ייצור מדרגי של הערוץ מתיחה, כפול, צ'יפס Microfluidic איברים
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול המתאר את ייצור של הערוץ מתיחה, כפול, איברים שבב microfluidic תא תרבות מכשירי recapitulating איברים ברמת פונקציונליות בתוך חוץ גופית.
Abstract
מספר משמעותי של תרכובות עופרת להיכשל בצבר התרופות כי מחקרים שנעשו בבעלי חיים לעיתים קרובות אינם מצליחים לחזות תגובות קליניים בחולים אנושיים. האדם איברים-על-שבב (צ’יפ איברים) microfluidic תא תרבות התקנים, המספקים פלטפורמה ניסיוני במבחנה כדי להעריך את היעילות, רעילות, פרופילים פרמקוקינטיקה ופרמקודינמיקה (PK) אצל בני אדם, עשויים להיות גורמים מנבאים טוב יותר של יעילות טיפולית, בטיחות במרפאה לעומת מחקרים שנעשו בבעלי חיים. התקנים אלה עשויים לשמש מודל הפונקציה של כמעט כל סוג האיבר והוא יכול להיות מקושר fluidically דרך נפוצה microchannels מצופה אנדותל לביצוע מחקרים במבחנה על הפיזיולוגיה של איברים וברמת כל הגוף ברמת בני ללא צורך לערוך ניסויים על אנשים. האסימונים איבר מורכב בשני ערוצים perfused microfluidic מופרדים באמצעות קרום חדיר אלסטומריים עם תאים parenchymal ייחודיים בצד אחד, אנדותל microvascular מצד שני, אשר יכול להיות מתח המזמורים לספק איבר ספציפי מכני רמזים (למשל, נשימה תנועות בריאה). פרוטוקול זה פרטים הזיוף של הערוץ גמיש, כפול, צ’יפס איברים דרך הליהוק של חלקים באמצעות 3D מודפס בתבניות, המאפשרת שילוב של מספר הליהוק ועיבוד פוסט-שלבים. פוליפוני נקבובי (דימתיל siloxane) ממברנות (PDMS) מושלך עם מיקרומטר בגודל דרך הפתחים באמצעות סיליקון מערכים עמוד תחת דחיסה. ייצור והרכבה של איברים שבבי כרוך ציוד שלבים אשר ניתן ליישם מחוץ חדר נקי מסורתיים. פרוטוקול זה מספק חוקרים עם גישה טכנולוגיית השבבים איברים במבחנה איברים, גוף-ברמת לימודי גילוי תרופות, בטיחות, יעילות הבדיקה, כמו גם מחקרים מכניסטית של התהליכים הביולוגיים הבסיסיים.
Introduction
כאן, אנו מתארים הזיוף של ערוץ כפול, vascularized איברים-על-שבב (צ’יפ איברים) microfluidic תרבות התקנים באמצעות פרוטוקול מדרגי קלה לשימוש על ידי קבוצות מחקר חסר גישה cleanrooms וכלים מסורתיים ליתוגרפיה רך. התקנים אלה פותחו כדי לסכם את התפקודים האנושיים איברים ברמת ההבנה רגיל פיזיולוגיה של המחלה, כמו גם סמים תגובות במבחנה1,2. פונקציונליות זו קריטית הנדסה הם שני ערוצים perfused microfluidic מופרדים באמצעות קרום חדיר למחצה (איור 1). עיצוב זה מאפשר בילוי של רקמות רקמות ממשקים בין לפחות שני סוגים של רקמות, בדרך כלל איברים תאים parenchymal בצד אחד של קרום נקבובי, אנדותל כלי הדם מאידך, כמו גם את חשיפתם זרימת נוזלים. בנוסף, כי הפולימר אלסטומריים פוליפוני (דימתיל siloxane) (PDMS), משמשת כדי להמציא שבב איבר הגוף ואת קרום רכיבים, מאמץ מכני מחזורית שניתן להחיל על כל מהונדסים רקמות רקמות ממשק דרך הגומי ממברנה לחקות את microenvironment הפיזי הטבעי של איברים חיים, כמו נשימה בריאה ותנועות הפריסטלטיקה במעי.
איור 1: שבב איברים לעבור סעיף- צ’יפס איבר מורכב בשני ערוצים מופרדים באמצעות קרום נקבובי, אלסטי זה יכול להיות נזרע עם תאים משני הצדדים. הערוץ העליון הם חתכי רוחב רחב x תחתון גבוה, 1 מ 1 מ”מ ערוץ הצלב שמקטעים הם 1 מ”מ x 0.2 מ מ גבוה, ואקום וערוצי בשני חלקים התחתון הן 0.3 מ מ רחב, 0.5 מ מ גבוה, מרווח 0.3 מ מ הערוצים fluidic. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
אלה ערוץ מתיחה, כפול, צ’יפס איברים שימשו הממחיש את ההשפעה של נשימה תנועה על ספיגת ננו-חלקיק ריאות, בצקת ריאות שיכרון3,4; ההשפעות של ממברנות תנועה על בידול5 ו מוגבר ב-6,‘ המעי5,‘7; ואת ההשפעה של העיוותים מחזורית עקב pulsation הלב על בידול התבגרותם של podocytes glomerular הכליה8. בנוסף, לומן שני התקנים אלה המכילים מצופה אנדותל כלי הדם ערוץ המופרדים של מטריצה חוץ-תאית (ECM)-מצופה קרום תאים parenchymal בתוך ערוץ בנפרד נגיש מתאימים היטב אפיון של סמים PK הפרמטרים ואת גילוי יעד חדש, אשר הגביל ב זלוף יחיד ערוץ מערכות. יתר על כן, שבבי איברים מרובים עשויים להיות מקושרים זה לזה באמצעות ערוצי כלי הדם שלהם ליצירת ביעילות של האדם גוף-על-צ’יפס, אשר יכול להציע פלטפורמה מושכת אנושיים במבחנה הרפוי פיתוח9, 10. בניגוד ביותר מיקרו-פיזיולוגיים מערכות (MPS)11,12,13, האסימונים איברים מכילים שני ערוצים microfluidic מופרדים באמצעות קרום נקבובי המקל על כלי הדם parenchymal אינטראקציות כדי מסכם את הדברים ויוו תפקוד האיבר. זה לא רק מפשט את הקישור של איברים שונים ביחד על ידי פרפוזיה מדיום משותף דרך הערוצים כלי הדם, אבל מידור של רקמות ונוזלים מחקה ויוו פונקציות ותומך ניסויים פרמוקוקינטיים ו מידול כמו גם במבחנה–ויוו אקסטרפולציה9,10 כי קשה או בלתי אפשרי בכל אחד מהערוצים MPS14,15,16. הפופולריות של PDMS במכשירים microfluidic הוביל לפיתוח כלים להתגבר על יכולת מובנית של החומר כדי לספוג את מולקולות קטנות10,17. עם זאת, מספרם של שבבי הנדרשים כדי לתמוך במחקרים ביולוגיים שבו השימוש סוכנים חיידקים ותרכובות קליטת PDMS לעשות שימוש חוזר של איברים שבבי קשה מחייבת תהליך ייצור מדרגי גם עבור קבוצות מחקר קטן. הפרוטוקול המתואר כאן מציג שיטת הזיוף המכשיר מתאים לשימוש במעבדות אקדמית, כולל אלה חסר גישה cleanrooms, הדפס אבן רכה. פרוטוקול זה שואפת להרחיב את הגישה שבבי איברים על ידי מגוון רחב של חוקרים המבקשים להשתמש המכשירים מתיחה, ערוץ כפול עבור חקר תהליכים ביולוגיים בסיסיים, כמו גם פיתוח טיפולית translational.
מינוף מומלצות משדות micromanufacturing בשילוב עם עיצוב ייצור, בגישה חזקים פותחה עבור בדיית איברים שבב מכשירים בכמויות גדולות עם הפארמצבטית גבוהה ועם תשואה. פרוטוקול פבריקציה נוספת המתוארים כאן מספק שיטה מדרגי לייצור השבב איברים. אנו מתארים את השימוש אופציונלי עובש-in-Place יג (MiP; פרטי העיצוב בתוספת חומרים) בשילוב עם רצועות פוליאוריתן אטם כדי לאפשר אולם שינוי קנה המידה של השלכת PDMS רכיבים. הצד מבריק של רצועות פוליאוריתן לייצור חלקים PDMS שטיחות חלקה ואילו הצד עם מרקם מקלה על demolding. אנו מתארים גם את השימוש של אופציונלי אוטומטית ממברנה מפברק (אלירן לגזיאל) מספק דחיסה אחידה של קרום וופל בתבניות במהלך ריפוי בדיית עד 24 ממברנות לכל אצווה. העיצוב הוא ישים באופן כללי עבור מחקרים של איברים מורכבים של רקמות להיתקל מאמץ מכני זלוף, הצ’יפס הזה, יכול להיות מיוצר עם השתנות צ’יפ לצ’יפס-נמוכה בכמויות הנדרשות כדי לענות על הצרכים של קטנים וגדולים קבוצות מחקר כאחד. זרימת העבודה היא נוטה תבנית אצווה או קו הרכבה, ברצון תואם עם איכות הערכת פרוטוקולים לשליטה של תהליכי הייצור, אנשי הדרכה, ופתרון מגיבים. אנו מקווים כי פרוטוקול זה יתרחב גישה ליכולות של ערוץ כפול, מתיחה, שבבי איברים למחקר בסיסי והתרגום.
Protocol
Representative Results
Discussion
תהליך ייצור מסתמך על תבניות מודפסות תלת-ממד ברזולוציה גבוהה לתבנית PDMS העליון והתחתון שבב איבר גוף המרכיבים יחד עם ממברנות PDMS נקבובי micromolded. גישה ביקורתית זו נבחר בשל נוחות של שטנץ בשילוב עם המעבר מהיר לתוך המשנה את גודלו את ייצור והחלפה של אבזור. התבניות הרכיב העליון מיועדים ליציאות דפוס ב…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים רוסו מ ו ס קרול לעזרה עם צילום, צילום וידאו, מסיה אינגרם, ג’יי נגוין, שיאה ד ש ון תרומתו פיתוח פרוטוקול ייצור ראשוני. מחקר זה היה בחסות מכון Wyss ביולוגית בהשראת הנדסה באוניברסיטת הרווארד, את ההגנה מתקדם הסוכנות למחקרי תחת הסכמי שיתופי #W911NF-12-2-0036 ו- #W911NF-16-C-0050 ולהעניק ה-FDA # HHSF223201310079C, NIH מעניקה #R01-EB020004 ו- #UG3-HL141797-01, ביל ומלינדה גייטס מעניקה #OPP1163237 ו- #OPP1173198 DEI. מנופים ומסקנות הכלולים במסמך זה הם אלה של המחברים, אין לפרש כמייצג את המדיניות הרשמית, גם בין מפורשת ובין משתמעת, של הסוכנות האמריקאית לפרויקטי מחקר מתקדמים ההגנה, המזון והתרופות האמריקאי, המכונים הלאומיים לבריאות, או ממשלת ארה ב.
Materials
| Personal Protective Equipment | |||
| Hairnet | VWR | 89107-770 | |
| Tyvek lab coat | VWR | 13450-506 | |
| Extended cuff gloves | VWR | 89521-898 | |
| Equipment | |||
| Cutting mat | VWR | 102096-430 | |
| Tile cutter | McMaster-Carr | 26765A31 | |
| Mold-in-place (MIP) top molds | Protolabs, Inc. | custom | printed in Prototherm 12120 |
| Mold-in-place (MIP) bottom molds | Protolabs, Inc. | custom | printed in Prototherm 12121 |
| Duckbill curved forceps | VWR | 63041-864 | |
| Sharp tipped forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | |
| Metal spatula | VWR | 82027-528 | |
| Deep reactive ion etch (DRIE) pillar array wafers | Sensera, Inc. | custom | Four 50 x 50 mm pillar arrays per wafer; pillars 7 um wide, 50 um tall, spaced hexagonally 40 um apart |
| Textured polycarbonate .01” thick | McMaster-Carr | 85585K33 | cut to 45 mm square |
| PDMS blocks (40 x 40 x 5 mm) | n/a | custom | |
| Laminar flow hood | Germfree | BVBI | cast in-house |
| Air gun | |||
| 60°C level oven | |||
| Vacuum desiccator | |||
| Mass balance | accuracy to 0.1 g | ||
| Plasma machine | Diener | Nano | oxygen plasma capability is critical |
| Supplies | |||
| Sylgard 184 poly (dimethylsiloxane) (PDMS) base/curing agent kit | Ellsworth Adhesives | 4019862 | |
| Mixing cup | Ensure adequate ventilation when handling prepolymer due to low levels of ethylbenzene | ||
| 1 mL syringe | VWR | 10099-395 | |
| Cleanroom wipes | VWR | TWTX1080 | |
| 25 x 75 mm glass microscope slides | VWR | 48311-703 | |
| Packing tape | VWR | 500043-724 | |
| Scotch tape | VWR | 500026-873 | |
| Die-cut Polyurethane (PU) strips | Atlantic Gasket, Inc. | custom: AGWI2X3 | 1/8” thick; 60 Durometer Black Polyurethane; 2” x 3” |
| Polycarbonate film .005” thick | McMaster-Carr | 85585K102 | |
| 100 x 100 x 15 mm square gridded petri dishes | VWR | 60872-480 | |
| Aluminum foil | |||
| Optional Equipment | |||
| Thinky PDMS Mixer | Thinky | ARE-310 | |
| Mold-in place (MIP) jig | in-house | screw clamp compression jig | |
| Automated membrane fabricator (AMF) | in-house | pneumatic compression piston array with programmable heater |
References
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Benam, K. H., et al. Engineered In vitro Disease Models. Annual Review of Pathology Mechanisms of Disease. 10 (1), 195-262 (2015).
- Huh, D., et al. A Human Disease Model of Drug Toxicity-Induced Pulmonary Edema in a Lung-on-a-Chip Microdevice. Science Translational Medicine. 4 (159), 159ra147 (2012).
- Huh, D., et al. Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab on a Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).
- Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-Chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integrative Biology. 5 (9), 1130-1140 (2013).
- Kim, H. J., Li, H., Collins, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), E7-E15 (2016).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1 (5), s41551-017-0069–017 (2017).
- Somayaji, M. R., Das, D., Przekwas, A. Computational approaches for modeling and analysis of human-on-chip systems for drug testing and characterization. Drug Discovery Today. 21 (12), 1859-1862 (2016).
- Prantil-Baun, R., et al. Physiologically Based Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis Enabled by Microfluidically Linked Organs-on-Chips. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 58 (1), 37-64 (2018).
- Mahler, G. J., Esch, M. B., Stokol, T., Hickman, J. J., Shuler, M. L. Body-on-a-chip systems for animal-free toxicity testing. Alternatives to laboratory animals: ATLA. 44 (5), 469-478 (2016).
- Miller, P. G., Shuler, M. L. Design and demonstration of a pumpless 14 compartment microphysiological system. Biotechnology and Bioengineering. 113 (10), 2213-2227 (2016).
- Coppeta, J. R., et al. A portable and reconfigurable multi-organ platform for drug development with onboard microfluidic flow control. Lab Chip. 17 (1), 134-144 (2016).
- Wikswo, J. P., et al. Scaling and systems biology for integrating multiple organs-on-a-chip. Lab on a Chip. 13 (18), 3496-3511 (2013).
- Sung, J. H., et al. Using PBPK guided "Body-on-a-Chip" Systems to Predict Mammalian Response to Drug and Chemical Exposure. Experimental biology and medicine (Maywood, N.J.). 239 (9), 1225-1239 (2014).
- Stokes, C., Cirit, M., Lauffenburger, D. Physiome-on-a-Chip: The Challenge of "Scaling" in Design, Operation, and Translation of Microphysiological Systems. CPT: Pharmacometrics & Systems Pharmacology. 4 (10), 559-562 (2015).
- Shirure, V. S., George, S. C. Design considerations to minimize the impact of drug absorption in polymer-based organ-on-a-chip platforms. Lab Chip. , (2017).
- Huh, D., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nature Protocols. 8 (11), 2135-2157 (2013).
- Tran, T. T., et al. Exact kinetic analysis of passive transport across a polarized confluent MDCK cell monolayer modeled as a single barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 93 (8), 2108-2123 (2004).
- Henry, O. Y. F., et al. Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function. Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).
- Maoz, B. M., et al. Organs-on-Chips with combined multi-electrode array and transepithelial electrical resistance measurement capabilities. Lab on a Chip. 17 (13), 2294-2302 (2017).
- Benam, K. H., et al. Matched-Comparative Modeling of Normal and Diseased Human Airway Responses Using a Microengineered Breathing Lung Chip. Cell Systems. 3 (5), 456-466 (2016).
