खिंचाव, दोहरी चैनल, Microfluidic अंग चिप्स का स्केलेबल निर्माण
Summary
यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल है कि recapitulating अंग स्तर की कार्यक्षमता के लिए इन विट्रो मेंखिंचाव, दोहरी चैनल, अंग चिप microfluidic सेल संस्कृति उपकरणों के निर्माण का वर्णन करता है पेश करते हैं ।
Abstract
क्योंकि पशु अध्ययन अक्सर मानव रोगियों में नैदानिक प्रतिक्रियाओं की भविष्यवाणी करने में विफल सीसा यौगिकों की एक महत्वपूर्ण संख्या दवा पाइपलाइन में विफल । मानव अंग पर एक चिप (अंग चिप) microfluidic सेल संस्कृति उपकरणों, जो इन विट्रो मंच प्रभावकारिता, विषाक्तता का आकलन करने के लिए प्रदान करता है, और pharmacokinetic (PK) मनुष्यों में प्रोफाइल, चिकित्सकीय प्रभावकारिता के बेहतर अनुमान लगाने वाले हो सकता है और पशु अध्ययन की तुलना में क्लिनिक में सुरक्षा. इन उपकरणों के लिए वस्तुतः किसी भी अंग प्रकार के समारोह मॉडल और fluidically आम endothelium के माध्यम से जोड़ा जा सकता है लाइन microchannels के लिए मानव अंग स्तर और पूरे शरीर स्तर शरीर क्रिया विज्ञान पर इन विट्रो अध्ययन में प्रदर्शन किया जा सकता है लोगों पर प्रयोगों का संचालन । ये अंग चिप्स दो perfused microfluidic एक तरफ अंग विशिष्ट parenchymal कोशिकाओं के साथ एक पारगंय elastomeric झिल्ली से अलग चैनलों से मिलकर बनता है और दूसरे पर microvascular endothelium, जो चक्रीय प्रदान करने के लिए बढ़ाया जा सकता है अंग-विशिष्ट यांत्रिक cues (जैसे, फेफड़ों में गति श्वास) । इस प्रोटोकॉल 3 डी मुद्रित molds का उपयोग भागों के कास्टिंग के माध्यम से लचीला, दोहरी चैनल, अंग चिप्स के निर्माण का ब्यौरा, कई कास्टिंग और पोस्ट प्रसंस्करण कदम के संयोजन को सक्षम करने से । छिद्रित पाली (dimethyl siloxane) (PDMS) झिल्ली संपीड़न के तहत सिलिकॉन स्तंभ सरणियों का उपयोग कर छेद के माध्यम से आकार माइक्रोमीटर के साथ डाली जाती है । निर्माण और अंग चिप्स के विधानसभा उपकरण और कदम है कि एक पारंपरिक cleanroom के बाहर लागू किया जा सकता है शामिल है । इस प्रोटोकॉल में इन विट्रो अंग के लिए अंग चिप प्रौद्योगिकी के लिए उपयोग के साथ शोधकर्ताओं प्रदान करता है-और शरीर के ड्रग डिस्कवरी, सुरक्षा और प्रभावकारिता परीक्षण में स्तर के अध्ययन, साथ ही मौलिक जैविक प्रक्रियाओं के यंत्रवत अध्ययन.
Introduction
यहां, हम दोहरे चैनल के निर्माण का वर्णन, शरीर पर एक-चिप (अंग चिप) microfluidic संस्कृति अनुसंधान cleanrooms और पारंपरिक नरम लिथोग्राफी उपकरण के लिए उपयोग कमी समूहों द्वारा उपयोग के लिए उत्तरदायी एक स्केलेबल प्रोटोकॉल का उपयोग कर. इन उपकरणों को सामान्य और रोग फिजियोलॉजी को समझने के लिए मानव अंग-स्तर के कार्यों को दोहराऊंगा करने के लिए विकसित किया गया है, साथ ही इन विट्रो मेंदवा प्रतिक्रियाओं1,2. इंजीनियरिंग के लिए महत्वपूर्ण इस कार्यशीलता दो perfused microfluidic एक अर्द्ध पारगंय झिल्ली (चित्रा 1) द्वारा अलग चैनल हैं । यह डिजाइन ऊतकों के कम से दो प्रकार के बीच ऊतक ऊतक इंटरफेस का मनोरंजन सक्षम बनाता है, आमतौर पर अंग parenchymal कोशिकाओं को एक तरफ छिद्रित झिल्ली और संवहनी endothelium के दूसरे पर, साथ ही द्रव प्रवाह के लिए अपने जोखिम. इसके अलावा, क्योंकि elastomeric बहुलक, पाली (dimethyl siloxane) (PDMS), अंग चिप शरीर और झिल्ली घटकों, चक्रीय यांत्रिक तनाव के निर्माण के लिए प्रयोग किया जाता है पूरे इंजीनियर ऊतक के लिए लागू किया जा सकता है-लोचदार के माध्यम से ऊतक इंटरफेस झिल्ली फेफड़ों और आंत में क्रमाकुंचन में श्वास गति के रूप में रहने वाले अंगों के प्राकृतिक शारीरिक microenvironment की नकल करने के लिए ।
चित्रा 1: अंग चिप क्रॉस सेक्शन । अंग चिप्स दोनों पक्षों पर कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त किया जा सकता है कि एक असुरक्षित, लोचदार झिल्ली से अलग दो चैनलों से मिलकर बनता है । शीर्ष चैनल क्रॉस वर्गों 1 मिमी चौड़े x 1 मिमी उच्च हैं, नीचे चैनल क्रॉस वर्गों 1 मिमी चौड़े x ०.२ मिमी उच्च हैं, और दोनों और नीचे भागों में निर्वात चैनल ०.३ मिमी चौड़ा, ०.५ मिमी उच्च, और द्रव चैनलों से स्थान ०.३ मिमी हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
इन स्केलेबल, दोहरी चैनल, अंग चिप्स फेफड़े और दवा प्रेरित फुफ्फुसीय शोफ3,4में nanoparticle अवशोषण पर गति श्वास के प्रभाव का प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है; 5,6,7और आंत में भेदभाव5 और बैक्टीरियल वृद्धि पर सिकुड़नेवाला गति के प्रभाव; और गुर्दे8में भेदभाव और glomerular podocytes की परिपक्वता पर हृदय की धड़कन के कारण चक्रीय विकृति के प्रभाव । साथ ही, इन दो-लुमेन डिवाइस जिनमें एक endothelium-पंक्तिबद्ध संवहनी चैनल एक extracellular मैट्रिक्स (ECM) से अलग-लेपित झिल्ली parenchymal कोशिकाओं से एक अलग से सुलभ चैनल के भीतर दवा PK के लक्षण वर्णन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हैं पैरामीटर और नए लक्ष्य डिस्कवरी, जो एकल छिड़काव चैनल सिस्टम में सीमित किया गया है । इसके अलावा, कई अंग चिप्स एक साथ उनके संवहनी चैनल के माध्यम से जोड़ा जा सकता है प्रभावी रूप से एक मानव शरीर बनाने के लिए-on-चिप्स, जो इन विट्रो मंच में उपचारात्मक विकास9के लिए एक आकर्षक मानव की पेशकश कर सकता है, 10. सबसे सूक्ष्म शारीरिक प्रणालियों के विपरीत (सांसदों)11,12,13, अंग चिप्स दो microfluidic एक छिद्रित झिल्ली कि संवहनी parenchymal बातचीत की सुविधा से अलग चैनल होते है vivo अंग फंक्शन में दोहराऊंगा । यह न केवल विभिंन अंगों को जोड़ने के एक साथ संवहनी चैनलों के माध्यम से एक आम माध्यम perfusing द्वारा, लेकिन ऊतकों और तरल पदार्थ की compartmentalization vivo कार्यों में नकल और pharmacokinetic प्रयोग का समर्थन करता है और मॉडलिंग के रूप में अच्छी तरह के रूप में के रूप में इन विट्रोमें-vivo एक्सट्रपलेशन9,10 कि एकल चैनल सांसदों में मुश्किल या असंभव है14,15,16. microfluidic उपकरणों में PDMS की लोकप्रियता उपकरणों के विकास के लिए है सामग्री निहित करने के लिए छोटे अणुओं को अवशोषित करने की क्षमता को दूर करने के लिए नेतृत्व किया गया है10,17. हालांकि, चिप्स की बड़ी संख्या जैविक अध्ययन का समर्थन करने के लिए आवश्यक है जहां माइक्रोबियल एजेंटों और PDMS-अवशोषित यौगिकों का उपयोग अंग चिप्स का पुनः प्रयोग मुश्किल छोटे अनुसंधान समूहों के लिए भी एक स्केलेबल विनिर्माण प्रक्रिया आवश्यक । प्रोटोकॉल यहां वर्णित उपकरण निर्माण के लिए एक विधि प्रस्तुत शैक्षणिक प्रयोगशालाओं में उपयोग के लिए उपयुक्त, cleanrooms और शीतल लिथोग्राफी के लिए उन कमी का उपयोग भी शामिल है । इस प्रोटोकॉल के लिए मूल जैविक प्रक्रियाओं के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अनुवाद चिकित्सीय विकास की खोज के लिए विस्तृत, दोहरे चैनल उपकरणों का उपयोग करने की मांग शोधकर्ताओं की एक विस्तृत रेंज द्वारा अंग चिप्स के लिए उपयोग व्यापक करना है ।
विनिर्माण के लिए डिजाइन के साथ युग्मित micromanufacturing क्षेत्रों से सर्वोत्तम प्रथाओं का इस्तेमाल, एक मजबूत दृष्टिकोण उच्च reproducibility और उपज के साथ बड़ी मात्रा में अंग चिप उपकरणों के निर्माण के लिए विकसित किया गया था । निर्माण प्रोटोकॉल यहां वर्णित अंग चिप उत्पादन के लिए एक स्केलेबल विधि प्रदान करता है । हम एक वैकल्पिक मोल्ड में जगह जिग के उपयोग का वर्णन (MiP; पूरक सामग्रीमें डिजाइन विवरण) के साथ युग्मित गैसकेट स्ट्रिप्स कास्टिंग PDMS घटकों के ऊपर स्केलिंग को सक्षम करने के लिए । टुकड़े स्ट्रिप्स के चमकदार पक्ष ऑप्टिकली चिकनी PDMS भागों का उत्पादन करते हुए textured पक्ष को ढाल की सुविधा । हम भी बैच प्रति 24 झिल्ली के निर्माण के लिए इलाज के दौरान झिल्ली वेफर मोल्ड के समान संपीड़न प्रदान करता है कि एक वैकल्पिक स्वचालित झिल्ली किर (AMF) के उपयोग का वर्णन । डिजाइन मोटे तौर पर कि ऊतकों का अनुभव है कि यांत्रिक तनाव और छिड़काव से बना रहे हैं अंगों के अध्ययन के लिए लागू है, और इन चिप्स छोटे और बड़े की जरूरतों को पूरा करने के लिए आवश्यक मात्रा में कम चिप के लिए चिप परिवर्तनशीलता के साथ उत्पादन किया जा सकता अनुसंधान समूह एक जैसे । कार्यप्रवाह एक बैच या असेंबली लाइन स्वरूप के लिए उत्तरदायी है, और उत्पादन प्रक्रियाओं, कार्मिक प्रशिक्षण, और उत्तरदायी समस्या निवारण के नियंत्रण के लिए गुणवत्ता मूल्यांकन प्रोटोकॉल के साथ आसानी से संगत. हमें उंमीद है कि इस प्रोटोकॉल दोहरी चैनल की क्षमताओं के उपयोग का विस्तार होगा, स्केलेबल, बुनियादी और शोधों अनुसंधान के लिए अंग चिप्स ।
Protocol
Representative Results
Discussion
निर्माण प्रक्रिया PDMS शीर्ष और नीचे अंग चिप शरीर micromolded छिद्र PDMS झिल्ली के साथ युग्मित घटकों पैटर्न के लिए उच्च संकल्प 3 डी मुद्रित molds पर निर्भर करता है । इस महत्वपूर्ण दृष्टिकोण में तेजी से संक्रमण के साथ स?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम फोटोग्राफी और वीडियोग्राफी और एम. Ingram, जे गुयेन, डी. एक प्रकार का वृक्ष के साथ मदद के लिए एम रूसो और एस Kroll धंयवाद, और एन वेन प्रारंभिक निर्माण प्रोटोकॉल विकास के लिए योगदान के लिए । इस शोध को Wyss संस्थान द्वारा हार्वर्ड विश्वविद्यालय में जैविक रूप से प्रेरित इंजीनियरिंग के लिए प्रायोजित किया गया था और रक्षा उन्नत अनुसंधान परियोजनाएं सहकारी समझौतों के तहत एजेंसी #W911NF-12-2-0036 और #W911NF -16-C-००५०, और एफडीए अनुदान # HHSF223201310079C, NIH अनुदान #R01-EB020004 और #UG3-HL141797-01, और बिल और मेलिंडा गेट्स फाउंडेशन अनुदान #OPP1163237 और #OPP1173198 देई । विचारों और इस दस्तावेज़ में समाहित निष्कर्ष लेखकों के है और सरकारी नीतियों का प्रतिनिधित्व करने के रूप में व्याख्या नहीं की जानी चाहिए, या तो व्यक्त या निहित, रक्षा उंनत अनुसंधान परियोजनाओं एजेंसी, खाद्य और औषधि प्रशासन, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, या अमेरिकी सरकार ।
Materials
| Personal Protective Equipment | |||
| Hairnet | VWR | 89107-770 | |
| Tyvek lab coat | VWR | 13450-506 | |
| Extended cuff gloves | VWR | 89521-898 | |
| Equipment | |||
| Cutting mat | VWR | 102096-430 | |
| Tile cutter | McMaster-Carr | 26765A31 | |
| Mold-in-place (MIP) top molds | Protolabs, Inc. | custom | printed in Prototherm 12120 |
| Mold-in-place (MIP) bottom molds | Protolabs, Inc. | custom | printed in Prototherm 12121 |
| Duckbill curved forceps | VWR | 63041-864 | |
| Sharp tipped forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | |
| Metal spatula | VWR | 82027-528 | |
| Deep reactive ion etch (DRIE) pillar array wafers | Sensera, Inc. | custom | Four 50 x 50 mm pillar arrays per wafer; pillars 7 um wide, 50 um tall, spaced hexagonally 40 um apart |
| Textured polycarbonate .01” thick | McMaster-Carr | 85585K33 | cut to 45 mm square |
| PDMS blocks (40 x 40 x 5 mm) | n/a | custom | |
| Laminar flow hood | Germfree | BVBI | cast in-house |
| Air gun | |||
| 60°C level oven | |||
| Vacuum desiccator | |||
| Mass balance | accuracy to 0.1 g | ||
| Plasma machine | Diener | Nano | oxygen plasma capability is critical |
| Supplies | |||
| Sylgard 184 poly (dimethylsiloxane) (PDMS) base/curing agent kit | Ellsworth Adhesives | 4019862 | |
| Mixing cup | Ensure adequate ventilation when handling prepolymer due to low levels of ethylbenzene | ||
| 1 mL syringe | VWR | 10099-395 | |
| Cleanroom wipes | VWR | TWTX1080 | |
| 25 x 75 mm glass microscope slides | VWR | 48311-703 | |
| Packing tape | VWR | 500043-724 | |
| Scotch tape | VWR | 500026-873 | |
| Die-cut Polyurethane (PU) strips | Atlantic Gasket, Inc. | custom: AGWI2X3 | 1/8” thick; 60 Durometer Black Polyurethane; 2” x 3” |
| Polycarbonate film .005” thick | McMaster-Carr | 85585K102 | |
| 100 x 100 x 15 mm square gridded petri dishes | VWR | 60872-480 | |
| Aluminum foil | |||
| Optional Equipment | |||
| Thinky PDMS Mixer | Thinky | ARE-310 | |
| Mold-in place (MIP) jig | in-house | screw clamp compression jig | |
| Automated membrane fabricator (AMF) | in-house | pneumatic compression piston array with programmable heater |
References
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