Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

الاشتقاق وتمايز الخلايا الجذعية الوسيطة المبيض الكلاب

doi: 10.3791/58163 Published: December 16, 2018

Summary

هنا، نحن تصف طريقة للعزل والتوسع، وتمايز الخلايا الجذعية الوسيطة من أنسجة المبيض الكلاب البوليسية.

Abstract

وقد تزايد الاهتمام بالخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) على مدى العقد الماضي بسبب سهولة العزل والتوسع، والثقافة. في الآونة الأخيرة، أظهرت الدراسات قدرة التمييز على نطاق واسع التي تمتلك هذه الخلايا. المبيض يمثل مرشح واعدة للعلاجات المستندة إلى خلية يرجع ذلك إلى حقيقة أن غنية في MSCs، وأنه كثيرا ما يتم تجاهلها بعد العمليات الجراحية أوفاريكتومي كالنفايات البيولوجية. توضح هذه المقالة الإجراءات للعزلة، التوسع، والتفريق بين MSCs المستمدة من المبيض الكلاب البوليسية، دون الحاجة إلى فرز الخلايا التقنيات. ويمثل هذا البروتوكول أداة هامة للطب التجديدي بسبب انطباق واسع النطاق لهذه الخلايا اختلاف الغاية في التجارب السريرية والأغراض العلاجية.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

عدد الدراسات المنشورة التي تركز على الخلايا الجذعية قد زاد زيادة كبيرة على مدى العقد الماضي، مجهود بحثي قد تم تغذيها الهدف الجماعي لاكتشاف علاجات الطب التجديدي قوية. الخلايا الجذعية لديها علامات تعريف الأساسي هما: التجديد الذاتي والتمايز. الخلايا الجذعية الوسيطة هي المسؤولة عن دوران الأنسجة العادية وقدرة أكثر تقييداً من التمايز عند مقارنة بالخلايا الجذعية الجنينية1. في الآونة الأخيرة، وقد أظهرت العديد من الدراسات مجموعة واسعة من التفريق بين MSCs، وموضوع قيد المناقشة عما إذا كانت هناك اختلافات بين الخلايا الجذعية الجنينية والكبار في كل2.

ظهارة سطح أوفاريوم هو غير ملتزم بها طبقة من الخلايا، أقل نسبيا المتباينة، التي تعبر عن كل علامات الظهارية والوسيطة3، الاحتفاظ بالقدرة على التفريق في أنواع مختلفة من الخلايا في الاستجابة إلى 4من الإشارات البيئية. الموقع الدقيق للخلايا الجذعية في المبيض ليست معروفة جيدا؛ ومع ذلك، اقترح أن المتكفل بيبوتينتيال في الباجينا الغلالة تثير الخلايا الجرثومية5. الدراسات المناعية يكون الافتراض بأن هذه الخلايا اللحمية من أصل6 أو يقع في أو الدانية إلى سطح المبيض7. أن الخلايا الجذعية الوسيطة التعبير عن مستقبلات العديدة التي تلعب دوراً هاما في الخلية الالتصاق8، تجربة صمم لاختبار فرضية أن تحديد عدد الخلايا التي تحتوي على الانضمام السريع أن عزل أن خلايا وضوح تشاراكتيريزابل كالوسيطة في الطبيعة. في الآونة الأخيرة، ذكرت مجموعتنا اشتقاق MSCs من أنسجة المبيض استناداً إلى قدرتها على الانضمام إلى سطح البلاستيك طبق الثقافة في ح 3 الأول للثقافة، من أجل الحصول على عدد سكان المنقي للخلايا العارضة التصاق السريع9. وهنا يصف لنا الطريقة المتقدمة لعزل الخلايا الجذعية الوسيطة من أنسجة المبيض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وأجريت هذه التجربة مع المبايض أربعة كلاب أنثى مهجنة تبرعت بعد الجراحة الاختيارية في برنامج تعقيم الكلاب البوليسية. وأقر هذا تجربة "لجنة الأخلاقيات" في استخدام الحيوانات في أونيسب-فكاف (البروتوكول رقم 026991/13).

1-إعداد التجريبية

  1. إعداد أو شراء 500 مل من مخزنة الفوسفات المالحة العقيمة دولبيكو (دببس) دون الكالسيوم أو المغنيسيوم.
  2. إعداد كولاجيناز أنا الأسهم الحل عن طريق خلط 40 ميكروغرام للانزيم في 1 مل دببس. التصفية باستخدام عامل تصفية حقنه 0.2 ميكرون، وتخزين مختبرين 2 مل في-20 درجة مئوية.
  3. تعد وسائل الإعلام ثقافة من المتوسطة (دميم) الجلوكوز تعديل النسر دولبيكو منخفضة مع المصل الجنيني 10% و 1% من المضادات الحيوية.
  4. جمع مواد معقمة: الأطباق المقص والملقط، قارورة زراعة الأنسجة، وأنابيب ماصات 10 مل و 5 مل.
  5. استخدام معدات المختبرات ثقافة الخلية القياسية: سلامة بيولوجية مجلس الوزراء (BSC)، حاضنة ثقافة خلية المحددة في 5% CO2 و 38 درجة مئوية، ومن أجهزة الطرد مركزي.
  6. تنظيف بكالوريوس العلوم: مع الأيدي القفاز، وتعقيم مع 70% EtOH، باستخدام مصابيح الأشعة فوق البنفسجية.

2-عزل الخلايا الجذعية الوسيطة من المبيض

  1. بعد الجراحة، وإبقاء المبيض في برنامج تلفزيوني على الجليد في أنبوب مخروطي، حتى وصولها إلى المختبر.
  2. شغل اثنان من أطباق بيتري 100 ملم مع 10 مل من برنامج تلفزيوني.
  3. إزالة المبايض من الأنبوب ونقلها إلى طبق بتري الأول مع برنامج تلفزيوني. غسلها بخلط الحركات.
  4. بلطف استرداد المبيض ووضعه في طبق آخر. مع ملاقط معقمة ومقص، فرم الأنسجة إلى قطع صغيرة جداً، حوالي 1 ملم في الحجم.
  5. نقل أنسجة المبيض إلى 35 مم طبق بيتري وإضافة 2 مل كولاجيناز. فرم الأنسجة أكثر قليلاً.
  6. ضع طبق بيتري في الحاضنة عند 38 درجة مئوية ح 3 وهزه بلطف طبق بيتري مع حركات دائرية كل 20 دقيقة.
  7. بعد ح 3، إزالة طبق بيتري من الحاضنة.
  8. نقل محتويات الطبق إلى أنبوب 15 مل. إضافة 5 مل من التوسع في وسائل الإعلام.
  9. برفق عكس الأنبوب قبل الطرد المركزي. الطرد المركزي الأنبوب في ز 2100 x للحد الأدنى 7 إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه مع 3 مل من التوسع في وسائل الإعلام.
  10. نقل بيليه إلى زجاجة T25. ضع الزجاجة في الحاضنة مع 5% CO2 في 38 درجة مئوية ح 3.
    ملاحظة: أهم جزء من الإجراءات لتغيير وسائل الإعلام بعد ح 3 من الحضانة.
  11. قم بإزالة الزجاجة من الحاضنة ووسائط الإعلام مع الأنسجة المتبقية. إضافة 3 مل من توسع جديدة وسائل الإعلام إلى الزجاجة.
  12. تغيير وسائل الإعلام كل 48 ساعة ومراقبة الزجاجة لالتقاء الخلوية.
    ملاحظة: يمكن ملاحظة الخطوات الرئيسية لهذا الإجراء في الشكل 1.

3-توسيع نطاق خلايا الجذعية الوسيطة من المبيض

  1. مرور الخلية
    1. عندما تصل الخلايا إلى التقاء، قم بإزالة الوسائط من الزجاجة.
    2. تغسل الزجاجة مع 3 مل من برنامج تلفزيوني. قم بإزالة برنامج تلفزيوني.
    3. إضافة 1.5 مل التربسين ووضع الزجاجة في الحاضنة عند 38 درجة مئوية للحد الأدنى 3 اضغط برفق زجاجة لمساعدة الخلايا لفصل.
      ملاحظة: الخلايا ينبغي التوصل إلى التقاء ما يقرب من 5-7 د بعد الطلاء الأولى.
    4. أضف 3 مل من التوسع في وسائل الإعلام ونقل المحتويات إلى أنبوب مخروطي.
    5. الطرد المركزي الأنبوب في 2100 س ز للحد الأدنى 7 إزالة المادة طافية وإضافة 1 مل من التوسع في وسائل الإعلام.
    6. مجانسة محتويات الأنبوبة برفق.
    7. تأخذ قاسمة 10 ميليلتر من العينة لأداء الخلية العد ووضع الأنبوب مع الخلايا في الحاضنة.
    8. المكان 10 ميليلتر من هذا المزيج إلى هيموسيتوميتير.
  2. عد الخلايا
    1. استخدام 10 X الهدف المجهر والتركيز على خطوط الشبكة هيموسيتوميتير.
    2. عد الخلايا الموجودة في المربعات الصغيرة الخمس (الشكل 2).
    3. مضاعفة عدد الأصوات التي تم فرزها حسب 50,000 لتقدير عدد الخلايا في المليلتر.

4-التفريق بين الخلايا الجذعية الوسيطة من المبيض

ملاحظة: أجريت فحوصات التفريق وفقا للمبادئ التوجيهية المحددة في تلة et al. 9.

  1. البذور 1.0 × 104 خلايا كل جيدا، في ثلاث نسخ، استخدام طبق ثقافة 4-جيدا.
  2. أضف 1 مل من التوسع في وسائل الإعلام.
  3. تحرض الطبق مع حركات دائرية بلطف.
  4. بعد 24 ساعة، استبدال الوسائط الثقافة مع وسائط الإعلام التمايز المرغوب فيه.
  5. أوستيوجينيك، أديبوجينيك، والتفريق بين تشوندروجينيك، احتضان الخلايا مع وسائط الإعلام التعريفي لمد 30، مع استبدال الوسائط واستخدمت كل مجموعات محددة التمايز دال 3 لكل من هذه الاختبارات.
  6. للتفريق بين النسب العصبية، احتضان الخلايا د 10 في وسائط الإعلام التعريفي، مع استبدال الوسائط كل 3 د. الوسائط المستخدمة هنا الواردة دميم الجلوكوز منخفضة حمض فالبرويك مم 2، 1 ميكرومتر الهيدروكورتيزون، 10 فورسكولين ميكرومتر، كلوريد البوتاسيوم 5 مم، 5 ميكروغرام/مل الأنسولين و hydroxyanisole بوتيل 200 ميكرومتر.
  7. للسلائف الأنسجة، واحتضان لمد 5 في وسائل الإعلام الأنسجة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة كاشف.
  8. للتفريق بين نسب الخلايا البدائية، احتضان الخلايا في وسائط الإعلام التعريفي لمد 14، مع استبدال الوسائط كل 3 د. الوسائط المستخدمة هنا الواردة دميم، 10% FBS، بيروفات صوديوم 1 مم، 10 نانوغرام/مل ليف، الأحماض الأمينية غير الأساسية 1 مم، 2 مم L-الجلوتامين، 5 ميكروغرام/مل الأنسولين، مم 0.1 بيتا-ميركابتوثانول، 60 ميكرومتر بوتريسسيني، 20 ميكروغرام/مل ترانسفيرين، 10 نانوغرام/مل الماوس البشرة النمو عامل، 1 نانوغرام/مليلتر البشرية عامل النمو تنتجها الخلايا الليفية الأساسية، 40 نانوغرام/مليلتر الإنسان الدبقية الخلية المستمدة من خط نيوروتروفيك عامل، والبنسلين 15 مغ/لتر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

عزل الخلايا الجذعية الوسيطة من الكلاب المبيض:

ويرد الإجراء عزلة MSC المبيض في الشكل 1. بعد الجراحة، وتنميق الأنسجة، والهضم كولاجيناز، وتغيير الإعلام ح 3 بعد بداية الثقافة، كان عدد سكانها MSC المفترضة مع خصائص البلاستيك اللاصق السريع معزولة بنجاح من أنسجة المبيض الكلاب. الخلايا المقطوع سرعة التقيد بسطح البلاستيك طبق الثقافة ونمت لتصبح ثقافة أحادي الطبقة شكلياً متجانسة مع نموذجية مثل ماجستير مورفولوجيا (الشكل 3).

وصف MSC المبيض في المختبر

ماجستير توصيف يهدف إلى التأكد من أن الخلايا المعزولة مطابقة لمعايير لجنة السلامة البحرية. وتشمل هذه التمسك بالبلاستيك، والكشف عن إيجابية الواسمات السطحية الوسيطة، وعدم وجود علامات السطحية المكونة للدم، فضلا عن القدرة على الخضوع للمفاضلة ميسوديرمال.

كما هو موضح في الشكل 3، المستمدة من المبيض خلايا كانت ملتصقة بالبلاستيك والمعروضة مورفولوجيا تشبه تنتجها الخلايا الليفية، الوفاء بالمعيار الأول الذي يعرف MSCs. وعلاوة على ذلك، أظهرت الخلايا المعزولة التعبير عن النصوص لعلامات MSC الكلاب CD44، CD90، و CD105. وبالإضافة إلى ذلك، تم الكشف عن المستضدات السطحية الخلية الخاصة بلجنة السلامة البحرية CD90 و CD44 بإقرار نظام مراقبة الأصول الميدانية التحليل المبكر وإيمونوسيتوتشيميستري. وأكد عدم وجود علامات CD45 و CD34، وهي الخلايا المكونة للدم خاصة المستضدات السطحية، أيضا نفس التقنيات (الشكل 4). هذا وأكد كذلك أن المبيض يحتوي على خلايا معربا عن النمط الظاهري خاصة بلجنة السلامة البحرية9. الأجسام المضادة التي استخدمت في هذه التجربة للكلاب ماجستير توصيف مذكورة في الجدول للمواد-

والخطوة التالية في وصف MSCs تحقيق إثبات قدرتها على التفريق في الأنساب ميسوديرمال. بعد 30 يوما من التعرض والثقافة في البروتوكولات المفاضلة الخاصة بالنسب، وتلطيخ أجرى لتحديد التزام بالانساب مختلفة (الشكل 5A). وأكد التزام بنسب أوستيوجينيك عن طريق فون كوسي تلطيخ، التي حددت رواسب الكالسيوم. صبغة safranin س بروتيوغليكان أكد التزام تشوندروجينيك، وتلطيخ الدهني "يا الأحمر النفط" أكد التزام أديبوجينيك. مواصلة التحقيق في ديفيرينتيابيليتي لهذه الخلايا، أنهم كانوا قادرين على الخضوع للتمايز في نسب اكتوديرميك، كما يتضح من إيمونوستينينج لعلامات الخلايا الجذعية نيوروكتوديرمال هما: β-tubulin ونيستين، عقب التعرض من MSCs المستمدة من المبيض إلى البروتوكول التمايز النسب العصبية لمدة 10 أيام (الشكل 5). المحاضر الحرفية ل SOX17 و CD184، فضلا عن مورفولوجيس الخلية المحددة للنسب اندوديرمال، لوحظت بعد التعرض لبروتوكولات محددة التمايز لمدة 5 أيام (الشكل 5 (ب)). وأخيراً، بعد 14 يوما تعرض المبيض المستمدة من MSCs إلى جرثومة خلية الإعلام التعريفي، 4 أكتوبر وحددت DDX4 (الشكل 5). معا، هذه النتائج دعم قدرات قوية ومتنوعة من التمايز MSCs المستمدة من أنسجة المبيض، عندما تتعرض ل بروتوكولات محددة التمايز9.

Figure 1
الشكل 1 : الخطوات الرئيسية لإجراءات العزل. (1) بعد الجراحة، نقل المبيض إلى أنابيب معقمة مع برنامج تلفزيوني، على الجليد. (2) أن يغسل المبيض، ينبغي نقلهم إلى صفيحة 100 ملم مع برنامج تلفزيوني. (3) فرم الأنسجة إلى قطع صغيرة، حوالي 1 ملم في الحجم. (4) ومن أجل تحرير الخلايا من الأنسجة، نقل قطعة الأنسجة إلى لوحات 35 ملم وإضافة كولاجيناز لهضم ح 3 في الحاضنة. (5) نقل محتويات اللوحة إلى أنبوب مخروطي للطرد المركزي. (6) لوحة بيليه في زجاجة T25 واحتضانها حاء 3 (7) بعد ح 3 الأول للثقافة، وتغيير ثقافة وسائل الإعلام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : هيموسيتوميتير- وتتميز المربعات الصغيرة الخمس تحسب باللون الأحمر.

Figure 3
الشكل 3 : خلية مورفولوجيا. عند تغيير الوسائط ح 3 بعد بداية ثقافة أنها أسفرت عن عدد سكان متجانسة من الخلايا الوسيطة، التي عرضت مورفولوجيا تشبه تنتجها الخلايا الليفية. على العكس من ذلك، عندما يتم تغيير الوسائط الأول بعد 48 ساعة ويمكن ملاحظة أنواع الخلايا الأخرى إلى جانب الخلايا مثل تنتجها الخلايا الليفية. شريط المقياس = 1,000 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من تلة et al. 9- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : الشخصية الجزيئية لماجستير المبيض. (أ) عزل الخلايا معارضها الشخصية علامة كلاسيكية MSC، إيجابيا لثلاث علامات MSC ببكر في الوقت الحقيقي (CD90 و CD105 و CD44). (ب) تحليل البروتين، كان CD44 الإيجابية في تلك الخلايا، وأنها تفتقر إلى التعبير عن اثنين من علامات المكونة للدم (CD34 و CD45). شريط المقياس = 70 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من تلة et al. 9- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 : التفريق بين ماجستير المبيض. الخلايا المعزولة كانت قادرة على التمييز في الأنساب (A) ميسوديرمال (تشوندروجينيك، أوستيوجينيك، أديبوجينيك؛ وشريط المقياس = 70 ميكرومتر). وعلاوة على ذلك، كانت الخلايا قادرة على التمييز في كلا السلائف اندوديرمال (ب) (شريط مقياس = 70 ميكرومتر) والأنساب (ج) العصبية (شريط المقياس = 50 ميكرومتر). من المثير للاهتمام، خضع الخلايا للتفريق بين الخلايا البدائية (د)، مما يدل على قدرة على نطاق واسع من التمايز للخلايا الجذعية الوسيطة المبيض. وقد تم تعديل هذا الرقم من تلة et al. 9- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وهنا نحن نقدم الأدلة أن MSCs يمكن أن تكون معزولة من أنسجة المبيض الكلاب البوليسية، التي تعتبر النفايات البيولوجية بعد أوفاريكتومي. يرجع ذلك إلى حقيقة أن العديد من أنواع الخلايا ويمكن الاطلاع في المبيض، اقترحنا بروتوكول لتحديد MSCs على أساس على الانضمام السريع للبلاستيك، والتي نجحت بتحديد الخلايا التي نمت في أحادي الطبقة مع مورفولوجيا تنتجها الخلايا الليفية مثل.

التقرير الأول لاشتقاق MSCs من نخاع العظام يستند إلى قدرة التصاق البلاستيك MSCs خلال 48 ساعة الأولى من11من الثقافة؛ ومع ذلك، أفيد أن هذا الأسلوب ينطوي على إمكانية عزل سكان غير متجانسة، فينوتيبيكالي ووظيفيا، على الأقل لنخاع العظام12. الأسلوب الثقافة المقترحة أيضا تحديد الخلايا بقدرة التصاق البلاستيك ويعزل الخلايا الوسيطة من نسيج يحتوي على العديد من أنواع الخلايا، دون الحاجة إلى فرز الخلايا المرغوب فيه. يرجع ذلك إلى حقيقة أن الخلايا الجذعية الوسيطة التعبير عن مستقبلات العديدة التي تلعب دوراً هاما في الخلية الالتصاق8، كان الافتراض بأنه إذا اختير عدد خلايا مع التصاق السريع، فإنه سيسفر عن عدد سكان أكثر تجانساً في مرور أول، مع ملف تعريف ماجستير موثوق بها. نتائج الممثل دليلاً أن مقايسة التصاق بلاستيك مدة أقصر يمكن استخدامها لعزل سكان شكلياً متجانسة من MSCs في المقطع الأول، دون الحاجة إلى انتظار الممرات أكثر تقدما أو الخلية الفرز.

خطوة حاسمة في هذا البروتوكول تغيير وسائط الإعلام ح 3 بعد بداية الثقافة. كما هو موضح في المقطع النتائج التمثيلية، أن الخلايا الجذعية التي تم الحصول عليها من المبايض الكلاب اجتمعت المعايير الثلاثة المحددة لتوصيف MSCs: أنها معروضة مورفولوجيا تنتجها الخلايا الليفية مثل وكانت إيجابية بالنسبة لوجود علامات لجنة السلامة البحرية، وكانت قادرة على التمييز في هذه الأنساب الوسيطة الأنساب أوستيوجينيك، أديبوجينيك وتشوندروجينيك. كانت متباينة الخلايا المعزولة في هذه التجربة بنجاح أيضا في السلائف اندوديرمال وعسر الأنساب والسلالات البدائية الخلية الجرثومية. ينبغي أن تصل الخلايا إلى التقاء بعد الطلاء الأولى حوالي 5-7 أيام. الخلايا من الحيوانات مع سن متقدمة قد تنمو ببطء أكثر من تلك الحيوانات الصغار، وأولئك، خلايا أقل يجوز التمسك بالبلاستيك. وفي هذه الحالات، يمكن زيادة تركيز FBS في وسائل الإعلام بنسبة 15 في المائة.

ولذلك يمثل اختيار MSCs استناداً إلى الخلايا مع زيادة سرعة انضمام القدرة على إجراء غير مكلفة ومبسطة وفعالة. ومن منظور علاجي، الأكثر أهمية لتسليط الضوء على أن هذه الخلايا تمثل أداة واعدة للطب التجديدي، لا سيما بسبب ما مجموعة واسعة من التمايز.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

الكتاب يعترف البرنامج تعقيم الكلاب في أونيسب-فكاف يرجى توفير المبايض. وأيد هذا العمل منح من FAPESP (عملية رقم 2013-14293-0) والرؤوس.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DPBS  Thermo Fisher 14190144
Collagenase I Thermo Fisher 17100017
Tissue flask Corning CLS3056
DMEM low glucose Thermo Fisher 11054020
FBS Thermo Fisher 12484-010
TrypLE express Thermo Fisher 12604021
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit Thermo Fisher A1007001
StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit Thermo Fisher A1007101
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit Thermo Fisher A1007201
STEMdiff Definitive Endoderm Kit StemCell 5110
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15070063
CD45 AbD Serotec MCA 2035S
CD34 AbD Serotec MCA 2411GA
CD90 AbD Serotec MCA 1036G
CD44 AbD Serotec MCA 1041
Nestin Milipore MAB353
β-Tubulin  Milipore MAB1637
DDX4 Invitrogen PA5 -23378
IgG- FITC AbD Serotec STAR80F
IgG- FITC AbD Serotec STAR120F

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gazit, Z., Pelled, G., Sheyn, D., Kimelman, N., Gazit, D. Mesenchymal stem cells. Handbook of Stem Cells (2nd Edition). Atala, A., Lanza, R. Academic Press. 513-527 (2013).
  2. Zipori, D. The nature of stem cells: state rather than entity. Nature Reviews Genetics. 5, (11), 873-878 (2004).
  3. Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology. Endocrine Reviews. 22, (2), 255-288 (2001).
  4. Ahmed, N., Thompson, E. W., Quinn, M. A. Epithelial-mesenchymal interconversions in normal ovarian surface epithelium and ovarian carcinomas: an exception to the norm. Journal of Cellular Physiology. 213, (3), 581-588 (2007).
  5. Bukovsky, A., Svetlikova, M., Caudle, M. R. Oogenesis in cultures derived from adult human ovaries. Reproductive Biology and Endocrinology. 3, (1), 17 (2005).
  6. Gong, S. P., et al. Embryonic stem cell-like cells established by culture of adult ovarian cells in mice. Fertility and Sterility. 93, (8), 2594-2601 (2010).
  7. Johnson, J., Canning, J., Kaneko, T., Pru, J. K., Tilly, J. L. Germline stem cells and follicular renewal in the postnatal mammalian ovary. Nature. 428, (6979), 145 (2004).
  8. Deans, R. J., Moseley, A. B. Mesenchymal stem cells: biology and potential clinical uses. Experimental Hematology. 28, (8), 875-884 (2000).
  9. Trinda Hill, A. B. T., Therrien, J., Garcia, J. M., Smith, L. C. Mesenchymal-like stem cells in canine ovary show high differentiation potential. Cell Proliferation. 50, (6), 12391 (2017).
  10. Dominici, M. L. B. K., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 4315-4317 (2006).
  11. Friedenstein, A. J., Piatetzky-Shapiro, I. I., Petrakova, K. V. Osteogenesis in transplants of bone marrow cells. Development. 16, (3), 381-390 (1966).
  12. Kuznetsov, S. A., et al. Single-colony derived strains of human marrow stromal fibroblasts form bone after transplantation in vivo. Journal of Bone and Mineral Research. 12, (9), 1335-1347 (1997).
الاشتقاق وتمايز الخلايا الجذعية الوسيطة المبيض الكلاب
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hill, A. B. T., Hill, J. E. B. T., Bressan, F. F., Miglino, M. A., Garcia, J. M. Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (142), e58163, doi:10.3791/58163 (2018).More

Hill, A. B. T., Hill, J. E. B. T., Bressan, F. F., Miglino, M. A., Garcia, J. M. Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (142), e58163, doi:10.3791/58163 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter