Fabricação escalável de Stretchable, Dual Channel, órgão Microfluidic Chips
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo que descreve a fabricação do stretchable, dual channel, dispositivos de cultura de célula órgão microplaqueta microfluidic para recapitulando a funcionalidade de nível de órgão em vitro.
Abstract
Um número significativo de compostos de chumbo falha no pipeline de farmacêutica, pois estudos em animais, muitas vezes, não conseguem prever respostas clínicas em pacientes humanos. Órgão-em-um-microplaqueta (órgão Chip) microfluidic celular cultura dispositivos humana, que fornecem uma plataforma experimental em vitro para avaliar a eficácia, toxicidade e farmacocinéticos (PK) perfis em seres humanos, podem ser melhores preditores de eficácia terapêutica e segurança na clínica comparada com estudos em animais. Estes dispositivos podem ser usados para modelar a função de praticamente qualquer tipo de órgão e podem ser fluidically através de microcanais comum de endotélio-alinhado para realizar estudos em vitro na fisiologia humana de órgãos-nível e de todo corpo sem ter que realizar experiências com as pessoas. Esses Chips de órgão consistem em dois canais microfluídicos perfundidos, separados por uma membrana polimérica permeável com células parenquimais órgão específico, de um lado e endotélio microvascular do outro, que pode ser esticado ciclicamente para fornecer órgão específico pistas mecânicas (por exemplo, respiração movimentos no pulmão). Este protocolo detalha a fabricação de flexível, dual channel, Chips de órgãos através de fundição de peças usando 3D impresso moldes, permitindo a combinação de vários casting e pós-processamento em etapas. Porosa poli (dimetil siloxano) membranas (PDMS) são expressos com micrômetro de tamanho usando matrizes de pilar silício sob compressão através de buracos. Fabricação e montagem de Chips de órgãos envolve equipamentos e etapas que podem ser implementadas fora de uma sala de limpeza tradicional. Este protocolo fornece aos pesquisadores acesso a tecnologia de Chip de órgão para em vitro estudos de nível de órgão e corpo na descoberta da droga, segurança e testes de eficácia, bem como estudos mecanicistas dos processos biológicos fundamentais.
Introduction
Aqui, descrevemos a fabricação de canal duplo, vascularizado órgão-em-um-microplaqueta (órgão Chip) microfluidic cultura dispositivos que utilizam um protocolo escalável favorável para uso por grupos de pesquisa, falta de acesso a salas limpas e ferramentas tradicionais litografia macia. Estes dispositivos foram desenvolvidos para recapitular as funções de nível de órgão humano para compreensão normal e fisiologia da doença, bem como drogas respostas em vitro1,2. Crítica à engenharia essa funcionalidade são dois canais microfluídicos perfundidos, separados por uma membrana semi-permeável (Figura 1). Este projeto permite a recriação de interfaces de tecido-tecido entre pelo menos dois tipos de tecidos, geralmente células parenquimais do órgão em um lado da membrana porosa e endotélio vascular do outro, bem como sua exposição ao fluxo do fluido. Além disso, porque o polímero elastomérico, poli (dimetil siloxano) (PDMS), é usado para fabricar o corpo do órgão Chip e componentes de membrana, esforços mecânicos cíclicos podem ser aplicados a engenharia de todo o tecido-tecido da interface através do elástico membrana para imitar o microambiente física natural de órgãos vivos, tais como respiração movimentos no pulmão e peristaltismo no intestino.
Figura 1: seção transversal de órgão Chip. Chips de órgão consistem em dois canais separados por uma membrana porosa, elástica que pode ser inoculada com células de ambos os lados. Canal superior seções transversais são 1 mm de largura x altura, inferior 1 mm canal Cruz seções são 1 mm de largura x canais de alta e vácuo de 0,2 mm em ambos e partes de baixo são de 0,3 mm de largura, 0.5 mm alto e espaçados 0,3 mm dos canais fluídico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Estes stretchable, duplo canal, órgão Chips têm sido utilizados para demonstrar o impacto da respiração movimento na absorção de nanopartículas no pulmão e edema pulmonar induzido3,4; efeitos de movimento peristáltico na diferenciação5 e supercrescimento bacteriano no intestino5,6,7; e influência de deformações cíclicas devido a pulsação do coração na diferenciação e maturação de podócitos glomerulares no rim8. Além disso, estes dispositivos de dois lumens que contêm um canal vascular endotélio-alinhado, separado por uma matriz extracelular (ECM)-revestido de membrana de células parenquimais dentro de um canal separadamente acessível são adequados para caracterização de droga PK parâmetros e nova descoberta de alvo, que tem sido limitada em perfusão única canal de sistemas. Além disso, vários Chips de órgão pode ser ligados entre si através de seus canais vasculares para efetivamente criar um humano corpo em chips, que poderiam oferecer uma plataforma atraente humana em vitro para terapêutica desenvolvimento9, 10. Ao contrário de mais fisiológica de micro sistemas (MPS)11,12,13, os Chips de órgão contêm dois canais microfluídicos, separados por uma membrana porosa que facilita interações vascular parenquimatosa para recapitular a função de órgão in vivo . Isso não apenas simplifica a ligação dos diferentes órgãos juntos por perfusing um meio comum através dos canais vasculares, mas a compartimentação dos tecidos e fluidos imita funções na vivo e suporta experimentação farmacocinética e modelagem, bem como em vitro–no vivo extrapolação9,10 que é difícil ou impossível em um único canal MPS14,15,16. A popularidade de PDMS em dispositivos microfluídicos tem levado ao desenvolvimento de ferramentas para superar a capacidade inerente do material para absorver pequenas moléculas10,17. No entanto, o grande número de chips necessários para apoiar estudos biológicos, onde o uso de agentes microbianos e compostos de absorção de PDMS fazer reutilização de órgão Chips difícil exige um processo de fabricação escalável até para grupos de pesquisa pequena. O protocolo descrito aqui apresenta um método para a fabricação de dispositivo apropriado para o uso em laboratórios acadêmicos, incluindo aqueles que faltam o acesso às salas limpas e litografia macia. Este protocolo visa alargar o acesso às fichas de órgão por uma vasta gama de investigadores que pretendam usar os dispositivos stretchable, dual-channel para explorar processos biológicos básicos, bem como desenvolvimento de terapêutico translacional.
Uma abordagem robusta utilizando práticas recomendadas pela micromanufacturing campos juntamente com o projeto para fabricação, foi desenvolvida para a fabricação de dispositivos de órgão Chip em grandes quantidades com rendimento e alta reprodutibilidade. O protocolo de fabricação descrito aqui fornece um método dimensionável para produção de Chip de órgão. Nós descrevemos o uso de um opcional molde-em-lugar Jig (MiP; detalhes de design em Materiais suplementares) juntamente com tiras de poliuretano gaxeta para permitir a ampliação de fundição componentes PDMS. O lado brilhante das tiras de poliuretano produzir peças PDMS opticamente suaves enquanto o lado texturizado facilita a desmoldagem. Descrevemos também o uso de um opcional Automated membrana Fabricator (AMF) que proporciona compressão uniforme de moldes de wafer de membrana durante a cura para até 24 membranas por lote de fabricação. O projeto é amplamente aplicável para estudos de órgãos que são compostos de tecidos que experimentam a esforços mecânicos e perfusão, e esses chips podem ser produzidos com baixa variabilidade de chip-a-chip em quantidades necessárias para atender às necessidades de pequenas e grandes grupos de pesquisa parecidos. O fluxo de trabalho é favorável a um formato de lote ou linha de montagem e prontamente compatível com os protocolos de avaliação de qualidade para controle de processos de produção, treinamento de pessoal e responsivo a solução de problemas. Esperamos que este protocolo vai expandir o acesso para os recursos do canal duplo, stretchable, Chips de órgão de investigação básica e de translação.
Protocol
Representative Results
Discussion
O processo de fabricação baseia-se em moldes impressos 3D de alta resolução padrão os PDMS superior e inferior órgão Chip componentes do corpo juntamente com micromolded membranas porosas de PDMS. Esta abordagem crítica foi selecionada devido à facilidade de prototipagem, combinada com uma rápida transição para dimensionado para fabricação e substituição de ferramentas. Os moldes do componente superior destinam-se às portas padrão em locais precisos com perfis verticais definidos durante a etapa de fund…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a M. Rousseau e S. Kroll para ajudar com fotografia e videografia e M. Ingram, J. Nguyen, Shea D. e s. Wen de contribuições para o desenvolvimento do protocolo de fabricação inicial. Esta pesquisa foi patrocinada pelo Instituto Wyss biologicamente inspirados engenharia na Universidade de Harvard e o Defense Advanced Research Projects Agency sob contratos cooperativo #W911NF-12-2-0036 e #W911NF-16-C-0050 e FDA conceder # HHSF223201310079C, NIH concede #R01-EB020004 e #UG3-HL141797-01, e Fundação Bill e Melinda Gates concede #OPP1163237 e #OPP1173198 que o DEI. As opiniões e conclusões contidas neste documento são as dos autores e não deve ser interpretadas como representando as políticas oficiais, expressa ou implícita, do Defense Advanced Research Projects Agency, Food e Drug Administration, o Institutos nacionais de saúde, ou o governo dos EUA.
Materials
| Personal Protective Equipment | |||
| Hairnet | VWR | 89107-770 | |
| Tyvek lab coat | VWR | 13450-506 | |
| Extended cuff gloves | VWR | 89521-898 | |
| Equipment | |||
| Cutting mat | VWR | 102096-430 | |
| Tile cutter | McMaster-Carr | 26765A31 | |
| Mold-in-place (MIP) top molds | Protolabs, Inc. | custom | printed in Prototherm 12120 |
| Mold-in-place (MIP) bottom molds | Protolabs, Inc. | custom | printed in Prototherm 12121 |
| Duckbill curved forceps | VWR | 63041-864 | |
| Sharp tipped forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | |
| Metal spatula | VWR | 82027-528 | |
| Deep reactive ion etch (DRIE) pillar array wafers | Sensera, Inc. | custom | Four 50 x 50 mm pillar arrays per wafer; pillars 7 um wide, 50 um tall, spaced hexagonally 40 um apart |
| Textured polycarbonate .01” thick | McMaster-Carr | 85585K33 | cut to 45 mm square |
| PDMS blocks (40 x 40 x 5 mm) | n/a | custom | |
| Laminar flow hood | Germfree | BVBI | cast in-house |
| Air gun | |||
| 60°C level oven | |||
| Vacuum desiccator | |||
| Mass balance | accuracy to 0.1 g | ||
| Plasma machine | Diener | Nano | oxygen plasma capability is critical |
| Supplies | |||
| Sylgard 184 poly (dimethylsiloxane) (PDMS) base/curing agent kit | Ellsworth Adhesives | 4019862 | |
| Mixing cup | Ensure adequate ventilation when handling prepolymer due to low levels of ethylbenzene | ||
| 1 mL syringe | VWR | 10099-395 | |
| Cleanroom wipes | VWR | TWTX1080 | |
| 25 x 75 mm glass microscope slides | VWR | 48311-703 | |
| Packing tape | VWR | 500043-724 | |
| Scotch tape | VWR | 500026-873 | |
| Die-cut Polyurethane (PU) strips | Atlantic Gasket, Inc. | custom: AGWI2X3 | 1/8” thick; 60 Durometer Black Polyurethane; 2” x 3” |
| Polycarbonate film .005” thick | McMaster-Carr | 85585K102 | |
| 100 x 100 x 15 mm square gridded petri dishes | VWR | 60872-480 | |
| Aluminum foil | |||
| Optional Equipment | |||
| Thinky PDMS Mixer | Thinky | ARE-310 | |
| Mold-in place (MIP) jig | in-house | screw clamp compression jig | |
| Automated membrane fabricator (AMF) | in-house | pneumatic compression piston array with programmable heater |
References
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