Une plate-forme haut débit pour la détection de Salmonella spp /Shigella spp.
Summary
Salmonella spp /Shigella spp sont pathogènes courants attribués à la diarrhée. Ici, nous décrivons une plate-forme haut débit pour la détection de Salmonella spp /Shigella spp., à l’aide de la PCR en temps réel combinée avec la culture guidée.
Abstract
La transmission fécale-orale de gastro-entérite aiguë se produit de temps en temps, surtout quand les personnes qui manipulent les aliments et l’eau sont infectées par Salmonella spp/Shigella spp. La méthode de l’étalon-or pour la détection de Salmonella spp/Shigella spp est culture directe mais c’est long et fastidieux. Nous décrivons ici une plate-forme haut débit pour Salmonella spp/Shigella spp de dépistage, à l’aide de la PCR en temps réel (PCR) combiné avec la culture guidée. Il y a deux grandes étapes : PCR en temps réel et la culture guidée. Pour la première étape (PCR temps réel), nous expliquer chaque étape de la méthode : échantillons de collection, pré-enrichissement, extraction d’ADN et la PCR en temps réel. Si le résultat de la PCR en temps réel est positif, la deuxième étape (culture guidée) est réalisée : la culture sélective, identification biochimique et caractérisation sérologique. Nous illustrons aussi résultats représentatifs générés à partir d’elle. Le protocole décrit ici serait une plate-forme utile pour le dépistage rapide, précise, sensible et haut débit de Salmonella spp /Shigella spp.
Introduction
La diarrhée est toujours un problème de santé courant à forte incidence taux globalement1,2. Bien que la mortalité est relativement faible, certains patients présentent des symptômes divers pendant des semaines (par exemple, molles et aqueuses tabourets, une urgence à aller aux toilettes), qui rendent l’impact socioéconomique très élevé3,4. Plus sérieusement, certains patients peuvent même développer le syndrome du côlon irritable si laissé non traité5. Il existe différents types de bactéries, les virus et les parasites qui peuvent causer la diarrhée6. Salmonella spp /Shigella spp sont parmi les bactéries les plus courantes pour la transmission de la gastro-entérite aiguë7,8,9,10,11. Par conséquent, beaucoup de comtés ont émis des lois ou aux règlements réguliers Salmonella spp /Shigella spp. dépistage parmi les gens qui traiteront de nourriture et eau. Par exemple, le gouvernement chinois ont publié des lois pour obligatoire Salmonella spp /Shigella spp. dépistage une fois par an.
La méthode de l’étalon-or pour Salmonella spp / détection deShigella spp est la culture de bactéries. Par le biais de la culture de bactéries et identification biochimique successive et caractérisation sérologique, nous pouvons identifier les espèces de bactéries, ce qui pourraient faciliter la gestion des épidémies maladie et profilage antimicrobienne pour faciliter le traitement des patients 12. il pourrait aussi aider à remonter à la source de l’infection au cours de la Salmonella spp /Shigella spp éclosion13. Toutefois, cette méthode est fastidieuse (nécessitant une opération manuelle) et beaucoup de temps (prendre plusieurs jours), en particulier pour les essais d’un grand nombre d’échantillons7. En outre, viable mais non cultivable (VBNC) Salmonella spp /Shigella spppeut exister dans certains échantillons de selles14. Compte tenu de ces inconvénients, plusieurs laboratoires ont tenté de développer de nouvelles techniques pour la détection de Salmonella spp /Shigella spp.15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25. tous ces méthodes utilisent le test nucléaire acid amplification (TAAN), parmi lesquels la réaction en chaîne par polymérase (PCR) est le plus fréquent. Une limitation majeure de ces méthodes TAAN basé est que les bactéries mortes, ADN génomique incomplet contenant des débris même bactérienne, pourraient montrer des résultats positifs26, qui peuvent largement influencer le diagnostic précis de maladie. Blanco et coll. ont montré que test moléculaire est très sensible, non seulement viable Salmonella dans les cultures, mais aussi aux génomes partielles et bactéries infections passées ou contamination26morts ou non viables. Donc, les nouvelles technologies devraient être développés.
Ici, nous avons décrit une nouvelle méthode que combine le TAAN base de méthode et culture. Tel qu’illustré à la Figure 1, cette nouvelle méthode s’applique de PCR en temps réel contrôle premier et ensuite les échantillons positifs sont envoyés pour l’identification et de la culture de bactéries.
Protocol
Representative Results
Discussion
Depuis Salmonella spp /Shigella spp. sont souvent associés aux intoxications alimentaires et transmission fécale-orale de la gastro-entérite aiguë28,29 , et la méthode de routine est beaucoup de travail ou de longue durée 7, nous décrivons une plate-forme haut débit pour la Salmonella spp / le dépistageShigella spp., à l’aide de la PCR en temps réel combinée avec la culture guidée.
<p …Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Science et technologie Programme de Zhuhai, Chine (subvention numéro 20171009E030064), la Science et technologie Programme de Guangdong, Chine (subvention numéro 2015A020211004) et la Science et technologie Programme de l’Administration générale de la Supervision de la qualité, Inspection et la quarantaine de la République populaire de Chine (numéro grant 2016IK302, 2017IK224).
Materials
| Tris | Sigma | 10708976001 | |
| EDTA | Sigma | 798681 | |
| NP40 | Sigma | 11332473001 | |
| ddH2O | Takara | 9012 | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara | R040Q | |
| Nutrient Broth | LandBridge | CM106 | |
| Nutrient agar | LandBridge | CM107 | |
| Selenite Cystine medium | LandBridge | CM225 | |
| XLD | LandBridge | CM219 | |
| MAC | LandBridge | CM908 | |
| Salmonella chromogenic agar | CHROMagar | SA130 | |
| Salmonella diagnostic serum | Tianrun | SAL60 | |
| Shigella diagnostic serum | Tianrun | SHI54 | |
| anal swab (collecting tube plus) | Huachenyang | ||
| slide | Mingsheng | 7102 | |
| micro-loop | Weierkang | W511 | |
| incubator | Jinghong | DNP-9082 | |
| autoclave | AUL | SS-325 | |
| dry bath | Jinghong | KB-20 | |
| automated microbial identification system | bioMérieux | VITEK2 | other equivalent system could be used |
| fluorescent real-time PCR machine | ThermoFisher | ABI7500 | other equivalent machine could be used |
References
- Roy, S. L., Scallan, E., Beach, M. J. The rate of acute gastrointestinal illness in developed countries. Journal of Water and Health. 4, 31-69 (2006).
- Wilking, H., et al. Acute gastrointestinal illness in adults in Germany: a population-based telephone survey. Epidemiology and Infection. 141 (11), 2365-2375 (2013).
- Friesema, I. H. M., Lugnér, A. K., van Duynhoven, Y. T. H. P. Costs of gastroenteritis in the Netherlands, with special attention for severe cases. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (8), 1895-1900 (2012).
- Henson, S. J., et al. Estimation of the costs of acute gastrointestinal illness in British Columbia, Canada. International Journal of Food Microbiology. 127 (1-2), 43-52 (2008).
- Okhuysen, P. C., Jiang, Z. D., Carlin, L., Forbes, C., DuPont, H. L. Post-diarrhea chronic intestinal symptoms and irritable bowel syndrome in North American travelers to Mexico. The American Journal of Gastroenterology. 99 (9), 1774-1778 (2004).
- Wongboot, W., Okada, K., Chantaroj, S., Kamjumphol, W., Hamada, S. Simultaneous detection and quantification of 19 diarrhea-related pathogens with a quantitative real-time PCR panel assay. Journal of Microbiological Methods. 151, 76-82 (2018).
- Van Lint, P., De Witte, E., Ursi, J. P., Van Herendael, B., Van Schaeren, J. A screening algorithm for diagnosing bacterial gastroenteritis by real-time PCR in combination with guided culture. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 85 (2), 255-259 (2016).
- Liu, J., et al. Use of quantitative molecular diagnostic methods to identify causes of diarrhoea in children: a reanalysis of the GEMS case-control study. Lancet. 388 (10051), 1291-1301 (2016).
- Wang, S. M., et al. Surveillance of shigellosis by real-time PCR suggests underestimation of shigellosis prevalence by culture-based methods in a population of rural China. Journal of Infection. 61 (6), 471-475 (2010).
- Wikswo, M. E., Hall, A. J. Outbreaks of acute gastroenteritis transmitted by person-to-person contact–United States, 2009-2010. MMWR Surveillance Summaries. 61 (9), 1-12 (2012).
- Shen, H., et al. The 12 Gastrointestinal Pathogens Spectrum of Acute Infectious Diarrhea in a Sentinel Hospital, Shenzhen, China. Frontiers in Microbiology. 7, 1926 (2016).
- Tariq, A., et al. Molecular profiling of antimicrobial resistance and integron association of multidrug-resistant clinical isolates of Shigella species from Faisalabad, Pakistan. Canadian Journal of Microbiology. 58 (9), 1047-1054 (2012).
- Ferrari, R. G., Panzenhagen, P. H. N., Conte-Junior, C. A. Phenotypic and Genotypic Eligible Methods for Salmonella Typhimurium Source Tracking. Frontiers in Microbiology. 8, 2587 (2017).
- Oliver, J. D. The viable but nonculturable state in bacteria. The Journal of Microbiology. 43, 93-100 (2005).
- Rintala, A., Munukka, E., Weintraub, A., Ullberg, M., Eerola, E. Evaluation of a multiplex real-time PCR kit Amplidiag(R) Bacterial GE in the detection of bacterial pathogens from stool samples. Journal of Microbiological Methods. 128, 61-65 (2016).
- Wohlwend, N., Tiermann, S., Risch, L., Risch, M., Bodmer, T. Evaluation of a Multiplex Real-Time PCR Assay for Detecting Major Bacterial Enteric Pathogens in Fecal Specimens: Intestinal Inflammation and Bacterial Load Are Correlated in Campylobacter Infections. Journal of Clinical Microbiology. 54 (9), 2262-2266 (2016).
- Van Lint, P., et al. Evaluation of a real-time multiplex PCR for the simultaneous detection of Campylobacter jejuni, Salmonella spp., Shigella spp./EIEC, and Yersinia enterocolitica in fecal samples. Eur Journal of Clinical Microbiology Infect Dis. 34 (3), 535-542 (2015).
- Kamkamidze, G., et al. Rapid Identification Of The Etiological Factors Causing Diarrheal Diseases. Georgian Medical News. (258), 89-92 (2016).
- Li, Y. Establishment and Application of a Visual DNA Microarray for the Detection of Food-borne Pathogens. Analytical Sciences. 32 (2), 215-218 (2016).
- Zhuang, L., et al. Detection of Salmonella spp. by a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method targeting bcfD gene. Letters in Applied Microbiology. 59 (6), 658-664 (2014).
- Shi, X. L., et al. Rapid simultaneous detection of Salmonella and Shigella using modified molecular beacons and real-time PCR. Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. 27 (12), 1053-1056 (2006).
- Mo, Q. H., et al. Preparation of a 96-microwell plate DNA diagnostic chip for detection of foodborne bacteria and its application in an incident of food poisoning. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 30 (3), 417-421 (2010).
- Wang, H. B., et al. Probe-free and sensitive detection of diarrhea-causing pathogens using RT-PCR combined high resolution melting analysis. Biologicals. 44 (5), 360-366 (2016).
- Sun, H., et al. Rapid simultaneous screening of seven clinically important enteric pathogens using a magnetic bead based DNA microarray. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (1), 163-169 (2011).
- Qi, W., et al. Multiplex PCR assay for rapid detection of five important pathogenic vibrios. Chinese Journal of health laboratory technology. (24), 3497-3500 (2014).
- Blanco, G., Diaz de Tuesta, J. A. Culture- and molecular-based detection of swine-adapted Salmonella shed by avian scavengers. Science of the Total Environment. 634, 1513-1518 (2018).
- Tang, X. J., Yang, Z., Chen, X. B., Tian, W. F., Tu, C. N., Wang, H. B. Verification and large scale clinical evaluation of a national standard protocol for Salmonella.spp./Shigella.spp. screening using real-time PCR combined with guided culture. Journal of Microbiological Methods. 145, 14-19 (2018).
- Dekker, D. M., et al. Drinking water from dug wells in rural ghana–salmonella contamination, environmental factors, and genotypes. International Journal of Environmental Research and Public Health. 12 (4), 3535-3546 (2015).
- Gargano, J. W., et al. Mortality from selected diseases that can be transmitted by water – United States, 2003-2009. Journal of Water and Health. 15 (3), 438-450 (2017).
- Kumar, R., Surendran, P. K., Thampuran, N. Evaluation of culture, ELISA and PCR assays for the detection of Salmonella in seafood. Letters in Applied Microbiology. 46 (2), 221-226 (2008).
- Herrera-Leon, S., et al. Blind comparison of traditional serotyping with three multiplex PCRs for the identification of Salmonella serotypes. Research in Microbiology. 158 (2), 122-127 (2007).
- Cunningham, S. A., et al. Three-hour molecular detection of Campylobacter, Salmonella, Yersinia, and Shigella species in feces with accuracy as high as that of culture. Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2929-2933 (2010).
- Eriksson, E., Aspan, A. Comparison of culture, ELISA and PCR techniques for salmonella detection in faecal samples for cattle, pig and poultry. BMC Veterinary Research. 3, 21 (2007).
- Dutta, S., et al. Sensitivity and performance characteristics of a direct PCR with stool samples in comparison to conventional techniques for diagnosis of Shigella and enteroinvasive Escherichia coli infection in children with acute diarrhoea in Calcutta, India. Journal of Medical Microbiology. 50 (8), 667-674 (2001).
