Tyngdpunkten i detta protokoll är att effektivt isolera livskraftig primära glomeruli kulturer med minimala föroreningar för användning i en mängd olika nedströms tillämpningar. De isolerade glomeruli behålla strukturella relationer mellan komponent celltyper och kan vara odlade ex vivo för en kort tid.
Bevarandet av glomerulär struktur och funktion är avgörande för en kategori av njursjukdom kännetecknas av proteinuri vilket så småningom kan leda till kronisk och slutstadiet njursjukdom, förebyggande av glomerulonefrit. I glomeruli är en komplex apparat som är ansvarig för filtrering av plasma från kroppen. Vid sjukdom, strukturell integritet är förlorad och möjliggör onormala läckage av plasma innehållet i urinen. En metod för att isolera och undersöka glomeruli i kultur är kritisk för studiet av dessa sjukdomar. I detta protokoll beskrivs en effektiv metod för att hämta intakt glomeruli från vuxen råtta njurar samtidigt bevara strukturella och morfologiska egenskaper. Denna process är kan generera hög avkastning i glomeruli per njure med minimal förorening från andra nefronet segment. Med dessa glomeruli, kan skada villkor vara härmade av inkubering med en mängd kemiska gifter, inklusive protaminsulfat, som orsakar mul processen utplåning och proteinuri i djurmodeller. Graden av skada kan bedömas med transmissionselektronmikroskopi, immunofluorescens färgning och western blotting. Nephrin och Wilms tumör 1 (WT1) nivåer kan också bedömas utifrån dessa kulturer. På grund av enkelheten och flexibiliteten i detta protokoll, kan de isolerade glomeruli utnyttjas som beskrivs eller på ett sätt som bäst passar behoven hos forskaren att hjälpa bättre studie glomerulär hälsa och struktur i sjuka staterna.
I glomeruli är en högt specialiserad tofs av kapillärer ansvarar för filtrering av cirkulerande plasma. Det bildar början av den nefronen, vilket är den grundläggande funktionella enheten i njuren. Glomerulär funktion definieras av ett unikt fenestrated kapillär endotelet, slit membranen av podocytes och en mellanliggande basalmembran. Dessa skikt bildar en semipermeable barriär som möjliggör selektiv utsöndring av ämnen i filtratet. Vatten, joner och andra små molekyler generellt passera, medan större molekyler behålls i plasma. Podocytes är specialiserade epitelceller som spridit sig över basalmembranet, omgivande kapillärerna med cytoplasmiska prognoser kallas fot processer. Foten bearbetar av intilliggande podocytes interdigitate och korsas av slit membraner består av proteiner som nephrin, podocin, P-cadherin och ZO-11. I tvärsnitt, dessa foten processer arrangeras jämnt över basalmembranet. I sjuka glomeruli blir foten processerna grovt onormal eller ”anspråkslös”, leder till onormala läckage av plasma innehållet i filtratet. Som sådan, kännetecknas glomerulär skada generellt av närvaron av onormalt stora mängder protein (t.ex. proteinuri) och/eller röda blodkroppar (t.ex. hematuri) i urinen. Dessutom förlora skadade podocytes uttryck av nephrin as well as dess regulator Wilms tumör 1 (WT1), en viktig protein som ansvarar för underhåll av differentiering2,3. I glomeruli är ett primärt mål av skador i diabetisk nefropati och andra glomerulonephritides såsom minimal förändring sjukdom, membranös nefropati och fokal segmentell glomeruloskleros. Dessa sjukdomar är stora orsaker till progressiv njursvikt och utvecklingen av njursjukdom i slutstadiet, ett tillstånd där överlevnad är beroende av dialys eller njurtransplantation. Det är därför viktigt att studera glomeruli för att bättre förstå kronisk sjukdom (CKD) patologi.
Ett cellodlingssystem är avgörande för att studera glomerulär biologi. På grund av dess centrala roll i att generera slitsbländaren, liksom förekomsten av specifika proteinuric sjukdomar på grund av slit membran protein mutationer, har mycket forskning förståeligt utnyttjat podocyte isolerat. Detta har lett till generation av primära podocyte cellinjer att utnyttja i vitro. Dessa celler kan vara odlade under olika villkor och kan även odlas på genomsläppliga stöder att bedöma permeabilitet4. Emellertid, isolering av prolifererande celler ofta väljer dedifferentiated celler som har förlorat en del av deras podocyte markörer. Detta har lett till generation av villkorligt förevigade podocytes härrör från en transgen mus stam bär en temperaturkänsliga mutant av den SV40 stora T gen (t.ex. immortomouse), som kan odlas i kultur men också vara differentierade för att uttrycka en hel uppsättning podocyte markörer5. Dessa metoder av primära kultur har varit avgörande i förståelse podocyte biologi4,6,7.
Dock kulturer som innehåller enstaka celltyper saknar de intercellulära relationer som uppstår i vivo samt den stödstruktur och matriser, och enskiktslager av dessa celler nödvändigtvis recapitulate inte det tredimensionella arkitekturen i glomeruli. Den förevigade podocytes kan också vara besvärligt och utmanande att kultur8, och kräver innehav av antingen i immortomouse eller en start alikvot av celler från etablerade utredarna att komma igång. Ytterligare, glomeruli består av inte bara podocytes, men även kapillära endotelceller och den basalmembranet, samt mesangialceller som ger stöd för strukturen. Det är därför lämpligt att utveckla en ex vivo strategi finns för alla utredare för studien av intakt glomeruli som behåller sin ursprungliga arkitektur samt alla celler som utgör de normala glomeruli.
1958 beskrivs Cook och Pickering den första isoleringen av glomeruli från kanin njuren. Efter observationer att fett embolier blev ingavs i glomeruli, förutsatte de att partiklar av samma storlek kan användas specifikt isolera dessa strukturer. Infusion av järnoxid partiklar i njuren ledde faktiskt till fångst av dessa partiklar i glomeruli. Efter mekanisk dissociation och siktning av njure, kunde glomeruli isoleras intakt och med renhet med hjälp av magnetisk separering9. 1971 visade Misra att den järnoxid som infusioner kan utelämnas och glomerulär isolering uppnås med siktning av malet människa, hund, kanin eller råtta njure vävnad10. Denna teknik har ändrats sedan sedan beroende på målet att utredarna men i huvudsak har resulterat i renade preparat som kunde studeras ytterligare eller som primära cellkulturer kan vara etablerade11,12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17.
Här beskriver vi ett protokoll för isolering av intakt livskraftig glomeruli från råtta njuren. Hela protokollet tar bara några timmar. Även om de inte föröka, kan experimentell planer av valfri storlek stödjas genom att helt enkelt öka antalet njurar som utgångsmaterial. Medan det finns publicerade protokoll för magnetiska pärla separation av glomeruli, de kräver intravenös injektion av pärlor, är dyrare och kan förändra biologi eftersom pärlorna behålls antingen av glomeruli i kultur eller kräva glomerulär ” lyseringslösning ”och borttagning av centrifugering19. Jämfört med musen glomeruli, gör större storleken på råtta glomeruli (nästan 100 µm i två månader gamla råttor18) det mycket lättare att skilja dem från andra njure strukturer med hjälp av en enkel siktning teknik.
Som bevis för deras användbarhet, har vi kännetecknas av glomeruli för att demonstrera de olika celltyper. De kan också utsättas för agenter känt att skada glomeruli in vivo och vi visa de negativa effekterna av protaminsulfat (PS) på dessa kulturer. PS är en polycation som neutraliserar anjoniska platserna längs den glomerulära kapillära väggen20. Denna neutralisering har en dramatisk effekt på den glomerulära barriären och därför ökar proteinuri och foten processen utplåning. Dessa glomeruli kan bedömas med immunoblots för viktiga proteiner som nephrin och WT1 att bedöma övergripande hälsa. Dessutom kan deras struktur utvärderas med ljus, immunofluorescens och elektronmikroskopi.
Övergripande, detta protokoll är tillgängligt för de flesta utredarna (behöver man bara tillgång till djuren och några enkla utrustning). Med morfologiska egenskaper kvar oskadad, forskaren kunna analysera glomeruli och se hur andra viktiga celltyper och matrix bevarande i glomeruli påverka funktion och proteinsjukdomar progression, en brist i podocyte kulturer.
Detta är en effektiv metod för att återställa glomeruli från råtta njure med billig, återanvändbar utrustning med ett enkelt protokoll. Som med alla förfaranden, finns det begränsningar för dess användbarhet. Först, även om vi får > 95% renhet, på grund av protokollet och utgångsmaterialet är det omöjligt att utesluta siktning alla föroreningar, och några röda blodkroppar och enstaka tubulär segmentet kommer att närvara i kulturen. Vi räknar inte dessa små föroreningar för att vara ett problem för flesta applikationer. Andra åberopat protokollet siktning användningen av råtta njurarna, där glomeruli är mycket större än hos möss. Om musen glomeruli behövs, varit en teknik som använder kommersiella magnetiska pärlor (t.ex., Dynabeads) publicerad22. För det tredje har det visat att specifika mRNA (plasminogen aktivator inhibitor-1 och kollagen jag) i enstaka glomeruli härleda nästan helt från Bowman’s kapsel i stället för att intraglomerular celler23. Detta kan leda till olämpliga slutsatser om mRNA isolering görs från dessa glomeruli. Det bör noteras att majoriteten av glomeruli i våra händer är decapsulated och bör därför saknar betydande bidrag från Bowmans kapslar. Det fjärde börjar celldöd uppstå relativt snabbt under kultur.
Vi hittade att programmet apoptotiska, vilket framgår av utseendet på klyvs kaspas-3, aktiverades börjar på 2 h av kultur. Detta är i allmänhet avtal med tidigare rapporter visar att apoptos, enligt bedömning av DNA fragmentering, TUNEL och histologisk analys, börjar uppstå inom 1-2 h efter isolering24. Det bör dock även noteras att tidiga observationer visade att metabolisk aktivitet kunde upptäckas från isolerade Söll glomeruli när odlade för minst 3 h, vilket tyder på betydande cellulära lönsamhet vid denna tidpunkt16. Baserat på resultaten, anser vi dock att det skulle vara klokt att använda isolerade glomeruli omedelbart i avsedda experiment för bästa resultat. Vi rekommenderar att alla experiment utförs före 72 h som vi har observerat att hela glomerulär struktur börjar försämras efter denna tidpunkt.
Det är mycket lättare att få högre avkastning när start med 4-8 njurar i motsats till bara 2 eftersom ett visst antal glomeruli är förlorad på grund av adherencen till de olika siktarna, men när siktarna beläggs maximally finns det ingen ytterligare förlust. Av samma anledning är det viktigt att blöta siktarna i den BSA/PBS buffert före användning eftersom glomeruli är mer benägna att följa en torr SIL, och begränsa vävnad exponering till en kant på sikten. Vi föreslår att man börjar med inte mindre än 6 njurar (3 råttor) att få en rimlig avkastning.
Vissa utredare har isolerade primära podocyte kulturer från isolerade glomeruli som tenderar att växa ur glomeruli under kultur17. Vi har noterat att vissa isolerade glomeruli kommer följa kultur maträtt plast och att celler kommer att börja migrera av glomerulär strukturen vid sena tidpunkter (72 h efter isolering). Studien av dessa celler är utanför ramen för denna isolering protokoll, och det finns viss kontrovers om huruvida dessa celler är podocytes, parietala epitelcellerna eller båda15,25. Noterbart Mundel et al., har rapporterat att kullersten celler skördas från Söll glomeruli kan förmås att differentieras till mogen podocytes enligt särskilda odlingsskålar villkor26. Några av förvirringen angående cellidentiteten kan bero på huruvida de isolerade glomeruli är inkapslade (inklusive Bowman’s kapsel som är befolkad av parietala epitelcellerna) eller decapsulated i förfarandet för siktning. I våra händer, med hjälp av sekventiella sieve storlekar av 180, 90 och 75 µm ledde till majoriteten av glomeruli är decapsulated.
De flesta former av proteinuric kronisk njursjukdom är på grund av ökad glomerulär permeabilitet. Flera författare har utnyttjat isolerade glomeruli i ex vivo permeabilitet experiment. I en metod, var förändringen av glomerulär volym efter att förändra osmotisk innehållet i det omgivande mediet används för att uppskatta permeabilitet27. Nyligen, det fastställdes att läckage av en fluorescerande sond från isolerade glomeruli kunde kvantifieras för att mäta permeabilitet och kunde utföras på gnagare utsätts för glomerulär sjukdom experimentella modeller28.
Vi har noterat att i TEM förberedelseprocessen, ser vi ibland podocyte fot processer lift off basalmembranet. Vi tycker inte detta händer i kulturen och är mer sannolikt en artefakt under TEM provberedning. Noterbart även när detta inträffar, är det klart om foten processerna ser ”normala” eller är utplånade.
Sammantaget ger detta protokoll en metod genom vilken man kan utvärdera morphologic och cellulära förändringar som svar på skadan. Vi räknar med att det kan användas som en följeslagare teknik till isolerade podocyte kulturer, särskilt när interaktioner med extracellulära matrix eller andra infödda celltyper övervägs. Den rymmer löfte för att öka förståelsen för proteinuric CKD, som skulle förbättra förmågan att utveckla framtida therapeutics för denna handikappande sjukdom.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av American Heart Association grant FTF 16990086, NIH P30 DK079307, American Society of njurmedicin Gottschalk Award, en University of Pittsburgh Medical Center konkurrenskraftiga medicinsk forskning Fund Award och en University of Pittsburgh Läkare akademiska Foundation Award. Vi tackar Gerard Apodaca för hans tekniska förslag för glomerulär bevarande för histologisk analys, Mara Sullivan och Ming solen för hjälp med elektronmikroskopi, och Yingjian Li och Youhua Liu för deras tekniska insatser i detta protokoll. Vi tackar också Cynthia St. Hilaire för CD31 antikroppen.
Solutions, Chemicals, and Animals | |||
Sprague-Dawley Rats | Envigo | 207M | |
Bovine serum albumin | Fisher | BP1605100 | |
Hank's Balanced Salt Solution with Ca2+ and Mg2+ | Thermo | 14025092 | |
1x Phosphate Buffered Saline | VWR | 97063-660 | |
Protamine sulfate | MP Bio | ICN15197105 | |
Karnovsky's Fixative | |||
Gelatin | |||
Paraformaldehyde | EMD | EM-PX0055-3 | |
O.C.T. | Scigen | 23730571 | |
RIPA Buffer | |||
Halt Protease Inhibitors | Thermo | PI78442 | |
Nephrin Antibody | Fitzgerald | 2OR-NP002 | |
WT-1 Antibody | Abcam | ab89901-10ul | |
PDGFR-β Antibody | Cell Signaling | #3169S | |
CD31 Antibody | LSBio | LS-C348736 | |
Cleaved caspase-3 antibody | Cell Signaling | 9661S | |
Poly/Bed 812 (Luft) epoxy | Polysciences | 08792-1 | |
Equipment | |||
Carbon dioxide chamber | |||
Conical tubes, 15 mL | |||
Conical tubes, 50 mL | |||
Surgical scissors | |||
Surgical forceps | |||
Sterile gauze | |||
Petri dishes, 100 mm | |||
Scalpels | |||
Razor blades | |||
Sterile filter apparatus | |||
Sieve Pan | Alfa Aesar | AA39999ON | |
180um Sieve | Alfa Aesar | AA39996ON | |
90um Sieve | Alfa Aesar | AA39990ON | |
75um Sieve | Alfa Aesar | AA39991ON | |
10 mL syringes | |||
600 mL beakers | |||
Cell culture incubator | |||
Picofuge | |||
Vortex | |||
Tissue Homogenizers | Fisher Scientific | 50550226 | |
20 G needles | |||
Leica Reichart Ultracut | ultramicrotome |