Skalbar tillverkning av töjbart, Dual Channel, ultrakalla orgel Chips
Summary
Här presenterar vi ett protokoll som beskriver tillverkning av töjbart, dual channel, orgel chip mikroflödessystem cell kultur enheter för går igenom orgel-nivå funktionalitet in vitro.
Abstract
Ett betydande antal blyföreningar misslyckas i farmaceutiska rörledningen eftersom djurstudier misslyckas ofta med att förutsäga kliniska Svaren hos patienter. Mänskliga Organ-på-ett-Chip (orgel Chip) mikroflödessystem cell kultur enheter, vilket ger en experimentell in vitro- plattform för att utvärdera effekt, toxicitet och farmakokinetiska (PK) profiler hos människor, kan vara bättre prediktorer för terapeutisk effekt och säkerhet i kliniken jämfört med djurstudier. Dessa enheter kan användas för att modellera funktionen av praktiskt taget alla organ typ och fluidically kan kopplas via gemensamma endotel-fodrade mikrokanaler att utföra in vitro- studier på humanfysiologi orgel- och hela kroppen-nivå utan att behöva genomföra experiment på människor. Dessa Organ marker består av två perfunderade mikroflödessystem kanaler åtskilda av en genomsläpplig elastomeriska membran med organ-specifika parenkymal celler på ena sidan och mikrovaskulära endotel å andra sidan, som kan sträckas cykliskt att tillhandahålla organ-specifika mekaniska signaler (t.ex. andas rörelser i lungan). Detta protokoll Detaljer tillverkning av flexibla, dual channel, orgel marker genom gjutning av delar med hjälp av 3D tryckta formar, möjliggör kombinationen av flera gjutning och efterbehandling steg. Porösa poly (dimetyl siloxan) (PDMS) membran är gjutna med mikrometer storlek genomgångshål använda silicon pelaren matriser under komprimering. Tillverkning och montering av orgel Chips innebär utrustning och åtgärder som kan genomföras utanför en traditionell renrum. Detta protokoll ger forskare med tillgång till Organ Chip teknik för in vitro- orgel – och kropp-nivå studier i läkemedelsutveckling, säkerhet och effekt, samt mekanistiska studier av grundläggande biologiska processer.
Introduction
Här beskriver vi tillverkning av dubbla kanaler, simblåsa Organ-på-ett-Chip (orgel Chip) mikroflödessystem kultur enheter använder en skalbar protokoll som är mottaglig för användning av forskargrupper som saknar tillgång till renrum och traditionella mjuka litografi verktyg. Dessa enheter har utvecklats för att sammanfatta människans organ-nivå funktioner för förståelse normal och sjukdom fysiologi, samt drog Svaren in vitro-1,2. Avgörande för att iscensätta denna funktionalitet är två perfunderade mikroflödessystem kanaler åtskilda av ett halvgenomträngligt membran (figur 1). Denna konstruktion möjliggör rekreation av vävnad-vävnad gränssnitten mellan minst två typer av vävnader, vanligtvis orgel parenkymal celler på ena sidan av porösa membranet och vaskulära endotel å den andra, samt deras exponering för vätskeflöde. Dessutom, eftersom elastomeriska polymeren, poly (dimetyl siloxan) (PDMS), används för att tillverka Organ Chip kroppen och membran komponenter, cykliska mekaniska belastningen kan tillämpas på hela konstruerad vävnad-vävnad gränssnitt via elastiskt membran för att efterlikna den naturliga fysiska närmiljön av levande organ, såsom andning rörelser i lungan och peristaltik i tarmen.
Figur 1: Organ Chip tvärsnitt. Orgel marker består av två kanaler åtskilda av ett poröst, elastiskt membran som kan dirigeras med celler på båda sidor. Övre kanal tvärsnitt är 1 mm bred x 1 mm hög, botten kanal cross sektioner är 1 mm bred x 0,2 mm hög och vakuum kanaler i båda och nedre delar är 0,3 mm bred, 0,5 mm höga och radavstånd 0,3 mm från fluidic kanaler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Dessa töjbart, dual channel, orgel marker har använts för att demonstrera effekten av andas rörelse på nanopartiklar absorption i lunga och läkemedelsinducerad lungödem3,4. effekter av peristaltiska rörelser på differentiering5 och bakteriell överväxt i tarmen5,6,7; och påverkan av cykliska deformationer på grund av pulsering av hjärtat på differentiering och mognad av glomerulär podocytes i njuren8. Dessutom, dessa två-lumen enheter som innehåller en endotel-fodrade vaskulär kanal åtskilda av en extracellulär matrix (ECM)-belagda membran från parenkymal celler inom en separat tillgänglig kanal är väl lämpade för karakterisering av drogen PK parametrar och ny läkemedelsutveckling, som har begränsats i enda perfusion kanal system. Dessutom flera Organ marker kan kopplas ihop via sin vaskulära kanaler att effektivt skapa en mänsklig kropp-på-chips, som kunde erbjuda en attraktiv människa in vitro- plattform för therapeutics utveckling9, 10. Till skillnad från mest mikro-fysiologiska system (MPS)11,12,13innehåller orgel marker två mikroflödessystem kanaler avgränsade med ett poröst membran som underlättar vaskulär-parenkymal interaktioner till sammanfatta i vivo organfunktion. Detta förenklar inte bara sammankoppling av olika organ grupp av startas ett vanligt medium genom vaskulära kanaler, men uppdelning i vävnad och kroppsvätskor härmar i vivo funktioner och stöder farmakokinetiska experiment och modellering samt i vitro–i vivo extrapolering9,10 , det är svårt eller omöjligt i enda kanal MPS14,15,16. Populariteten av PDMS i ultrakalla enheter har lett till utvecklingen av verktyg att övervinna materialets inneboende förmåga att absorbera små molekyler10,17. Det stora antalet marker som krävs för att stödja biologiska studier där användningen av antimikrobiella agens och PDMS-absorberande föreningar göra återanvända orgel marker svårt nödvändiggör dock en skalbar tillverkningsprocess även för små forskargrupper. Protokollet beskrivs här presenterar en metod för enheten tillverkning lämplig för användning i akademiska laboratorier, inklusive de som saknar tillgång till renrum och mjuk litografi. Detta protokoll syftar till att bredda tillgången till orgel marker av en rad forskare som försöker använda de töjbara, dubbla kanaler enheterna för att utforska grundläggande biologiska processer samt translationell terapeutisk utveckling.
Att utnyttja bästa praxis från mikrotillverkning fält tillsammans med design för tillverkning, utvecklades en robust metod för fabricera Organ Chip enheter i stora mängder med hög reproducerbarhet och avkastning. Det fabrication-protokollet som beskrivs här ger en skalbar metod för Organ Chip produktion. Vi beskriver användningen av en valfri mögel-in-Place jigg (MiP; designdetaljer i Kompletterande material) tillsammans med polyuretan packning remsor att aktivera upptrappningen av gjutning PDMS komponenter. Den blanka sidan av polyuretan remsor producera optiskt smidig PDMS delar medan den strukturerade sidan underlättar demolding. Vi beskriver också användningen av en valfri automatiserad membran Fabricator (AMF) som erbjuder enhetlig komprimering av membran wafer formar härdning för att fabricera upp till 24 membran per batch. Designen är i stort sett tillämpliga för studier av organ som består av vävnader som uppleva mekaniska påfrestningar och perfusion, och dessa marker kan produceras med låg chip-till-chip variabilitet i kvantiteter som krävs för att uppfylla behoven hos små och stora forskargrupper både. Arbetsflödet är mottagliga för en batch eller monteringslinje format och lätt kompatibel med kvalitet bedömning protokoll för kontroll av produktionsprocesser, personalutbildning och lyhörd felsökning. Vi hoppas att detta protokoll kommer att expandera åtkomst till funktionerna i dubbla kanaler, töjbart, orgel marker för grundläggande och translationell forskning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tillverkningsprocessen är beroende av högupplösta 3D tryckta formar till mönster PDMS övre och nedre Organ Chip kropp komponenterna tillsammans med micromolded porösa PDMS membran. Detta kritiskt förhållningssätt valdes på grund av användarvänlighet prototyping kombinerat med snabb övergång till skalas upp tillverkning och byte av verktyg. Översta komponenten formarna är utformade för att mönstret hamnar i exakta platser med definierade vertikala profiler under gjutning steg. Detta inte bara undviker ar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar M. Rousseau och S. Kroll för hjälp med fotografering och videography och M. Ingram, J. Nguyen, D. Shea och N. Wen för bidrag till inledande tillverkning protokoll utveckling. Denna forskning sponsrades av Wyss Institutet för biologiskt inspirerade Engineering vid Harvard University och den Defense Advanced Research Projects Agency under kooperativa avtal nr W911NF-12-2-0036 och #W911NF-16-C-0050, och FDA beviljar # HHSF223201310079C, NIH grants #R01-EB020004 och #UG3-HL141797-01 och Bill och Melinda Gates stiftelse beviljar #OPP1163237 och #OPP1173198 DEI. De åsikter och slutsatser som finns i detta dokument är författarnas och bör inte tolkas som representerar den officiella politiken, antingen uttryckliga eller underförstådda, av Defense Advanced Research Projects Agency, Food and Drug Administration, den National Institutes of Health, eller den amerikanska regeringen.
Materials
| Personal Protective Equipment | |||
| Hairnet | VWR | 89107-770 | |
| Tyvek lab coat | VWR | 13450-506 | |
| Extended cuff gloves | VWR | 89521-898 | |
| Equipment | |||
| Cutting mat | VWR | 102096-430 | |
| Tile cutter | McMaster-Carr | 26765A31 | |
| Mold-in-place (MIP) top molds | Protolabs, Inc. | custom | printed in Prototherm 12120 |
| Mold-in-place (MIP) bottom molds | Protolabs, Inc. | custom | printed in Prototherm 12121 |
| Duckbill curved forceps | VWR | 63041-864 | |
| Sharp tipped forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | |
| Metal spatula | VWR | 82027-528 | |
| Deep reactive ion etch (DRIE) pillar array wafers | Sensera, Inc. | custom | Four 50 x 50 mm pillar arrays per wafer; pillars 7 um wide, 50 um tall, spaced hexagonally 40 um apart |
| Textured polycarbonate .01” thick | McMaster-Carr | 85585K33 | cut to 45 mm square |
| PDMS blocks (40 x 40 x 5 mm) | n/a | custom | |
| Laminar flow hood | Germfree | BVBI | cast in-house |
| Air gun | |||
| 60°C level oven | |||
| Vacuum desiccator | |||
| Mass balance | accuracy to 0.1 g | ||
| Plasma machine | Diener | Nano | oxygen plasma capability is critical |
| Supplies | |||
| Sylgard 184 poly (dimethylsiloxane) (PDMS) base/curing agent kit | Ellsworth Adhesives | 4019862 | |
| Mixing cup | Ensure adequate ventilation when handling prepolymer due to low levels of ethylbenzene | ||
| 1 mL syringe | VWR | 10099-395 | |
| Cleanroom wipes | VWR | TWTX1080 | |
| 25 x 75 mm glass microscope slides | VWR | 48311-703 | |
| Packing tape | VWR | 500043-724 | |
| Scotch tape | VWR | 500026-873 | |
| Die-cut Polyurethane (PU) strips | Atlantic Gasket, Inc. | custom: AGWI2X3 | 1/8” thick; 60 Durometer Black Polyurethane; 2” x 3” |
| Polycarbonate film .005” thick | McMaster-Carr | 85585K102 | |
| 100 x 100 x 15 mm square gridded petri dishes | VWR | 60872-480 | |
| Aluminum foil | |||
| Optional Equipment | |||
| Thinky PDMS Mixer | Thinky | ARE-310 | |
| Mold-in place (MIP) jig | in-house | screw clamp compression jig | |
| Automated membrane fabricator (AMF) | in-house | pneumatic compression piston array with programmable heater |
References
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Benam, K. H., et al. Engineered In vitro Disease Models. Annual Review of Pathology Mechanisms of Disease. 10 (1), 195-262 (2015).
- Huh, D., et al. A Human Disease Model of Drug Toxicity-Induced Pulmonary Edema in a Lung-on-a-Chip Microdevice. Science Translational Medicine. 4 (159), 159ra147 (2012).
- Huh, D., et al. Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab on a Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).
- Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-Chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integrative Biology. 5 (9), 1130-1140 (2013).
- Kim, H. J., Li, H., Collins, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), E7-E15 (2016).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1 (5), s41551-017-0069–017 (2017).
- Somayaji, M. R., Das, D., Przekwas, A. Computational approaches for modeling and analysis of human-on-chip systems for drug testing and characterization. Drug Discovery Today. 21 (12), 1859-1862 (2016).
- Prantil-Baun, R., et al. Physiologically Based Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis Enabled by Microfluidically Linked Organs-on-Chips. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 58 (1), 37-64 (2018).
- Mahler, G. J., Esch, M. B., Stokol, T., Hickman, J. J., Shuler, M. L. Body-on-a-chip systems for animal-free toxicity testing. Alternatives to laboratory animals: ATLA. 44 (5), 469-478 (2016).
- Miller, P. G., Shuler, M. L. Design and demonstration of a pumpless 14 compartment microphysiological system. Biotechnology and Bioengineering. 113 (10), 2213-2227 (2016).
- Coppeta, J. R., et al. A portable and reconfigurable multi-organ platform for drug development with onboard microfluidic flow control. Lab Chip. 17 (1), 134-144 (2016).
- Wikswo, J. P., et al. Scaling and systems biology for integrating multiple organs-on-a-chip. Lab on a Chip. 13 (18), 3496-3511 (2013).
- Sung, J. H., et al. Using PBPK guided "Body-on-a-Chip" Systems to Predict Mammalian Response to Drug and Chemical Exposure. Experimental biology and medicine (Maywood, N.J.). 239 (9), 1225-1239 (2014).
- Stokes, C., Cirit, M., Lauffenburger, D. Physiome-on-a-Chip: The Challenge of "Scaling" in Design, Operation, and Translation of Microphysiological Systems. CPT: Pharmacometrics & Systems Pharmacology. 4 (10), 559-562 (2015).
- Shirure, V. S., George, S. C. Design considerations to minimize the impact of drug absorption in polymer-based organ-on-a-chip platforms. Lab Chip. , (2017).
- Huh, D., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nature Protocols. 8 (11), 2135-2157 (2013).
- Tran, T. T., et al. Exact kinetic analysis of passive transport across a polarized confluent MDCK cell monolayer modeled as a single barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 93 (8), 2108-2123 (2004).
- Henry, O. Y. F., et al. Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function. Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).
- Maoz, B. M., et al. Organs-on-Chips with combined multi-electrode array and transepithelial electrical resistance measurement capabilities. Lab on a Chip. 17 (13), 2294-2302 (2017).
- Benam, K. H., et al. Matched-Comparative Modeling of Normal and Diseased Human Airway Responses Using a Microengineered Breathing Lung Chip. Cell Systems. 3 (5), 456-466 (2016).
