Summary
Per verificare gli effetti inibitori di agenti farmacologici sulla fosfolipasi C (PLC) in diverse regioni del cervello dell'ape mellifica, presentiamo un'analisi biochimica per misurare l'attività del PLC in quelle regioni. Questo test potrebbe essere utile per confrontare attività PLC tra tessuti, così come tra le API che esibiscono comportamenti diversi.
Abstract
L'ape è un organismo modello per la valutazione di comportamenti complessi e funzioni cerebrali superiori, come apprendimento, memoria e divisione del lavoro. Il corpo del fungo (MB) è un centro superiore di cervello proposto per essere il substrato neurale dei comportamenti complessi dell'ape mellifica. Sebbene studi precedenti identificati geni e proteine differenzialmente espressi in MBs e altre regioni del cervello, l'attività delle proteine in ogni regione non sono ancora pienamente compreso. Per rivelare le funzioni di queste proteine nel cervello, analisi farmacologica sono un approccio fattibile, ma è prima necessario confermare che le manipolazioni farmacologiche infatti alterano l'attività della proteina in queste regioni del cervello.
Abbiamo precedentemente identificato un' più alta espressione di geni che codificano la fosfolipasi C (PLC) in MBs che in altre regioni del cervello e farmacologicamente valutato il coinvolgimento di PLC nel comportamento dell'ape mellifica. In quello studio, abbiamo biochimicamente testato due agenti farmacologici e confermato che hanno attività in diminuzione PLC in MBs e altre regioni del cervello. Qui, presentiamo una descrizione dettagliata di come rilevare attività PLC in omogeneato del cervello dell'ape mellifica. In questo sistema di dosaggio, omogeneati derivati dalle regioni differenti del cervello sono ha reagiti con un substrato fluorogenico sintetico e fluorescenza risultanti da attività PLC è quantificato e rispetto tra regioni del cervello. Inoltre descriviamo la nostra valutazione degli effetti inibitori di determinate droghe sulle attività del PLC utilizzando lo stesso sistema. Anche se questo sistema è probabilmente influenzata da altri composti endogeni fluorescenza e/o l'assorbanza dei tessuti e dei componenti di analisi, la misurazione dell'attività PLC utilizzando questo sistema è più sicuro e più facile che quello usando l'analisi tradizionale, che richiede substrati radioattivi. La procedura semplice e manipolazioni consentono di esaminare l'attività PLC nel cervello ed in altri tessuti delle API da miele coinvolti in diverse attività sociali.
Introduction
L'ape europea (Apis mellifera L.) è un insetto eusociali e API femminile mostrano una riproduzione casta-dipendente ed età-dipendente divisione del lavoro. Ad esempio, nella casta sterile delle API che si riferisce come "lavoratori", i più giovani individui feed nidiate mentre quelli più vecchi foraggio nettare e polline fuori l' alveare1. Apprendimento e memoria capacità è criticamente importante nella vita dell'ape, perché api bottinatrici devono ripetutamente ad andare avanti e indietro tra fonti alimentari e loro nido e quindi comunicare le posizioni delle origini di buon cibo ai loro membri ancora in vita attraverso la danza comunicazione1. Gli studi precedenti hanno dimostrato che il MB, un centro superiore di cervello negli insetti, è coinvolto nella capacità di apprendimento e la memoria del honeybee2,3,4. Proteine e geni differenzialmente espressi sono stati identificati in varie regioni del cervello del honeybee5,6,7,8,9,10 ,11, suggerendo che sono collegate alle funzioni uniche di ogni regione del cervello. Sebbene l'inibizione farmacologica o l'attivazione di una proteina di interesse è un approccio ben utilizzato per rivelare la funzione della proteina dell'ape mellifica comportamento12,13,14, non si sa se tutti farmaci hanno effetti funzionali in diverse regioni del cervello dell'ape mellifica. La convalida delle funzioni di tali farmaci rafforzerà conclusioni negli studi di farmacologia comportamentale.
Qui, ci concentriamo su PLC, uno degli enzimi implicati in mouse cognizione15,16,17,18. PLC attiva segnalazione degradando fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato (PIP2) in inositolo 1,4,5-trisfosfato (IP3) e diacilglicerolo (DAG)19,20,21calcio. IP3 apre recettori di3 IP il reticolo endoplasmatico (ER), che conduce al rilascio di ioni calcio dall'ER. Il calcio rilasciato attiva sia calcio/calmodulina-dipendente della proteina chinasi II (CaMKII) con calmodulina e protein chinasi C (PKC) in presenza di DAG. Entrambi chinasi di proteina sono coinvolti nell'apprendimento e nella memoria22,23, coerente con il coinvolgimento di PLC in questo processo. PLC sono suddivisi in sottotipi, tra cui PLCβ, PLCγ e PLCε, basato sulle loro strutture20. Ogni sottotipo PLC viene attivato in un contesto diverso20e geni che codificano per tali sottotipi sono differenzialmente espressi in tessuti differenti. Precedentemente abbiamo dimostrato che honeybee MBs esprimono geni che codificano per sottotipi PLCβ e PLCε a livelli più alti del restante cervello regioni24, e che due inibitori di pan-PLC (edelfosine e neomicina solfato [neomicina]) diminuiscono PLC attività in differenti regioni del cervello e, infatti, influenzare la capacità di apprendimento e la memoria del honeybee24.
Tradizionalmente, l'attività enzimatica di PLC è stato misurato usando radiomarcato PIP225, che richiede strutture, attrezzature e formazione adeguata. Recentemente, un substrato fluorogenico sintetico di PLC è stato stabilito26, rendendo facile valutare l'attività PLC in laboratorio standard. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per rilevare l'attività PLC nelle regioni differenti del cervello dell'ape usando il substrato fluorogenic e successivamente testare gli effetti inibitori di edelfosine e neomicina su PLC in questi tessuti. Poiché il protocollo richiede solo manipolazioni di base, può essere applicabile agli studi di PLC attività in altri tessuti o aree del cervello nelle API assegnate ai diversi compiti sociali.
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Protocol
1. acquisizione delle api bottinatrici
- Acquisto di colonie di API da un distributore locale.
- Utilizzando una rete dell'insetto, prendere le API forager che tornano all'alveare con i sacchetti di polline sulle zampe posteriori. Trasferire le API a un tubo conico in plastica da 50 mL standard e richiudere la provetta (Figura 1). Inserire il tubo sul ghiaccio per anestetizzare le API.
Nota: Indossare le giacche designate per l'apicoltura evitare punture di API. Professione d'infermiera API possono anche essere raccolte a seconda dell'esperimento. Cattura le API di infermiera, osservare il comportamento dell'ape sul pettine di cera e rilevare API infermiera, che attizzare le loro teste in cellette per nutrire le larve, dall'ala o torace con una pinzetta. Quindi, posizionare le API in un tubo di plastica da 50 mL, richiudere la provetta e mettilo nel ghiaccio, come indicato al punto 1.2. - Cattura 12 raccoglitrici in modo casuale.
Nota: Questo protocollo utilizza due API per lotto, risultante in sei lotti. Le API multiple possono essere catturate in una provetta, e il numero delle API in un singolo tubo non è importante, come le API in ogni lotto vengono combinate più tardi (Vedi punto 3.1.1). Mantenere il fresco di tubo in estate, come l'alta temperatura nel tubo ferisce le API.
2. dissezione del cervello dell'ape mellifica
- In laboratorio, posizionare il tubo da 50 mL in ghiaccio per almeno 30 min6 ad anestetizzare le API.
- Per preparare la fase di dissezione, piegare un pezzo di Cera dentaria a metà (la dimensione risultante è circa 3.5 x 7,5 cm) e spingerlo in un piatto di plastica (60 x 15 mm).
Nota: La cera piegata tiene saldamente gli spilli entomologici. - Sotto un microscopio binoculare, separare la testa dell'ape dal suo corpo con le pinzette e fissarlo sulla cera dentale inserendo spilli entomologici alla base di ogni antenna per tenere l'anteriore della testa in una posizione verso l'alto (Figura 2A).
Nota: Lavare le pinzette prima dell'uso, utilizzando etanolo o acqua sterilizzata. - Versare abbastanza soluzione salina (0,13 mol/L NaCl, KCl di 5 mmol/L e 1 mmol/L CaCl2-2 H2O) sulla testa per coprirlo. Bucare la testa ancora una volta con i perni se la testa galleggia nella soluzione. Utilizzare una soluzione salina ghiacciata, se necessario.
Nota: Tuttavia, questo protocollo funziona senza la soluzione salina fredda. - Rimuovere le antenne con pinzette (Figura 2B).
- Fare un taglio orizzontale vicino le basi delle antenne e longitudinalmente al bordo degli occhi compound, usando un bisturi. Quindi, fare un taglio orizzontale nella parte superiore della testa. Rimuovere la cuticola per aprire una finestra sopra il cervello (Figura 2C).
Nota: Se necessario, lavare il bisturi con etanolo o acqua sterile prima dell'uso. - Rimuovere le retine dagli ocelli e le trachee sulla superficie anteriore del cervello, usando la pinzetta (Figura 2D).
- Espandere il taglio al bordo degli occhi compound dorsalmente e ventralmente, utilizzando il bisturi (Figura 2E). Successivamente, rimuovere il tessuto connettivo tra la cuticola degli occhi compound e retine inserendo le pinzette direttamente sotto la cuticola dell'occhio (Figura 2F).
- Scartare la cuticola degli occhi compound. Scegli le punte dorsale delle retine degli occhi compound con pinzette e spostare le pinzette in direzione ventrale per rimuovere con cautela le retine (Figura 2G).
- Rimuovere con cautela le trachee rimanenti sulla superficie anteriore del cervello, usando la pinzetta (Figura 2H).
- Tagliare il tessuto connettivo tra il cervello e intorno ai tessuti, con una pinzetta e sezionare il cervello dalla testa capsula (Figura 2H).
- Staccare le trachee sulla superficie posteriore del cervello, con le pinzette (Figura 2ho).
- Con un bisturi, tagliare la connessione tra la MBs e altre regioni del cervello accanto i lobi verticali, che sono una parte di MBs (Figura 2J).
- Posto la MBs dissecato e restanti tessuti cerebrali in provette da 1,5 mL e rapidamente congelarli con ghiaccio secco o azoto liquido (Figura 2K). Conservare i tessuti congelati a-80 ° C fino all'utilizzo.
Nota: Maneggiare azoto liquido con i guanti designati e la ventilazione per evitare il soffocamento e ustione fredda. Ghiaccio secco anche dovrebbe essere maneggiato con cura con i guanti. Il protocollo può essere messo in pausa qui. La dissezione e la conservazione del cervello tessuti dovrebbero essere eseguita uno ape alla volta per evitare la degradazione della proteina.
3. preparazione degli omogeneati del cervello
- Aggiungere 10 µ l di buffer di omogeneizzazione che comprende 50 mmol/l HEPES-KOH (pH 7,2), 70 mmol/L KCl e 1,0 mmol/L CaCl2 a frozen del tessuto del cervello e omogeneizzare il tessuto nel tubo da 1,5 mL applicando manualmente la pressione con un pestello di plastica. Corsa il tessuto almeno 200 x.
Nota: Eseguire le modifiche descritte nella sezione 3 sul ghiaccio. Utilizzare un pestello in raccordo nel tubo sufficientemente distruggere i tessuti, che facilmente galleggiare nel buffer di omogeneizzazione.- Trasferire la soluzione di tessuto omogeneizzato al tessuto successivo nel lotto ed omogeneizzare il tessuto allo stesso modo.
Nota: L'API in ogni lotto vengono combinate in questa fase. Questo protocollo utilizza sei lotti.
- Trasferire la soluzione di tessuto omogeneizzato al tessuto successivo nel lotto ed omogeneizzare il tessuto allo stesso modo.
- Aggiungere 30 µ l di buffer di omogeneizzazione.
- Centrifugare il campione di tessuto omogeneizzato per 10 min a circa 900 x g27 e 4 ° C.
- Trasferire il surnatante in una nuova provetta 1,5 mL e centrifugare esso nuovamente per 20 min a circa 9.500 x g27 e 4 ° C.
- Posto il surnatante in una nuova provetta 1,5 mL. Memorizzare l'omogeneizzato a-20 ° C fino all'utilizzo.
Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. - Determinare la concentrazione di proteina usando l'analisi (BCA) acido bicinconinico.
- Diluire 2,5 µ l di omogenato con 17,5 µ l di acqua sterilizzata (così diluire l'omogeneizzato ottuplo) e utilizzare tutti i l'omogenato diluito.
Nota: Campionamento omogeneato utilizzando una micropipetta deve essere eseguita con cura a causa della sua elevata viscosità. - Eseguire l'analisi BCA utilizzando 0, 0,1, 0,2, 0,4, 1,0 e 2,0 mg/mL di albumina di siero bovino (BSA) in 20 µ l come standard.
Nota: Modifica la scala del dosaggio BCA come necessario, basato sul volume dell'omogeneato e campioni standard. Il protocollo può essere messo in pausa qui.
- Diluire 2,5 µ l di omogenato con 17,5 µ l di acqua sterilizzata (così diluire l'omogeneizzato ottuplo) e utilizzare tutti i l'omogenato diluito.
4. PLC reazione in omogeneati del cervello
- Preparare la soluzione di riserva della fluorogenic substrato WH-1526 disciolto in acqua sterilizzata a 50 µmol/L e conservare a-80 ° C.
Nota: Coprire le soluzioni contenenti il substrato con stagnola per evitare la sbiadisc. - Preparare la premiscela di reazione nel volume richiesto per raggiungere la seguente composizione in 10 µ l di miscela di reazione: 50 mmol/L HEPES-KOH (pH 7,2), 70 mmol/L KCl, 1,0 mmol/L CaCl2, 2,0 mmol/L dithiothreitol, 50 mg/L BSA e 12,5 µmol/L WH-15.
- Diluire l'omogeneizzato con buffer di omogeneizzazione, se necessario.
- Mescolare la premiscela di reazione e l'omogenato contenente 1,3 µ g di proteine in un tubo di reazione a catena (PCR) polimerasi per ottenere un volume finale di 10 µ l di miscela di reazione.
- Preparare due tipi di miscele di controllo per l'analisi statistica: mettere l'omogenato ma non WH-15 nella miscela (controllo miscela 1) e viceversa (controllo miscela 2).
Nota: Preparare le miscele di reazione e miscele di controllo sul ghiaccio per impedire la degradazione della proteina e la reazione del PLC. Miscele di controllo 1 e 2 sono utilizzate per rilevare la fluorescenza dall'omogenato e substrato libero, rispettivamente.
- Preparare due tipi di miscele di controllo per l'analisi statistica: mettere l'omogenato ma non WH-15 nella miscela (controllo miscela 1) e viceversa (controllo miscela 2).
- Lavare il tubo e viene quindi incubato in un termociclatore per 30 min a 25 ° C.
- Fermare la reazione aggiungendo 2 µ l di bis di glicole etilenico 25 mmol/L (β-aminoethylether)-N, N, N', N'-acido etilendiamminotetraacetico.
Nota: Proteina adeguata quantità e tempi di reazione variano tra esperimenti. Così, per ottimizzare le condizioni di reazione, potrebbe essere necessario ripetere le procedure descritte nei passaggi 4.1-5.3 negli esperimenti preliminari modificando l'importo e l'incubazione ora proteina fino a quando la fluorescenza aumenta linearmente. Per riferimento, quando viene utilizzato l'omogenato derivato da altre regioni del cervello, la reazione di solito funziona linearmente con 1,3 µ g o meno delle proteine all'interno di 30 min, ma la linearità diminuisce almeno 2,7 µ g di proteine o con un tempo di incubazione di 90 min o nger.
5. rilevazione della fluorescenza risultanti da attività PLC
- Centrifugare la miscela di reazione e le miscele di controllo per 5 min a circa 310 x g28 e trasferire 10 µ l del surnatante a diversi pozzetti su una micropiastra 384 pozzetti applicabile per la rilevazione della fluorescenza.
Nota: Per evitare di dissolvenza e una contaminazione con polvere, coprire la piastra con un foglio. - Lavare la micropiastra utilizzando una centrifuga per la micropiastra.
- Mettere la piastra in un lettore di micropiastre e rilevare la fluorescenza con un triplice copia tecnica.
Nota: Le lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione sono 344 nm e 530 nm, rispettivamente. Se applicabile (a seconda del lettore di micropiastre), mescolare le miscele campione per 5 s prima di ogni rilevazione. Il protocollo può essere fermato qui.
6. test dell'azione inibitoria di agenti farmacologici
- Preparare soluzioni di riserva di edelfosine e neomicina alle concentrazioni appropriate e conservarli fino all'utilizzo: edelfosine a 5,0 mmol/L e -20 ° C; neomicina 550 mmol/L e 4 ° C.
- Quando si prepara la premiscela di reazione come descritto al punto 4.2., aggiungere gli inibitori di premiscela per ottenere le concentrazioni finali di appropriato: edelfosine, 1,0 mmol/L; neomicina, 0.55 mmol/L.
- Aggiungere l'omogeneizzato per le miscele di reazione premiscela e appropriato controllo come descritto al punto 4.4.
- Preparare tre tipi di miscele di controllo: mettere l'omogeneizzato e inibitore, ma non il substrato in miscela di controllo 1; aggiungere il substrato ed inibitore ma non omogeneizzato controllo composto 2; e mettere l'inibitore, ma non l'omogenato o substrato in miscela di controllo 3.
- Eseguire la reazione di PLC e la rilevazione della fluorescenza come descritto nei passaggi 4.5-5.3.
7. elaborazione statistica
- Per la rilevazione di attività PLC utilizzando le miscele descritte nella sezione 4, calcolare la fluorescenza derivata dalla reazione fra PLC e il substrato sottraendo la fluorescenza emessa dall'omogeneato o substrato gratuito come segue.
FL (attività PLC) = Fl (mix di reazione) - {Fl (ctrl 1) + Fl (ctrl 2)}
Nota: Fl (attività PLC), Fl (mix di reazione), Fl (ctrl 1) e Fl (ctrl 2) denotano bona fide fluorescenza derivato dall'attività PLC, fluorescenza rilevata nella miscela di reazione e miscele di controllo 1 e 2, rispettivamente.- Dopo la misurazione della fluorescenza nelle miscele come descritto ai punti 4.1-5.3, è possibile calcolare Fl (attività PLC) secondo l'equazione al punto 7.1 e poi la media Fl (attività PLC) della tecnica triplice copia per ogni omogeneato.
- Utilizzando la media Fl (attività PLC) della tecnica triplice copia ottenuta al passaggio 7.1.1, calcolare nuovamente la media Fl (attività PLC) di replicati biologici di MBs e altre regioni del cervello e confrontare i valori tra i tessuti del cervello.
- Per l'esame delle attività PLC in presenza di inibitori utilizzando le miscele descritte nella sezione 6, calcolare la fluorescenza derivata dalla reazione fra l'omogenato, substrato ed inibitore come segue.
FL (attività PLC con inibitore) = Fl (mix di reazione) - {Fl (ctrl 1) + Fl (ctrl 2)} + Fl (ctrl 3)
Nota: Qui, Fl (attività PLC con inibitore) è bona fide fluorescenza risultanti da attività PLC in presenza dell'inibitore. FL (mix di reazione), Fl (ctrl 1), Fl (ctrl 2) e Fl (ctrl 3) sono segnali di fluorescenza rilevati nella miscela di reazione, controllo miscela 1, controllano miscela 2 e controllo miscela 3, rispettivamente.- Dopo la misurazione della fluorescenza nelle miscele come descritto ai punti 6.1-6.4, calcolare Fl (attività PLC con inibitore) secondo l'equazione al punto 7.2. Quindi, ottenere la media Fl (attività PLC con inibitore) della tecnica triplice copia per ogni omogeneato.
- Utilizzando il valore medio calcolato al punto 7.2.1, calcolare la media Fl (attività PLC con inibitore) delle ripetizioni biologici derivato da ogni tessuto cerebrale. Confrontare il Fl (attività PLC con inibitore) e Fl (attività PLC) ottenuto nel passaggio 7.1.2 in ogni tessuto cerebrale.
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Representative Results
Concentrazioni di proteina in omogeneati del cervello:
Abbiamo preparato gli omogeneati usando le API foraggiere. Le concentrazioni di proteina calcolati in omogenati di originale sono mostrate in Figura 3. Le concentrazioni di proteina approssimativo nell'omogeneato originale erano come segue: 1,5 mg/mL in MBs e 2,3 mg/mL in altre regioni del cervello. Abbiamo usato due API per lotto e sei lotti sono stati analizzati.
Rilevazione di attività PLC in omogeneati del cervello:
Nell'esperimento pilota, abbiamo rilevato in altre regioni del cervello rispetto a MBs maggiore fluorescenza. Di conseguenza, abbiamo ripetuto gli esperimenti preliminari utilizzando l'omogenato di altre regioni del cervello e determinato il tempo di reazione (vale a dire, 30 min) e la quantità di proteina (cioè, 1,3 µ g). Il risultato della reazione in queste condizioni è mostrato in Figura 4A. Le miscele di reazione contenente omogenato di tessuto sia il substrato fluorogenico esposto > 4.2-fold fluorescenza superiore rispetto le miscele di controllo contenente omogeneato del tessuto o il substrato fluorogenico, suggerendo che l'attività PLC era rilevato nelle miscele di reazione. Fluorescenza relativa era circa 3,4 superiore in altre regioni del cervello rispetto a MBs (Figura 4B).
Analisi degli effetti inibitori di agenti farmacologici sulle attività del PLC:
Per esaminare gli effetti del pan-PLC inibitori edelfosine e neomicina sull'attività PLC, abbiamo effettuato la reazione in presenza di 1,0 mmol/L edelfosine o 0,55 neomicina mmol/L, utilizzando la stessa omogeneato come analizzato sopra. In presenza di edelfosine, il livello di fluorescenza è diminuito a circa 6,0% e 5,4% in MBs e altre regioni del cervello, rispettivamente, rispetto ai controlli senza edelfosine (Figura 4C). Trattamento di neomicina ha ridotto il livello di fluorescenza al 44% e 20% che di non trattata controlla in MBs e altre regioni del cervello, rispettivamente (Figura 4D).
Figura 1 : Cattura un'ape forager. Una raccoglitrice tornando al suo alveare è stata catturata in una rete dell'insetto, e lei era confinata in una provetta conica in plastica da 50 mL. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Rappresentazione schematica della procedura dissezione. Vengono visualizzati gli assi (A) del cervello dell'ape mellifica menzionati nel protocollo. L'ape dalla testa al torace anteriore è visto dal lato laterale. (B - K) Foto e illustrazioni delle procedure di dissezione sono mostrati. Vedi il testo principale per i dettagli. Solo la testa dell'ape è presentata. Un'illustrazione delle trachee è omesso. MBs = corpi fungo. Le barre della scala corrispondano a 1 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Le concentrazioni di proteina in omogeneati del tessuto del cervello. Concentrazioni di proteina in omogenati di originale sono state misurate dall'analisi di BCA e calcolate. Le concentrazioni medie con deviazioni standard sono indicate. Due API forager sono state usate per ogni lotto, e sei lotti sono stati analizzati. MBs = corpi fungo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Fluorescenza rilevata nelle reazioni. (A), questa pannello spettacoli fluorescenza in ogni tessuto con o senza il fluorogenic substrato. La reazione è stata condotta per 30 min utilizzando 1,3 µ g di proteina. Fluorescenza è stato misurato il lettore di micropiastre. I valori di pozzetti sono stati rettificati da pozzi vuoti e mostrati in unità arbitrarie (AUs). (B), questo pannello mostra un confronto tra fluorescenza tra tessuti cerebrali. I dati nel pannello A erano corretti per miscele di controllo mediante sottrazione e normalizzati dalla fluorescenza calcolata in MBs. * P < 0,005, test U di Mann-Whitney. Pannelli C e D mostrano fluorescenza relativa alla presenza di edelfosine 1,0 mmol/L (C) e (D) 0.55 mmol/L neomicina. Lo stessi omogeneati utilizzati nei pannelli A e B sono stati analizzati. I valori di fluorescenza sono stati normalizzati dai risultati dell'esperimento di controllo senza trattamento farmacologico per ogni tessuto. I dati delle reazioni di controllo nel pannello C sono le stesse del pannello B. Nel pannello D, tutti gli omogeneati sono stati analizzati nuovamente in un esperimento diverso. Vengono visualizzati i valori di media di fluorescenza con deviazioni standard. Due API sono state usate per ogni lotto, e sei lotti sono stati analizzati. P < 0,05, firmato-ranghi di Wilcoxon. Nessun Hg = controllo miscela contenente non omogeneizzato; MBs = corpi fungo. Pannelli B - D sono stati modificati da Suenami et al. 24 con permesso dell'editore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'esame biochimico della attività della proteina è profondamente importante per comprendere la segnalazione molecolare nel cervello, perché l'attività di un enzima è influenzata da varie molecole, quali substrati e inibitori e può, quindi, cambiare lungo con comportamento animale (ad es., apprendimento e memoria)5. Negli studi dell'ape mellifica, enzimi come la chinasi AMP ciclico-dipendente della proteina A, protein-chinasi GMP ciclico-dipendente, PKC, CaMKII fosforilato e adenilato ciclasi sono segnalati per essere differenzialmente espressi in varie regioni del cervello sulla base Immunohistochemistry5,10,29,30,31. Le differenze nell'attività enzimatica fra regioni del cervello, tuttavia, sono solo parzialmente segnalati6. Qui, abbiamo descritto un protocollo dettagliato per rilevare attività PLC e valutando gli effetti inibitori di agenti farmacologici in MBs e altre regioni del cervello.
Ci sono alcuni possibili fattori che interferiscono con rilevazione della fluorescenza. In primo luogo, è importante proteggere la proteina dalla degradazione durante l'esecuzione di analisi biochimiche. Nel protocollo descritto qui, sono necessari un rapida dissezione e il congelamento del cervello. Si raccomanda che i campioni di tessuto sono congelati e conservati presto dopo ogni ciclo di dissezione. Una minimizzazione del ciclo gelo/disgelo dell'omogenato è anche cruciale per prevenire il deterioramento della proteina.
Oltre alla degradazione della proteina, fluorescenza di fondo e assorbanza nella miscela di reazione può influenzare i risultati in questo sistema di dosaggio, perché l'attività PLC è rilevata da un segnale di fluorescenza. Ad esempio, neomicina disciolto in acqua ha un colore giallo che riguarda la rilevazione della fluorescenza. Anche se abbiamo usato neomicina 0.55 mmol/L, una volta 1000 diluizione della soluzione di riserva, un'ulteriore ottimizzazione della concentrazione potrebbe essere necessaria. Inoltre, la contaminazione di altri tessuti può anche influenzare il risultato. La retina, che rileva gli stimoli visivi e contiene pigmenti, comprende un tipo di tessuto che potenzialmente interferisce con l'analisi.
Con il presente protocollo, abbiamo rilevato più alta attività di PLC in altre regioni del cervello rispetto alla MBs24. Questo era in contrasto con il risultato di analisi quantitativa di PCR di d'inversione-trascrizione, che ha rivelato che la MBs esprimono livelli più elevati di geni PLC rispetto altri tessuti di cervello24. Questa contraddizione potrebbe essere a causa di WH-15, che è un substrato digalleggiante26e il fatto che non abbiamo distinguere la membrana e frazioni citosoliche degli omogeneati del cervello. Considerando che PLCβ e PLCε sono enzimi membrana-collegato32 e può interagire con il substrato di2 PIP endogeno, la quantità di frazione della membrana nell'omogeneato probabilmente interessa la reazione tra PLC e WH-15. Un'altra possibile spiegazione è che la concentrazione di PLC potrebbe essere più alta delle altre regioni del cervello rispetto a MBs a causa delle differenze nei tassi di produzione e/o degradazione della proteina. Quindi, deve essere chiarito bona fide PLC attività nel cervello ulteriormente da ulteriori esperimenti, come utilizzando un nuovo substrato recentemente segnalato inglobato la membrana33, analizzando l'attività di membrana-collegato e citosolico PLC separatamente, o quantificare il contenuto di PLC o PIP2 in ogni tessuto cerebrale.
Tenendo conto di punti di cui sopra, il sistema di dosaggio PLC qui descritto può essere ampliato per misurare l'attività del PLC in tessuti differenti non valutati qui, come il tratto digestivo, muscolo e organo riproduttivo. È anche possibile confrontare attività PLC tra i cervelli di foraggiere e API di infermiera per valutare il coinvolgimento di attività PLC in diversi ruoli sociali.
Nel complesso, il sistema di analisi qui presentato è una soluzione praticabile per rilevare attività PLC in omogeneati del tessuto, perché può essere eseguita con attrezzature standard di laboratorio, mentre un approccio tradizionale utilizzando radiomarcato PIP2 richiede specializzata Servizi, formazione e attrezzature per radioisotopi. Approfittando del sistema con ulteriori modifiche sarà approfondire la nostra comprensione dei meccanismi molecolari alla base di un comportamento complesso di honeybee.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Figura 4B - 4D è stata modificata da Suenami et al. 24 con il permesso della biologia Open. Gli autori sono grati all'editore per l'autorizzazione. Questo lavoro è stato supportato da Human Frontier Science Program (RGY0077/2016) a Shota Suenami e Ryo Miyazaki.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | The reagent kit for measurement of protein concentration |
| Pierce Bovine Serum Albumin Standard Ampules 2mg/mL | ThermoFisher Scientific | 23209 | The standard samples used in BCA assay |
| Paraffin wax | GC | 13B1X00155000141 | Dental wax used as dissection stage |
| Insect pin | Shiga | No. 0 | Stainless, solid head |
| PLCglow | KXT Bio | KCH-0001 | A fluorogenic substrate of PLC |
| 384-well microplate | Corning | 4511 | Low-volume, round-bottom plate in black color |
| Gemini EM microplate reader | Molecular Devices | ||
| Edelfosine | Santa Cruz Biotechnology | sc-201021 | pan-PLC inhibitor |
| Neomycin sulfate | Santa Cruz Biotechnology | sc-3573 | pan-PLC inhibitor |
References
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- Szyszka, P., Galkin, A., Menzel, R. Associative and non-associative plasticity in Kenyon cells of the honeybee mushroom body. Frontiers in Systems Neuroscience. 2, 3 (2008).
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