van de orgel Chip. Orgel Chips bestaan uit twee kanalen, gescheiden door een poreuze, elastisch membraan dat kan worden ontpit met cellen aan beide zijden. Bovenste kanaal kruissecties zijn 1 mm x 1 mm hoog, onderkant breed kanaal Kruis secties zijn 1 mm breed x 0,2 mm hoog en vacuüm kanalen in beide en onderste delen zijn 0.3 mm breed, 0,5 mm hoog, en spaced 0.3 mm van de fluidic kanalen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Deze rekbare, dual channel, orgel Chips zijn gebruikt voor het aantonen van de invloed van ademhaling van motion op nanoparticle absorptie in de Long- en drug-geïnduceerde longoedeem3,4; effecten van de peristaltische beweging op differentiatie5 en bacteriële overgroei in de darm5,6,7; en invloed van cyclische vervormingen als gevolg van de pulsatie van het hart over differentiatie en rijping van glomerulaire podocytes in de nier8. Bovendien, in het geval van deze twee-lumen-apparaten die een vasculaire endotheel omzoomde-kanaal gescheiden door een extracellulaire matrix (ECM bevatten)-gecoate membraan van parenchymal cellen binnen een afzonderlijk toegankelijk kanaal zijn geschikt voor de karakterisatie van drug PK parameters en nieuwe ontdekking van de doelgroep, die heeft is beperkt in één perfusie channel-systemen. Bovendien meerdere orgel Chips kunnen aan elkaar worden gekoppeld via hun vasculaire kanalen effectief maken een menselijk lichaam-op-chips, die zou kunnen een aantrekkelijke menselijke in vitro -platform voor therapeutiek ontwikkeling9bieden, 10. In tegenstelling tot de meeste micro-fysiologische systemen (MPS)11,12,13bevatten de orgel-Chips twee microfluidic kanalen gescheiden door een poreuze membraan dat vasculaire-parenchymal interacties te vergemakkelijkt in vivo orgaanfunctie recapituleren. Dit vereenvoudigt niet alleen het koppelen van verschillende organen samen zoogdierlevercellen een gemeenschappelijk medium via de vasculaire kanalen, maar de compartimentering van de weefsels en vloeistoffen bootst in vivo functies en ondersteunt farmacokinetische experimenten en modelleren en in vitro–in vivo extrapolatie9,10 , dat is moeilijk of onmogelijk is in één kanaal MPS14,15,16. De populariteit van PDMS in microfluidic apparaten heeft geleid tot de ontwikkeling van instrumenten om te overwinnen de inherente vermogen van het materiaal om het absorberen van kleine molecules10,17. Echter noodzaakt het grote aantal chips vereist ter ondersteuning van biologische studies waar het gebruik van microbiële agentia en PDMS-absorberende stoffen maken hergebruik orgel Chips moeilijk een schaalbare productieproces zelfs voor kleine onderzoeksgroepen. Het protocol beschreven hier presenteert een methode voor het apparaat fabrikatie geschikt voor het gebruik in academische laboratoria, met inbegrip van die geen toegang hebben tot cleanrooms en zachte lithografie. Dit protocol is gericht op het verruimen van de toegang tot orgel Chips door een breed scala aan onderzoekers willen de rekbare, dual channel-apparaten gebruiken voor het verkennen van elementaire biologische processen, alsmede translationeel therapeutische ontwikkeling.
Leveraging best practices van micromanufacturing-velden gekoppeld met ontwerpen voor productie, werd een robuuste aanpak ontwikkeld voor het fabriceren van orgel Chip apparaten in grote hoeveelheden met hoge reproduceerbaarheid en rendement. Het hier beschreven fabricage-protocol biedt een schaalbare methode voor orgel Chip productie. We beschrijven het gebruik van een optionele schimmel-in-Place Jig (MiP; ontwerpdetails in Aanvullende materialen) in combinatie met polyurethaan pakking strips om schaalvergroting van het PDMS onderdelen gieten. De glanzende zijde van polyurethaan strips produceren optisch glad PDMS delen terwijl de gestructureerde kant demolding vergemakkelijkt. Ook beschrijven we het gebruik van een optionele geautomatiseerde membraan Fabricator (AMF) waarmee tijdens het genezen van membraan wafer mallen uniforme gecomprimeerd voor het fabriceren van maximaal 24 membranen per batch. Het ontwerp is breed toepasbare voor studies van organen die zijn samengesteld uit weefsels die ondervinden van mechanische spanning en perfusie, en deze chips kunnen worden geproduceerd met lage chip-op-Spaander variabiliteit in moet voldoen aan de behoeften van kleine en grote hoeveelheden onderzoeksgroepen gelijk. De werkstroom is vatbaar voor een batch- of assemblagelijn indeling en gemakkelijk compatibel is met kwaliteit beoordeling protocollen voor controle van productieprocessen, opleiding van personeel en responsieve probleemoplossing. Wij hopen dat dit protocol toegang uit te tot de mogelijkheden van dual-channel, rekbare, orgel Chips voor fundamenteel en translationeel onderzoek breiden zal.
Protocol
Representative Results
Discussion
De productie-procédé berust op hoge resolutie 3D gedrukte mallen naar het patroon van de PDMS boven- en onderkant orgel Chip lichaam componenten in combinatie met micromolded poreuze PDMS membranen. Deze kritische benadering werd geselecteerd moeten verlichten van prototyping gecombineerd met de snelle overgang naar schaal van fabricage en vervanging van tooling. De bovenste component mallen zijn bedoeld om patroon havens in exacte locaties met gedefinieerde verticale profielen tijdens het gieten stap. Dit vermijdt nie…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken M. Rousseau en S. Kroll voor hulp met fotografie en videografie en M. Ingram, J. Nguyen, D. Shea en N. Wen voor bijdrage aan initiële fabricage protocol ontwikkeling. Dit onderzoek werd gesponsord door het Instituut Wyss voor biologisch geïnspireerde Engineering aan de Harvard University en het Defense Advanced Research Projects Agency onder coöperatieve overeenkomsten #W911NF-12-2-0036 en #W911NF-16-C-0050, en FDA verlenen # HHSF223201310079C, NIH verleent #R01-EB020004 en #UG3-HL141797-01 en Bill en Melinda Gates Foundation verleent #OPP1163237 en #OPP1173198 DEI. De standpunten en conclusies in dit document zijn die van de auteurs en moet niet worden geïnterpreteerd als het vertegenwoordigen van het officiële beleid, hetzij expliciet of impliciet, van de Defense Advanced Research Projects Agency, Food en Drug Administration, de National Institutes of Health, of de Amerikaanse regering.
Materials
| Personal Protective Equipment | |||
| Hairnet | VWR | 89107-770 | |
| Tyvek lab coat | VWR | 13450-506 | |
| Extended cuff gloves | VWR | 89521-898 | |
| Equipment | |||
| Cutting mat | VWR | 102096-430 | |
| Tile cutter | McMaster-Carr | 26765A31 | |
| Mold-in-place (MIP) top molds | Protolabs, Inc. | custom | printed in Prototherm 12120 |
| Mold-in-place (MIP) bottom molds | Protolabs, Inc. | custom | printed in Prototherm 12121 |
| Duckbill curved forceps | VWR | 63041-864 | |
| Sharp tipped forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | |
| Metal spatula | VWR | 82027-528 | |
| Deep reactive ion etch (DRIE) pillar array wafers | Sensera, Inc. | custom | Four 50 x 50 mm pillar arrays per wafer; pillars 7 um wide, 50 um tall, spaced hexagonally 40 um apart |
| Textured polycarbonate .01” thick | McMaster-Carr | 85585K33 | cut to 45 mm square |
| PDMS blocks (40 x 40 x 5 mm) | n/a | custom | |
| Laminar flow hood | Germfree | BVBI | cast in-house |
| Air gun | |||
| 60°C level oven | |||
| Vacuum desiccator | |||
| Mass balance | accuracy to 0.1 g | ||
| Plasma machine | Diener | Nano | oxygen plasma capability is critical |
| Supplies | |||
| Sylgard 184 poly (dimethylsiloxane) (PDMS) base/curing agent kit | Ellsworth Adhesives | 4019862 | |
| Mixing cup | Ensure adequate ventilation when handling prepolymer due to low levels of ethylbenzene | ||
| 1 mL syringe | VWR | 10099-395 | |
| Cleanroom wipes | VWR | TWTX1080 | |
| 25 x 75 mm glass microscope slides | VWR | 48311-703 | |
| Packing tape | VWR | 500043-724 | |
| Scotch tape | VWR | 500026-873 | |
| Die-cut Polyurethane (PU) strips | Atlantic Gasket, Inc. | custom: AGWI2X3 | 1/8” thick; 60 Durometer Black Polyurethane; 2” x 3” |
| Polycarbonate film .005” thick | McMaster-Carr | 85585K102 | |
| 100 x 100 x 15 mm square gridded petri dishes | VWR | 60872-480 | |
| Aluminum foil | |||
| Optional Equipment | |||
| Thinky PDMS Mixer | Thinky | ARE-310 | |
| Mold-in place (MIP) jig | in-house | screw clamp compression jig | |
| Automated membrane fabricator (AMF) | in-house | pneumatic compression piston array with programmable heater |
References
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Benam, K. H., et al. Engineered In vitro Disease Models. Annual Review of Pathology Mechanisms of Disease. 10 (1), 195-262 (2015).
- Huh, D., et al. A Human Disease Model of Drug Toxicity-Induced Pulmonary Edema in a Lung-on-a-Chip Microdevice. Science Translational Medicine. 4 (159), 159ra147 (2012).
- Huh, D., et al. Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab on a Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).
- Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-Chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integrative Biology. 5 (9), 1130-1140 (2013).
- Kim, H. J., Li, H., Collins, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), E7-E15 (2016).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1 (5), s41551-017-0069–017 (2017).
- Somayaji, M. R., Das, D., Przekwas, A. Computational approaches for modeling and analysis of human-on-chip systems for drug testing and characterization. Drug Discovery Today. 21 (12), 1859-1862 (2016).
- Prantil-Baun, R., et al. Physiologically Based Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis Enabled by Microfluidically Linked Organs-on-Chips. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 58 (1), 37-64 (2018).
- Mahler, G. J., Esch, M. B., Stokol, T., Hickman, J. J., Shuler, M. L. Body-on-a-chip systems for animal-free toxicity testing. Alternatives to laboratory animals: ATLA. 44 (5), 469-478 (2016).
- Miller, P. G., Shuler, M. L. Design and demonstration of a pumpless 14 compartment microphysiological system. Biotechnology and Bioengineering. 113 (10), 2213-2227 (2016).
- Coppeta, J. R., et al. A portable and reconfigurable multi-organ platform for drug development with onboard microfluidic flow control. Lab Chip. 17 (1), 134-144 (2016).
- Wikswo, J. P., et al. Scaling and systems biology for integrating multiple organs-on-a-chip. Lab on a Chip. 13 (18), 3496-3511 (2013).
- Sung, J. H., et al. Using PBPK guided "Body-on-a-Chip" Systems to Predict Mammalian Response to Drug and Chemical Exposure. Experimental biology and medicine (Maywood, N.J.). 239 (9), 1225-1239 (2014).
- Stokes, C., Cirit, M., Lauffenburger, D. Physiome-on-a-Chip: The Challenge of "Scaling" in Design, Operation, and Translation of Microphysiological Systems. CPT: Pharmacometrics & Systems Pharmacology. 4 (10), 559-562 (2015).
- Shirure, V. S., George, S. C. Design considerations to minimize the impact of drug absorption in polymer-based organ-on-a-chip platforms. Lab Chip. , (2017).
- Huh, D., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nature Protocols. 8 (11), 2135-2157 (2013).
- Tran, T. T., et al. Exact kinetic analysis of passive transport across a polarized confluent MDCK cell monolayer modeled as a single barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 93 (8), 2108-2123 (2004).
- Henry, O. Y. F., et al. Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function. Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).
- Maoz, B. M., et al. Organs-on-Chips with combined multi-electrode array and transepithelial electrical resistance measurement capabilities. Lab on a Chip. 17 (13), 2294-2302 (2017).
- Benam, K. H., et al. Matched-Comparative Modeling of Normal and Diseased Human Airway Responses Using a Microengineered Breathing Lung Chip. Cell Systems. 3 (5), 456-466 (2016).
