Eine High-Throughput-Plattform für das Screening von Salmonella spp. /Shigella spp.
Summary
Salmonella SPP /Shigella spp. sind häufige Erreger Durchfall zugeschrieben. Hier beschreiben wir eine Hochdurchsatz-Plattform für das Screening von Salmonella spp. /Shigella spp., mittels Real-Time PCR kombiniert mit geführten Kultur.
Abstract
Fäkal-orale Übertragung von akuter Gastroenteritis tritt von Zeit zu Zeit, vor allem, wenn Menschen, die Nahrung und Wasser behandelt von Salmonella spp./Shigella SPP infiziert sind Die Goldstandard-Methode zum Nachweis von Salmonella spp./Shigella SPP ist direkte Kultur, aber das ist arbeitsintensiv und zeitaufwändig. Hier beschreiben wir eine Hochdurchsatz-Plattform für Salmonella spp./Shigella spp., screening, mittels Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (PCR) kombiniert mit geführten Kultur. Es gibt zwei wichtige Phasen: Real-Time PCR und die geführte Kultur. Für die erste Stufe (Real-Time PCR) Wir erklären jeden Schritt der Methode: Sammlung, Voranreicherung, DNA-Extraktion und Real-Time PCR zu probieren. Wenn das Real-Time PCR-Ergebnis positiv ist, dann die zweite Stufe (geführte Kultur erfolgt): selektive Kultur, biochemische Identifizierung und serologischen Charakterisierung. Wir zeigen auch repräsentative Ergebnisse daraus generiert. Das hier beschriebene Protokoll wäre eine wertvolle Plattform für die schnelle, konkrete, sensible und Hochdurchsatz-Screening von Salmonella spp. /Shigella spp.
Introduction
Durchfall ist immer noch ein häufiges Gesundheitsproblem mit einer hohen Inzidenz bewerten weltweit1,2. Obwohl die Sterblichkeit relativ niedrig ist, einige Patienten zeigen verschiedene Symptome wochenlang (z. B. lose und wässrige Stühle, dringend auf die Toilette gehen), die machen die sozioökonomischen Auswirkungen sehr hoch3,4. Noch gravierender ist, können einige Patienten sogar Reizdarm-Syndrom entwickeln, bleibt unbehandelt5. Es gibt verschiedene Arten von Bakterien, Viren und Parasiten, die Durchfall6verursachen können. Salmonella SPP /Shigella spp. gehören zu den häufigsten Bakterien für die Übertragung von akuter Gastroenteritis7,8,9,10,11. Daher haben viele Landkreise veröffentlicht, Gesetze oder Verordnungen für regelmäßige Salmonella SPP /Shigella spp. screening unter Menschen, die Nahrung und Wasser umgehen würden. Zum Beispiel haben die chinesische Regierung erließ Gesetze für obligatorische Salmonella SPP /Shigella spp. screening jährlich.
Der Gold-Standard-Methode für Salmonella SPP /Shigella spp. Erkennung ist Bakterienkultur. Durch Bakterienkultur und aufeinander folgenden biochemische Identifizierung und serologischen Charakterisierung identifizieren wir die Spezies von Bakterien, die das Krankheitsmanagement Ausbruch und antimikrobielle profiling zur Unterstützung der Behandlung von Patienten erleichtert 12. es könnte auch helfen, die Quelle der Infektion während der Salmonella SPP verfolgen /Shigella spp. Ausbruch13. Diese Methode ist jedoch arbeitsintensiv (erfordern manuelle Bedienung) und zeitaufwändig (wobei mehrere Tage), vor allem für das Testen einer großen Anzahl von Proben7. Darüber hinaus lebensfähig aber nicht kultivierbarer (VBNC) Salmonella SPP /Shigella spp.möglicherweise gibt es in einigen Stuhlproben14. Angesichts dieser Nachteile haben viele Labors versucht, neue Techniken zum Nachweis von Salmonella SPP entwickeln /Shigella spp.15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25. all diese Methoden verwenden nuklearen saure Verstärkung Test (NAAT), unter denen die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) die häufigste ist. Eine wichtige Einschränkung dieser NAAT basierte Methoden ist, dass tote Bakterien, auch bakterielle Verunreinigungen enthält unvollständige genomischer DNA, positive Ergebnisse26, zeigen konnte, die vor allem die genaue Diagnose der Krankheit beeinflussen könnten. Blanco Et Al. zeigten, dass molekulare Tests sehr empfindlich, nicht nur für tragfähige Salmonellen in Kulturen, sondern auch mit teilweise Genomen und tot oder nicht lebensfähig Bakterien aus vergangenen Infektionen oder Kontamination26ist. Daher sollten neuer Technologien entwickelt werden.
Wir hier eine neuartige Methode, verbindet die NAAT Methode und Kultivierung basiert. Wie in Abbildung 1dargestellt, diese neue Methode gilt Real-Time PCR erste screening und positive Proben werden für die Bakterienkultur und Identifikation gesendet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Seit Salmonella SPP /Shigella spp. sind oft verbunden mit Lebensmittelvergiftung und fäkal-orale Übertragung von akuter Gastroenteritis28,29 und die Routine-Methode ist entweder arbeitsintensiv und zeitaufwändig 7, beschreiben wir eine Hochdurchsatz-Plattform für Salmonella SPP /Shigella spp. Screening mittels Real-Time PCR kombiniert mit geführten Kultur.
Es gibt mehrere…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Wissenschaft und Technologie-Programm von Zhuhai, China (Grant Nummer 20171009E030064), die Wissenschaft und Technologie-Programm von Guangdong, China (Grant Nummer 2015A020211004) und Wissenschaft und Technologie-Programm von General Administration unterstützt. der Quality Supervision, Inspektion und Quarantäne der Volksrepublik China (Grant Nummer 2016IK302, 2017IK224).
Materials
| Tris | Sigma | 10708976001 | |
| EDTA | Sigma | 798681 | |
| NP40 | Sigma | 11332473001 | |
| ddH2O | Takara | 9012 | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara | R040Q | |
| Nutrient Broth | LandBridge | CM106 | |
| Nutrient agar | LandBridge | CM107 | |
| Selenite Cystine medium | LandBridge | CM225 | |
| XLD | LandBridge | CM219 | |
| MAC | LandBridge | CM908 | |
| Salmonella chromogenic agar | CHROMagar | SA130 | |
| Salmonella diagnostic serum | Tianrun | SAL60 | |
| Shigella diagnostic serum | Tianrun | SHI54 | |
| anal swab (collecting tube plus) | Huachenyang | ||
| slide | Mingsheng | 7102 | |
| micro-loop | Weierkang | W511 | |
| incubator | Jinghong | DNP-9082 | |
| autoclave | AUL | SS-325 | |
| dry bath | Jinghong | KB-20 | |
| automated microbial identification system | bioMérieux | VITEK2 | other equivalent system could be used |
| fluorescent real-time PCR machine | ThermoFisher | ABI7500 | other equivalent machine could be used |
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