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Developmental Biology

파생 및 개 난소 중간 엽 줄기 세포의 분화

doi: 10.3791/58163 Published: December 16, 2018

Summary

여기, 우리가 격리, 확장, 및 개 난소 조직 으로부터 간 엽 줄기 세포의 분화 하는 방법을 설명합니다.

Abstract

중간 엽 줄기 세포 (MSCs)에 대 한 관심은 절연, 확장, 및 문화의 그들의 용이성으로 인해 지난 10 년간 증가 했다. 최근에, 연구는 이러한 세포 넓은 차별화 용량을 증명 하고있다. MSCs에서 풍부 하 고 생물학 낭비로 ovariectomy 수술 후 자주 취소 됩니다는 사실 때문 난소 세포 기반 치료를 위한 유망한 후보자를 나타냅니다. 이 문서에서는 격리, 확장에 대 한 절차를 설명 합니다 및 MSCs의 세포 분류의 필요성 없이 개 난소에서 파생 된 기술. 이 프로토콜은 임상 시험에서이 매우 구별할 세포의 광범위 한 적용으로 인해 재생 의학에 대 한 중요 한 도구 나타내고 치료 사용.

Introduction

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줄기 세포에 초점 년간 과거, 강력한 재생 의학 치료 발견의 집단 목표에 의해 연료 되었습니다 연구 노력을 실질적으로 증가 했다 출판된 연구의 수입니다. 줄기 세포는 두 개의 기본 정의 마커: 자기 혁신과 차별화. 중간 엽 줄기 세포 정기 조직 회전율에 대 한 책임은 고1배아 줄기 세포 비해 분화의 보다 제한 된 용량을가지고. 최근에, 많은 연구 다양 한 MSCs의 그리고 논의 중인 주제는 배아 및 성체 줄기 세포 간의 차이점 모든2에 존재 하는 여부.

Ovarium 표면 상피는 커밋되지 않은 세포의 층, 상대적으로 덜 분화, 두 상피와 중간 엽 마커3, 유지 하는 다른 종류의 세포에 대 한 응답에서으로 분화 하는 능력을 표현 하는 환경 신호4. 줄기 세포는 난소에서의 정확한 위치는 잘 알려진; 그러나, 그것은 bipotential 창시자 tunica albuginea에서 생식 세포5일으키 제안 되었습니다. 이러한 셀 stromal 기원6 또는에 있는 또는 난소 표면7에 인접 면역학 연구 가설 있다. 이후 중간 엽 줄기 세포 세포 접착8에 중요 한 역할을 재생 하는 수많은 수용 체를 표현, 실험 가설을 급속 한 접착을 가진 세포의 인구를 선택 하면 명확 하 게 세포의 인구를 분리 하는 것을 테스트 하도록 설계 되었습니다. 실제로 엽으로 characterizable. 최근, 우리의 그룹 문화의 첫 번째 3 h 문화 접시의 플라스틱 표면에 접착의 급속 한 접착9전시 세포의 순화 된 인구를 얻기 위하여 그들의 용량에 따라 난소 조직에서 MSCs의 파생을 했다. 여기는 난소 조직 으로부터 간 엽 줄기 세포 분리를 위한 개발된 방법에 설명합니다.

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Protocol

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이 실험은 4 개의 잡종 여성 개 개 살 균 프로그램에 선택 수술 후 기증의 난소와 함께 수행 되었다. 이 실험은 UNESP-FCAV (프로토콜 번호 026991/13)의 동물의 사용에 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.

1. 실험 준비

  1. 준비 하거나 메 마른 Dulbecco 인산 염 버퍼 식 염 수 (DPBS) 칼슘 또는 마그네슘의 500 mL를 구매 합니다.
  2. 준비는 콜라 나 DPBS의 1 mL에 효소의 40 µ g을 혼합 하 여 솔루션을 재고. 0.2 µ m 주사기 필터를 사용 하 여 필터링 하 고 저장 2 mL aliquots-20 ° c.에
  3. 항생제의 1%와 10% 태아 혈 청 Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM) 낮은 혈당에서 배양을 준비 합니다.
  4. 살 균 자료 수집:가 위, 집게, 조직 배양 플라스 크, 요리, 튜브, 그리고 5 mL와 10 mL 펫.
  5. 표준 셀 문화 실험실 장비를 사용 하 여: 생물 안전 캐비닛 (BSC), 5% CO2 와 38 ° C 원심 분리기에서 설정 셀 문화 인큐베이터.
  6. BSC를 청소: 70% 소독 장갑 낀 손으로 EtOH, UV 빛을 사용 하 여.

2. 난소에서 중간 엽 줄기 세포의 분리

  1. 수술 후, 실험실에서 그들의 도착까지 난소 원뿔 튜브에 얼음에 PBS에 계속.
  2. PBS의 10 mL로 두 100 mm 페 트리 접시를 채우십시오.
  3. 튜브에서 난소를 제거 하 고 PBS 가진 첫 번째 페 트리 접시에 그들을 전송. 움직임을 혼합 함께 그들을 씻어.
  4. 부드럽게 난소를 검색 하 고 다른 접시에 놓습니다. 멸 균 핀셋과가 위, 아주 작은 조각, 약 1 m m 크기에서에 조직을 말하다.
  5. 난소 조직 35 mm 페 트리 접시에 전송 하 고 콜라의 2 개 mL를 추가. 좀 더 조직을 말하다.
  6. 3 h는 38 ° C에 인큐베이터에서 배양 접시를 놓고 부드럽게 원형 움직임 마다 20 분 페 트리 접시를 흔들.
  7. 3 h 후 인큐베이터에서 배양 접시를 제거 합니다.
  8. 15 mL 튜브에 접시의 내용을 전송 합니다. 확장 미디어의 5 mL를 추가 합니다.
  9. 부드럽게 원심 분리 전에 튜브 반전. 원심에서 2100 x g 7 분 제거 튜브는 상쾌한 고 확장 미디어의 3 mL와 펠 릿을 resuspend.
  10. T25 병에 펠 릿을 전송 합니다. 5%와 인큐베이터에 병을 배치 3 h 38 ° C에서 CO2 .
    참고: 프로시저의 가장 중요 한 부분은 외피의 3 h 후 미디어를 변경 하는.
  11. 인큐베이터에서 병을 제거 하 고 나머지 조직으로 미디어를 제거 합니다. 병에 신선한 확장 미디어의 3 mL를 추가 합니다.
  12. 미디어 모든 48 h 변경 하 고 관찰 셀룰러 합류에 대 한 병.
    참고: 절차의 주요 단계는 그림 1에서 볼 수 있습니다.

3. 난소에서 중간 엽 줄기 세포의 확장

  1. 셀 통로
    1. 셀 합류에 도달, 병에서 미디어를 제거 합니다.
    2. PBS의 3 mL 병을 씻어. PBS를 제거 합니다.
    3. 트립 신 고 3 분에 38 ° C에 인큐베이터에서 병 부드럽게 탭 분리를 셀 수 있도록 병의 1.5 mL를 추가 합니다.
      참고: 셀 합류 약 5-7 d 초기 도금 후에 도달 한다.
    4. 확장 미디어의 3 mL를 추가 하 고 내용을 원뿔 튜브에 전송.
    5. 원심에서 2100 x g 7 분 제거 튜브는 상쾌한 고 확장 미디어의 1 mL를 추가 합니다.
    6. 부드럽게 튜브의 내용을 균질.
    7. 세 고 인큐베이터에 다시 세포와 함께 튜브를 넣어 셀을 수행 하기 위해 샘플의 10 µ L의 약 수를 가져가 라.
    8. hemocytometer로 믹스의 장소 10 µ L.
  2. 셀 계산
    1. 현미경의 10 X 목표를 사용 하 고는 hemocytometer의 눈금선에 초점.
    2. 5 개의 작은 사각형 (그림 2)에 있는 셀을 계산 합니다.
    3. 50, 000 밀리 리터 당 셀의 수를 추정 하 여 계산된 수를 곱하면.

4. 난소에서 중간 엽 줄기 세포의 분화

참고: 차별화 분석 힐 에 설치 하는 지침에 따라 수행 했다 9.

  1. 잘, 3 중, 4 잘 문화 접시를 사용 하 여 당 씨 1.0 x 104 셀.
  2. 확장 미디어의 1 mL를 추가 합니다.
  3. 부드럽게 원형 움직임으로 접시를 교 반 하십시오.
  4. 24 시간 후 문화 미디어를 바람직한 차별화 미디어 바꿉니다.
  5. 대 한 osteogenic, adipogenic, 및 chondrogenic 분화, 품 어 30 d 유도 미디어 셀, 미디어 교체와 함께 모든 3 디 특정 차별화 키트가 분석이 실험의 각을 위해 사용 되었다.
  6. Neurogenic 혈통 차별화 유도 미디어 미디어 교체 매 3 d와 함께 10 일에 대 한 셀을 품 어. 여기에서 사용 하는 미디어 DMEM 낮은 포도 당, 2 mM valproic 산, 1 µ M 날린, 10 µ M 산림, 염화 칼륨 5 m m, 5 µ g/mL 인슐린, 그리고 200 µ M 자 hydroxyanisole 포함 되어 있습니다.
  7. Endoderm 선구자, 5 d 시 약 제조업체의 지침에 따라 endoderm 미디어에서 품 어.
  8. 원시 생식 세포 계보 차별화 유도 미디어 미디어 교체 매 3 d와 14 d 셀을 품 어. 여기에서 사용 하는 미디어 포함 된 DMEM, 10 %FBS, 1mm 나트륨 pyruvate, 10 ng/mL LIF, 1mm 불필요 한 아미노산, 2 m L-글루타민 m, 5 µ g/mL 인슐린, 0.1 m m β-mercaptoethanol, 60 µ M putrescine, 20 µ g/mL 올려진다, 10 ng/mL 마우스 표 피 성장 인자, 인간의 1 ng/mL 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자, 40 ng/mL 인 glial 세포 선 파생 된 neurotrophic 요인, 및 15 mg/L 페니실린.

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Representative Results

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송곳 니 난소에서 중간 엽 줄기 세포 분리:

난소 MSC 격리 절차는 그림 1에 요약 됩니다. 수술, 조직 닦지, 콜라 소화, 그리고 미디어 변화는 문화의 시작 후 3 h, 후 빠른 플라스틱 접착제 속성 상 상속 MSC 인구는 성공적으로 개 난소 조직 으로부터 격리. 빠르게 수확된 셀 문화 접시의 플라스틱 표면에 준수 하 고 전형적인 MSC와 같은 형태 (그림 3)과 형태학 상으로 균질 단층 문화로 성장 했다.

난소 MSC의 특성 생체 외에서

MSC 특성의 목표는 고립 된 셀 표준 MSC 기준에 부합 되도록입니다. 플라스틱, 엽 표면 마커, 긍정적인 탐지 조 혈 표면 표식 부재 뿐만 아니라 mesodermal 차별 받아야 용량 준수 포함 됩니다.

그림 3에서 같이, 난소에서 파생 된 셀 플라스틱에 부착 되었고 전시 MSCs를 정의 하는 첫 번째 기준은 행 구와 같은 형태학. 또한, 고립 된 세포 CD44, CD90, CD105 개 MSC 표식에 대 한 성적 표현을 했다. 또한, MSC 관련 세포 표면 항 원 CD90와 CD44 초기 통로 FACS 분석 및 immunocytochemistry에 의해 발견 했다. CD45와 CD34, 특정 조 혈 모 세포 표면 항 원, 마커의 부재 또한 동일한 기술을 (그림 4)에 의해 확인 되었다. 이 추가 난소 세포는 MSC 관련 phenotype9표현 포함 확인. 개 MSC 특성화에 대 한이 실험에서 사용 된 항 체에 나열 되는 테이블의 자료.

MSCs의 특성의 다음 단계 mesodermal 혈통으로 차별 하는 그들의 능력의 증거를 달성 하는 것입니다. 문화와 혈통 프로그램별 차별화 프로토콜에서 노출 30 일 후 얼룩이 다른 계보 (그림 5A)에 대 한 헌신을 식별 하기 위해 수행 되었다. Osteogenic 혈통에 대 한 헌신은 폰 Kossa 얼룩, 칼슘 예금 확인을 통해 확인 됐다. Chondrogenic 약속 확인 safranin O proteoglycan 얼룩 그리고 adipogenic 약속 확인 기름 빨간 O 지질 얼룩. 이러한 세포의 differentiability의 조사를 계속, 그들이 ectodermic 혈통으로 차별 받을 수 두 neuroectodermal 줄기 세포 표식에 대 한 immunostaining에 의해 표시 된 대로: β-tubulin 그리고 Nestin, 다음의 노출 10 일 (그림 5C) 신경 혈통 차별화 프로토콜에 난소에서 파생 된 MSCs SOX17 및 CD184, 뿐만 아니라 endodermal 혈통, 특정 세포 형태학에 대 한 성적 증명서는 5 일 (그림 5B)에 대 한 특정 분화 프로토콜에 노출 후 관찰 되었다. 마지막으로, 14 일의 노출의 난소 파생 후 MSCs 세균을 세포 유도 미디어, 10 월 4와 DDX4 확인 되었다 (그림 5D). 함께, 이러한 결과 MSCs 특정 분화 프로토콜9에 노출 되 면 난소 조직에서 파생 된에 대 한 차별화의 강력 하 고 다양 한 용량을 지원 합니다.

Figure 1
그림 1 : 격리 절차의 주요 단계. (1) 수술 후 얼음에 PBS 가진 무 균 튜브에 난소를 전송. (2) 난소, 세척 하기 위하여 그들은 PBS 가진 100 mm 접시에 전송 한다. (3) 작은 조각, 약 1 m m 크기에서에 조직을 말하다. (4) 조직에서 세포를 해방 하기 위하여 35 mm 판 조직의 조각을 전송 하 고 인큐베이터에서 3 h 소화에 콜라를 추가 합니다. (5) 원심 분리에 대 한 원뿔 관에 접시의 내용을 전송 합니다. (6) 접시 T25 병에 펠 릿 및 문화의 첫 번째 3 h 후 3 헤 (7)에 대 한 품 어, 문화 미디어 변경. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : Hemocytometer. 계산에 5 개의 작은 사각형은 빨간색으로 표시 됩니다.

Figure 3
그림 3 : 세포 형태학. 때 미디어 문화 중간 엽 세포, 섬유 아 세포와 같은 형태를 전시의 균질 인구 결과의 시작 후 3 h 변경 되었습니다. 그와 반대로, 첫 번째 미디어 변경 48 h 후 완료 되 면 섬유 아 세포와 같은 세포 외 다른 세포 유형 관찰할 수 있습니다. 눈금 막대 = 1000 µ m. 이 그림 힐 에서 수정 되었습니다. 9. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 : 난소 MSC의 분자 프로 파일. (A)는 고립 된 세포 전시 3 MSC 마커 (CD90, CD105, CD44) 실시간 PCR에 의해 긍정 되는 고전적인 MSC 마커 프로필. (B) 단백질 분석, CD44 긍정적인 셀, 그리고 그들은 2 개의 조 혈 마커 (CD34 및 CD45)의 표현 부족. 눈금 막대 = 70 µ m. 이 그림 힐 에서 수정 되었습니다. 9. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5 : 난소 MSC의. 격리 된 셀 (A) mesodermal 계보를 분화 할 수 있었다 (osteogenic, chondrogenic 그리고 adipogenic; 눈금 막대 = 70 µ m). 또한, 세포 모두 (B) endodermal 선구자로 분화 할 수 있었다 (눈금 막대 = 70 µ m) 및 (C) neurogenic 계보 (눈금 막대 = 50 µ m). 흥미롭게도, 셀 (D) 원시 생식 세포 분화를, 난소 중간 엽 줄기 세포에 대 한 차별화의 넓은 용량을 입증 받았다. 이 그림 힐 에서 수정 되었습니다. 9. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

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여기 증거 MSCs ovariectomy 후 생물 학적 폐기물 이라고 여겨진다 개 난소 조직 으로부터 격리 될 수 있습니다 제공 합니다. 사실은 많은 세포 유형 난소에서 찾을 수 있습니다, 우리 구와 같은 형태와 단층에서 성장 하는 셀을 성공적으로 선택, 플라스틱에 그들의 급속 한 준수에 따라 MSCs를 선택 하는 프로토콜을 제안 했다.

골 수에서 MSCs의 파생의 첫 번째 보고서는 문화11;의 첫 번째 48 h 동안 MSCs의 플라스틱 접착 용량에 따라 그러나,이 방법은 이종 인구 phenotypically 및 분리 기능, 적어도 골12에 대 한 잠재력을가지고 보고 되었습니다. 제안 된 문화 메서드는 또한 플라스틱 접착 용량으로 셀을 선택 하 고 있는 바람직한 셀 정렬의 필요성 없이 많은 세포 유형, 조직에서 중간 엽 세포를 분리. 사실은 세포 접착8에 중요 한 역할을 재생 하는 수많은 수용 체를 표현 하는 중간 엽 줄기 세포, 급속 한 접착을 가진 셀의 인구 선택 했다, 그것은에서 더 균질 인구 귀 착될 것입니다 그 가설 이었다는 첫 번째 통로, 신뢰할 수 있는 MSC 프로필입니다. 대표 결과 짧은 기간 플라스틱 접착 시험 고급 구절에 대 한 대기의 필요성 없이 첫 대목에서 MSCs의 형태학 상으로 균질 인구를 분리 하는 데 사용할 수 있습니다 또는 정렬 셀 증거를 제공 합니다.

이 프로토콜에서 중요 한 단계는 문화의 시작 후 3 h 미디어를 변경 하는. 대표적인 결과 섹션 에서처럼 개 난소에서 얻은 줄기 세포 조건에 3 MSCs의 특성에 대 한 설립: 그들은 섬유와 같은 형태를 전시, MSC 마커의 존재에 대 한 긍정적인 했다 고 했다 osteogenic, adipogenic 및 chondrogenic 혈통으로 계보 같은 엽으로 차별화 하는 수 있습니다. 이 실험에서 고립 세포 endodermal 선구자, ectodermal 계보, 및 원시 생식 세포 계보에도 성공적으로 분화 되었다. 셀 초기 도금 후 약 5-7 일 합류를 도달 한다. 고급 나이 가진 동물에서 세포 수 있습니다 젊은 동물의 그들 보다는 더 느리게 성장 하 고, 그의 적은 셀 플라스틱을 준수 수 있습니다. 이러한 경우에는 미디어에서 FBS의 농도 15%로 늘릴 수 있습니다.

따라서, 더 빠른 준수 용량 셀에 따라 MSCs에 대 한 선택, 유선형, 저렴 하 고 효과적인 절차를 나타냅니다. 치료 관점에서이 세포 감 별 법의 그들의 넓은 범위 때문에 특히 재생 의학에 대 한 유망한 도구 나타내는 강조 하기 위해 가장 중요 하다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

저자는 친절 하 게 제공 하는 난소 UNESP FCAV의 개 살 균 프로그램을 인정 합니다. 이 작품은 FAPESP (프로세스 번호 2013/14293-0)와 망 토에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DPBS  Thermo Fisher 14190144
Collagenase I Thermo Fisher 17100017
Tissue flask Corning CLS3056
DMEM low glucose Thermo Fisher 11054020
FBS Thermo Fisher 12484-010
TrypLE express Thermo Fisher 12604021
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit Thermo Fisher A1007001
StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit Thermo Fisher A1007101
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit Thermo Fisher A1007201
STEMdiff Definitive Endoderm Kit StemCell 5110
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15070063
CD45 AbD Serotec MCA 2035S
CD34 AbD Serotec MCA 2411GA
CD90 AbD Serotec MCA 1036G
CD44 AbD Serotec MCA 1041
Nestin Milipore MAB353
β-Tubulin  Milipore MAB1637
DDX4 Invitrogen PA5 -23378
IgG- FITC AbD Serotec STAR80F
IgG- FITC AbD Serotec STAR120F

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References

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Hill, A. B. T., Hill, J. E. B. T., Bressan, F. F., Miglino, M. A., Garcia, J. M. Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (142), e58163, doi:10.3791/58163 (2018).More

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