Summary
ويرد نموذج ثقافة طويلة الأجل للخلايا granulosa الأبقار تحت ظروف خالية من المصل. هذا النموذج يسمح للباحثين لدراسة آثار مختلف العوامل والظروف ككثافة الطلاء المختلفة على خصائص الإستروجين المنتجة للخلايا granulosa الأبقار.
Abstract
الخلايا granulosa المبيض (GC) هي المصدر الرئيسي لتوليف استراديول. الناجمة عن الزيادة preovulatory الهرمون (LH)، الخلايا في القراب، وعلى وجه الخصوص، في طبقة الخلايا granulosa عميقا تغيير خصائصها المورفولوجية والفسيولوجية والجزيئية وتشكيل مجموعة إنتاج البروجسترون أصفر هو المسؤول عن الحفاظ على الحمل. خلية ثقافة النماذج أدوات أساسية دراسة الآليات التنظيمية الأساسية المشاركة في التحول اللواتي فوليكولو. ويركز البروتوكول قدم على إجراءات العزل ونعد GC الأبقار من المسام الصغيرة إلى متوسطة الحجم (< 6 مم). مع هذه التقنية، يمكن الحصول على عدد سكان تقريبا نقية من GC. إجراءات تجميد يسهل إلى حد كبير الوقت إدارة خلية ثقافة العمل المستقل إمداد الأنسجة (المبايض) الابتدائية مباشرة. ويصف هذا البروتوكول نموذج ثقافة خلية خالية من المصل الذي يحاكي حالة نشطة استراديول GC الأبقار. وتناقش الشروط الهامة التي ضرورية لثقافة نجاح الستيرويد نشطة خلية في جميع أنحاء البروتوكول. ثبت أن زيادة كثافة الطلاء من الخلايا يستحث استجابة محددة كما هو مبين بجينات تغيير تعبير الشخصية وهرمون إنتاج. وعلاوة على ذلك، يوفر هذا النموذج أساسا لإجراء مزيد من الدراسات على التمايز GC والتطبيقات الأخرى.
Introduction
نجاح التبويض ولوتينيزيشن تعتمد على التعديلات الجزيئية ناعما ضبطها ومدبرة جيدا في أنواع مختلفة من الخلايا الجرابية جسدية. منذ تفاصيل هذه العمليات الإنمائية هي لم لم تفهم تماما، كذلك مطلوب التوضيح. في فيفو النهج معقدة ومكلفة، وعلى وجه الخصوص، تفشل بعنوان الآليات الجزيئية المحددة التي تحدث أثناء فوليكولوجينيسيس. ولذلك، يلزم نماذج ريدوكتيونيستيك في المختبر بالإضافة إلى ذلك، لتقديم نظرة ثاقبة تفاصيل الخلوية والجزيئية. تصف دراسات مختلفة ثقافة المسام كله في سياق2،1، في المختبر التسميد تقنيات3. نظراً للباحثين المهتمين في آليات التمايز، تركز العديد من الدراسات على GC الحبيبي. هذه الخلايا، ترتبط ارتباطاً مباشرا بويضتها، هي المصادر الرئيسية لإنتاج الإستروجين، وهكذا، تلعب دوراً أساسيا في جميع أنحاء فوليكولوجينيسيس ولوتينيزيشن4.
خلد الخلية وضعت خطوط GC من مختلف الأنواع. معظمها، ومع ذلك، لا تظهر إنتاج هرمون ستيرويد كافية5. حتى الآن، إنشاء خط خلية واحدة فقط من الأبقار كانت GC6، ولكن هذا الخط فقدت نشاطها ستيرويدوجينيك بعد عدة ممرات7. ولذلك، منذ ستيرويدوجينيسيس، وخاصة، إنتاج استراديول سمة أساسية من وظائف القيادة العامة، ينصح بدراسة هذه الجوانب في نماذج الثقافة الخلية الأولية. في دراسات سابقة، اتضح أن إنتاج استراديول كبيرة يمكن ملاحظتها فقط تحت شروط ثقافة خالية من المصل8،9. كذلك، المكملات للسلائف التوليف استراديول شرط أساسي آخر، كما تفشل GC للتعبير عن إنزيم اللازمة التي يمكن تحويل البروجسترون إلى التشتوستيرون10. بالإضافة إلى ذلك، كشفت أثر التآزري FSH، ومنتدى إدارة الإنترنت-1 مكملات في المختبر نشاط أمثل من أروماتاسي، الإنزيم الرئيسية من استراديول التوليف11. ويرد أيضا في هذا البروتوكول، العوامل الهامة الأخرى التي لها تأثير كبير على نموذج الثقافة GC. على وجه الخصوص، الخلية تصفيح كثافة آثار هائلة على نتائج التجربة12. وعلاوة على ذلك، يمكن إنشاء أسلوب نعد من GC الأبقار التي لا تتداخل إلى حد كبير مع فسيولوجيا GC في الثقافة. هذه التقنية تساعد على تحسين تنظيم خلية ثقافة العمل وتحسين كثافة الطلاء المفضل.
Protocol
ملاحظة: تم الحصول على المبايض الأبقار من المسالخ تجارية. جمع مشتقات مسلخ لا تتطلب موافقة أخلاقية وفقا للقانون الألماني.
1-ظروف العمل والأعمال التحضيرية
- ضمان العقم، القيام بجميع وسائل الإعلام وإعداد الأنسجة، فضلا عن كل ثقافة العمل في مختبر ثقافة خلية متخصصة باستخدام مقعد الاندفاق الصفحي.
- إعداد 1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، درجة الحموضة 7.4) تستكمل مع البنسلين 100 وحدة دولية، ستربتوميسين 0.1 مغ/مل و 0.5 ميكروغرام/ميليلتر الامفوتريسين لنقل المبيض.
ملاحظة: المدة القصوى بين تلقي المبايض وعزل GC ح 2 في هذا التشكيل.
2-عزل الخلايا Granulosa الأبقار
-
يغسل المبيض عدة مرات في برنامج تلفزيوني 1 x (مع البنسلين 100 وحدة دولية، ستربتوميسين 0.1 مغ/مل، و 0.5 ميكروغرام/ميليلتر الامفوتريسين) لإزالة أي الدم من على سطح الأرض قبل البدء بإجراءات العزل. استخدم كوب ومكان المبايض داخل وملئه ببرنامج تلفزيوني 1 x وتجاهل برنامج تلفزيوني مرة أخرى.
- كرر هذه الخطوة الغسيل x 3 – 4، حتى يتم تنظيف المبايض من أي الدم المتبقية.
- مسح المبيض واحد باستخدام مسح مختبر غارقة بالكحول 70%، للتقليل إلى أدنى حد ممكن من التلوث.
- مع حقنه 3 مل و إبرة ز 18، نضح GC بثقب المسام الصغيرة إلى متوسطة الحجم (< 6 مم، يقاس بمسطرة)، وتجمع السائل الجريبي في أنبوب الطرد المركزي 50 مل واحد.
ملاحظة: لترطيب المحاقن، تأخذ كمية قليلة من برنامج تلفزيوني 1 x (مع 100 وحدة دولية البنسلين والستربتوميسين 0.1 مغ/مل، و 0.5 ميكروغرام/ميليلتر الامفوتريسين)،. وهذا يساعد على جمع كميات صغيرة من سائل جرابي ويمنع الخلايا من الخلاف داخل المحاقن. - بعد ثقب المسام عدة، الشطف بحقنه وابرة مع برنامج تلفزيوني x 1 للتنظيف المتوسطة.
3-تجميد الخلايا
-
استخدام تلطيخ تريبان الأزرق وحساب الخلايا تحت هيموسيتوميتير.
- لحساب عدد الخلايا قادرة على البقاء، إعداد أنبوب مع 1.5 ميليلتر لحل تريبان الأزرق 0.25%.
ملاحظة: الخلايا الحية ستبقى أونستينيد لأنه تريبان الأزرق يمكن فقط الوصول إلى الحاجز خلية من الخلايا الميتة، التي تظهر بعد ذلك الأزرق. - إضافة 15 ميليلتر من تعليق خلية granulosa إلى الحل تريبان الأزرق ومزجها بلطف.
- ضع الخليط في مجلسي هيموسيتوميتير. عد عدد الذين يعيشون الخلايا (مثلاً، أونستينيد) في ساحة كبيرة واحدة في كل دائرة.
ملاحظة: على الرغم من أن يمكن أن نرى بعض خلايا الدم، أنها يمكن أن تتميز بحجمها الصغير جداً. - حساب عدد الخلايا الحية مع متوسط كل المربعات الدائرة وفقا للمبادئ التوجيهية العامة؛ نسبة الخلايا الحية يمكن أن تختلف بين المبيضين ولكن ينبغي أن يتجاوز 60%13.
- لحساب عدد الخلايا قادرة على البقاء، إعداد أنبوب مع 1.5 ميليلتر لحل تريبان الأزرق 0.25%.
-
أخذ عينة من تجمع الخلايا granulosa طازجة معزولة كمرجع لمزيد من التحليل.
- اعتماداً على عدد الخلايا GC معزولة، جانبا عدد مناسب من الخلايا كعينات مرجعية للجيش الملكي النيبالي، والحمض النووي، أو إعداد البروتين.
ملاحظة: لعزل الحمض النووي الريبي والتقييم اللاحق للتعبير الجيني، 1 × 105 الخلايا كافية، بينما قد تتطلب تحليلات لاحقة أخرى أرقام مختلفة، وعموما أعلى الخلية. - ضع مختبرين واحد أو عدة خلايا مرجع في أنبوب جديد والطرد المركزي أنه لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة والحد الأقصى للسرعة (س 12,000 ز) للحصول على بيليه خلية. تجاهل المادة طافية.
- فورا الصدمة-تجميد العينات في نيتروجين سائل. تخزين العينة في-80 درجة مئوية.
- اعتماداً على عدد الخلايا GC معزولة، جانبا عدد مناسب من الخلايا كعينات مرجعية للجيش الملكي النيبالي، والحمض النووي، أو إعداد البروتين.
-
القيام تجميد كما يلي.
- تعد وسيلة تجميد استخدام مصل العجل الجنين 80% (FCS) و 20% ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]).
- أجل بلطف بيليه GC، الطرد المركزي GC لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة و 500 x ز.
- إزالة المادة طافية بعناية ولطف ريسوسبيند الخلايا مرئية في السفح 100% (مثلاً، 1 مل) حتى لا خلية أكثر من كتل.
- إضافة إلى حجم 1 (مثلاً، 1 مل) المتوسط تجميد مستعدة لتعليق خلية ونقل الخليط إلى قنينة مبردة.
ملاحظة: سيتم تركيز وسائط الإعلام حماية البرد النهائي 90% FCS و 10% [دمس]. - مكان القنينة المبردة في حاوية تجميد (متاح تجارياً) متخصصة أن يمنع التجميد السريع. معدل تبريد العينات ينبغي أن لا تتجاوز نقل الحاوية التجميد في ثلاجة-80 درجة مئوية على الأقل 4 ح-1 درجة مئوية/دقيقة.
- لتخزين أطول، ضع قارورة المبردة في حاويات درجة حرارة منخفضة للغاية (مثلاً، حاويات النيتروجين الطور السائل).
ملاحظة: يمكن أن توقف عن البروتوكول هنا، كما يسمح تجميد تخزين أطول.
4-إعداد وسائل الإعلام والثقافة لوحات لثقافة الخلية
-
معطف لوحات ثقافة الخلية مع 0.02% الكولاجين ر.
ملاحظة: هو معروف الكولاجين R أمر ضروري لتحسين مرفق GC في الثقافة.- تعد حلاً 0.02% R الكولاجين مع تنقية المياه مناسبة لزراعة الخلايا.
- إضافة 150 ميليلتر كل بئر في صفيحة 24-جيدا (= 2 سم2/جيد) والتأكد من أن السطح كله ثقافة مغطى بالحل الكولاجين R.
- واسمحوا الحل الجاف مع غطاء مفتوحة لبضع ساعات أو بين عشية وضحاها في هود الاندفاق الصفحي.
- عندما يجف تماما لوحات الثقافة، يتهددها لهم مع الأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 – 15 دقيقة لتقليل التلوث.
- إذا لزم الأمر، تخزين لوحات عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهرين.
- تعد وسائل الإعلام وملاحق لثقافة العمل تحت غطاء الاندفاق الصفحي. لانتعاش ناجحة لمجلس إدارته، لديهم لمعالجتها فورا بعد ذوبان الجليد.
-
إعداد الوسائط التالية.
- الملحق α-الحد الأدنى المتوسطة الأساسية (α-MEM) مع 2 مم ل الجلوتامين، بيكربونات الصوديوم 0.084%، 0.1% ألبومين المصل البقري (BSA)، 20 مم هيبيس، سيلينيت الصوديوم نانوغرام/مل 4، 5 ميكروغرام/مل ترانسفيرين، 10 نانوغرام/مل الأنسولين والأحماض الأمينية غير الأساسية 1 مم.
- بالإضافة إلى ذلك، أضف ستربتوميسين البنسلين و 0.1 مغ/مل 100 وحدة دولية لوسائط الإعلام.
ملاحظة: المضادات الحيوية، وارتفعت درجة حرارة مرة واحدة، مستقرة لما يقرب من 48 ساعة. ولذلك، اليكووت المبلغ المطلوب من وسائل الإعلام لإنشاء ثقافة والمخطط تبادل. قبل الحارة فقط مختبرين وسائل الإعلام إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي. ويمكن تخزين وسائل الإعلام مستعدة عند 4 درجة مئوية لمدة لا تزيد على 3 أشهر. - للحث على النشاط الستيرويد في GC البقري مثقف، الملحق α-ذاكرة بالإضافة إلى ذلك مع 20 نانوغرام/مليلتر جريب – الهرمون (FSH) و 50 نانوغرام/مل ص3 منتدى إدارة الإنترنت-1 2 ميكرومتر التشتوستيرون.
ملاحظة: الملحق دائماً هذه المكونات قبل وقت قصير من بدء تبادل الثقافة أو وسائل الإعلام. تجنب تكرار دورات تجميد أذاب وحلول الأسهم FSH ومنتدى إدارة الإنترنت-1، كهذا قد يضر بالنشاط ستيرويد.
5-خلية ثقافة العمل
- نقل تعليق خلية إلى 37 درجة مئوية قبل حرارة α-الفنزويلية (بدون الملحق هرمون) وإذابة الخلايا بسرعة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 3-4 دقيقة. للطرد المركزي، ينصح حجم 10 مل نهائي.
- الطرد المركزي GC لمدة 3 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وفي 500 x غ. تجاهل المادة طافية. إضافة المعالجون مسبقاً وتستكمل α-الفنزويلية وريسوسبيند الخلايا بعناية.
- وتشمل البذور GC في كثافة 1 × 105 أو 1 × 106 خلايا للبئر الواحد في وحدة تخزين نهائي من 500 ميليلتر. replicates التقنية على الأقل ثلاثة آبار الثقافة الواحدة شرط.
- احتضان ثقافة الخلية في حاضنة في 37 درجة مئوية مع 5% CO2 د 8.
- القيام بتبادل وسائل الإعلام كل يوم. استبدال فقط ثلثي ثقافة وسائل الإعلام للحد من التوتر والتخفيف من تطويع الخلايا لوسائط الإعلام الجديدة.
ملاحظة: GC تشكل النمط الظاهري تنتجها الخلايا الليفية مثل نموذجي بعد أيام قليلة في الثقافة، وتميل إلى التجمع معا. في ثقافة الخلية--كثافة عالية، توجد مجموعات أكبر كثيرا مقارنة بثقافة الكثافة الطبيعية GC (الشكل 1، غادر مقابل اللوحة اليمنى).
6-بعد ذلك تحليل الخلايا Granulosa مثقف
- لإجراء تحليل هرمون الستيرويد، وجمع وسائل الإعلام وتجميدها في-20 درجة مئوية. استخدام أساليب ملائمة لتحليل تركيز الاستراديول وهرمون البروجسترون في المستهلك وسائل الإعلام [علىسبيل المثال، radioimmunoassay (RIA)]14.
- للتحليل اللاحق للجزيئات المستهدفة المختلفة (الجيش الملكي النيبالي، والحمض النووي، والبروتينات، إلخ)، الخلايا مباشرة في الطبق الثقافة مع وكيل ليسينج مناسبة حسبما أوصت به المورد.
ملاحظة: معظم إجراءات العزل، من الممكن لإيقاف البروتوكول هنا، كما يمكن تخزين الخلايا ليسيد في-20 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. لتخزين أطول، ينبغي إبقاء الخلايا في-80 درجة مئوية. - لتحديد نسخة وفرة وتوليف كدنا وقياس نصوص محددة بالكمية في الوقت الحقيقي بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (qPCR) تقنيات15. ينبغي أن يشمل تقييم الإحصائي تكرار ثلاثة على الأقل من الثقافات الخلية المختلفة، نشأت من خلية مختلفة التحضيرات (replicates البيولوجية).
Representative Results
GC مطلي في 1 × 105 خلايا/كذلك عرض مظهر تنتجها الخلايا الليفية مثل نموذجي كما أنها تشكل ملحق خلايا شبيهة بالخلايا الليفية، وتميل إلى بناء المجموعات (الشكل 1a وج 1). زيادة كثافة الطلاء بمقدار 10 إضعاف إلى 1 × 106 خلايا/جيدا ولم تتغير مورفولوجية ولكن يمكن ملاحظة أكثر خلية مجموعات (الشكل 1b د 1من الأسهم). كما هو موضح مسبقاً في منشور سابق، تحسين الطلاء الكولاجين أطباق الثقافة إلى حد كبير عن ارتباط الخلايا13.
للواسمات الأولية لم تتغير إلى حد كبير الخصائص الفسيولوجية للخلايا في الثقافة مقارنة بتلك المزروعة مباشرة من عينات طازجة معزولة. هذا يظهر في الشكل 2 كوفرة نسخة (تقاس qPCR) علامة عدة لم تختلف الجينات عند مقارنة الخلايا المستزرعة المستمدة من برك المجمدة أو الطازجة معزولة.
ويبين الشكل 3 الممثل نتائج تحليل هرمون الستيرويد (تقاس ريا) في الأبقار GC مثقف عادي مقابل كثافة عالية. هو تناقص تركيز الاستراديول في ثقافة عالية الكثافة مقارنة بثقافة عادية-كثافة، بينما إنتاج البروجسترون تميل إلى أن تكون أعلى.
وكشف تحليل مقارن لعدة جينات (تقاس qPCR) في عالية- مقابل عادية-كثافة الثقافات تأثير كبير (الشكل 4). CYP19A1، الترميز الرئيسية إنزيم aromatase الحيوي استراديول، فضلا عن مستقبلات تروج فشر، كانت إلى حد كبير أسفل المقننة. وفي المقابل، أظهر الجينات RGS2 و VNN2 لائحة كبيرة تصل. هذه النتائج تشير بوضوح أن عمليات محددة من التمايز الخلوي هي الناجمة عن زيادة الخلية تصفيح الكثافة.
رقم 1: استزراع الخلايا granulosa البقري العادي (لوحات الأيسر) وخلية عالية الكثافة (حق أفرقة). عرض الخلايا ( وج) المزروع في كثافة 1 × 105 خلايا/بئر النمط الظاهري تنتجها الخلايا الليفية مثل نموذجي. (ب ود) GC مثقف في طلاء عالية كثافة (1 × 106 خلايا/جيد) تميل إلى تشكيل مجموعات خلية كبيرة (الأسهم) أكثر كثيرا بالمقارنة مع الخلايا تحت كثافة طبيعية (اللوحة اليمنى). تغيير حجم أشرطة = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: مقارنة بين الخلايا المزروعة مباشرة بعد عزلة وبعد تجميد. كانت استزراع الخلايا في كثافة 1 × 105 خلايا كل بئر. تم تقييم التعبير الجيني عدة علامة النصوص وكشف أي فرق بين الخلايا المزروعة مع أو بدون تجميد أولى. Boxplot يبين متوسط n = 3. التائي t-اختبار، ف--يتم تضمين القيم. ويرد هذا الرقم من بوفيلد وفانسيلوو16. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: تركيز هرمون الستيرويد في الخلايا granulosa مثقف كثافات مختلفة والطلاء- تركيز استراديول (E2) انخفض كثيرا عندما كانت مثقف GC في كثافة عالية خلية، في حين أن تركيز البروجسترون (P4) فقط تميل إلى أن تكون أعلى. تم تصحيح تركيز هرمون لمحتوى الحمض النووي لتطبيع لأرقام خلية مختلفة. يعني ووزارة شؤون المرأة من n = 3 وترد. p > 0.05،-التائي t-اختبار. ويرد هذا الرقم من بوفيلد et al. 15- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: وفرة النصوص الوظيفية الرئيسية في الخلايا granulosa مثقف في عادية مقابل بكثافة عالية وطلاء- وكشف GC البقري مثقف تحت ظروف خالية من المصل لمد 8 لائحة محددة من عدة جينات العلامة المحددة. Boxplot عرض متوسط n = 3 replicates الفردية. ف < 0.05،-التائي t-اختبار. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
نموذج الثقافة عرض الخلية يوفر أداة لتحليل granulosa الخلية التمايز في المختبر. أظهرت العديد من الدراسات أن زراعة خالية من المصل شرط أساسي للحفاظ على نشاط ستيرويد في GC البقري مثقف أو GC من سائر الأنواع8،9. بالإضافة إلى ذلك، طلاء الطبق الثقافة مع عناصر المصفوفة خارج الخلية (مثلاً، الكولاجين R)13، تحسنا عن ارتباط الخلايا. ميزة هامة أخرى هي فترة طويلة الثقافة. في الآونة الأخيرة، وقد ثبت أن ثقافة طويلة الأجل أمر ضروري للحصول على نشاط ستيرويدوجينيك كافية وتعبير عن granulosa الخلية هوية علامات17بشكل متوازن. ويبدو أن GC تتطلب الوقت للتعافي من الإجهاد البدني أثناء إجراء العزل.
مثقف الملاحق الإعلامية FSH، ومنتدى إدارة الإنترنت-1، والتشتوستيرون معروفة للحث على النشاط aromatase في GC. خصوصا، المكملات مع التشتوستيرون ضروري تماما، ك GC حاجة تمهيدا لتوليف استراديول. هذا وقد نشرت سابقا11،18 ، وعليه، كان لا مزيد من التحقيق خلال هذه الدراسة. ومع ذلك، قد يكون من الضروري لمجموعة عمليات تجريبية أخرى لتكيف من FSH، ومنتدى إدارة الإنترنت-1، وتركيزات التشتوستيرون.
للواسمات الأسلوب الموصوفة هنا يمكن أن تساعد على تحسين تنظيم تجارب زراعة الأنسجة بجعلها أكثر استقلالاً من إمدادات متفاوتة مع المبايض. ووفقا للتجارب السابقة، لا يؤثر نعد GC النمط الظاهري أو إنتاج المنشطات في الثقافة. أيضا، وفرة محاضر مبرز في الخلايا المستزرعة لم يكشف عن فروق كبيرة مقارنة العينات إعداد من الخلايا المعزولة حديثا مع الذين تعرضوا سابقا لتجميد16.
معلمة حاسمة للنموذج الحالي للثقافة GC هي الخلية تصفيح الكثافة. كما يتضح من نتائج الممثل، زيادة كثافة الطلاء الناجمة عن تغيرات ملحوظة في الخصائص الفسيولوجية والجزيئية. وتخضع العديد من الجينات بطريقة محددة، تشبه التغيرات التي هي فعل التحفيز LH في فيفو4،19. حقيقة أنه بازدياد كثافة خلية يمكن أن تدفع العمليات الشبيهة بالتمايز في GC البقري مثقف بدقة النظر في هذا GC في المختبر النموذجي لتجنب النتائج المتضاربة بين replicates. ولذلك، نتائج متناقضة مع دراسات أخرى يمكن أن يعزى إلى كثافات مختلفة الخلية وينبغي أن تدرس على نحو أوثق.
نموذج الثقافة الموصوف هنا كشفت عن عدم الاستجابة لله، كمحاضر مستقبلات لهكجر بالقرب من حد الكشف. ومن ثم محاكاة LH الطفرة على حد سواء الوضع في فيفو فشل للحث على التمايز13. على الرغم من ذلك، هذا النموذج يوفر أداة مفيدة لدراسة GC استراديول-نشطة في الثقافة الأولية، وخطوط GC البقري خاصة الوظيفية كما لا توجد في الوقت الحاضر.
ويمكن اختبار بروتوكولات العلاج المختلفة في النموذج الحالي للثقافة GC التي تساعد على كشف الآليات التنظيمية لإنتاج الستيرويد أو التمايز GC. علاوة على ذلك، واحدة من العوامل التي تشارك في العمليات الإنمائية يمكن تحليلها بشكل منفصل. ولذلك، يوفر هذا الطراز الثقافة أساسا للعديد من التطبيقات المختلفة.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونشكر شريتير فيرونيكا لها المساعدة التقنية الممتازة وتعديلات مفيدة نموذج الثقافة التقنية وخلية للواسمات الراسخة. بالإضافة إلى ذلك، نود أن نشكر أندرس الإيطاليون وروديوالد سوانهيلد لمساعداتها التقنية ممتازة في التحليل اللاحق.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS Instamed w/o Ca2+, Mg2+ | Merck-Millipore | L 182-05 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
| penicillin / streptomycin (10,000 IU / 10,000 µg/mL) | Merck-Millipore | A 2213 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
| amphotericin (250 µg/mL) | Merck-Millipore | A 2612 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
| 3 mL syringe (Omnifix Luer) | Braun | 4616025V | |
| 18 G needle | Roth | C724.1 | |
| fetal calf serum | Merck-Millipore | S 0115 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
| cryo-preservation vials (2 mL) | TPP Faust | TPP 89020 | |
| CoolCell LX cell freezing container | Corning | 432004 | |
| culture dish, 24-well, flat bottom | TPP Faust | TPP 92424 | |
| collagen R (0.2 %) | Serva | 47254 | |
| α-MEM | Merck-Millipore | F 0915 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
| L-Glutamin (200 mM) | Merck-Millipore | K 0282 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
| sodium bicarbonate | Merck-Millipore | L 1713 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
| BSA | Sigma | A3311 | |
| HEPES | Merck-Millipore | L 1603 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
| sodium selenite | Sigma | S9133 | dissolved in sterile water |
| transferrin | Sigma | T1283 | dissolved in sterile water |
| insulin (10 mg/mL) | Sigma | I0516 | dissolved in 1x PBS |
| NEA | Merck-Millipore | K 0293 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
| FSH | Sigma | F4021 | we prefer to use a stock solution of 2 µg/mL, diluted in 0.9 % NaCl |
| LR3-IGF-1 | Sigma | I1146 | we use a stock solution of 2 µg/mL, dissolved in 10 mM HCl and 1x PBS with 1 mg/mL BSA |
| androstenedione | Sigma | 46033 | we use a stock solution of 10 mM, diluted in 100 % ethanol |
References
- Gutierrez, C. G., Ralph, J. H., Telfer, E. E., Wilmut, I., Webb, R. Growth and antrum formation of bovine preantral follicles in long-term culture in vitro. Biology of Reproduction. 62 (5), 1322-1328 (2000).
- Cortvrindt, R., Hu, Y., Smitz, J. Recombinant luteinizing hormone as a survival and differentiation factor increases oocyte maturation in recombinant follicle stimulating hormone-supplemented mouse preantral follicle culture. Human Reproduction. 13 (5), 1292-1302 (1998).
- Paes, V. M., et al. Effect of heat stress on the survival and development of in vitro cultured bovine preantral follicles and on in vitro maturation of cumulus-oocyte complex. Theriogenology. 86 (4), 994-1003 (2016).
- Christenson, L. K., et al. Research resource: preovulatory LH surge effects on follicular theca and granulosa transcriptomes. Molecular Endocrinology. 27 (7), 1153-1171 (2013).
- Havelock, J. C., Rainey, W. E., Carr, B. R. Ovarian granulosa cell lines. Molecular and Cellular Endocrinology. 228 (1-2), 67-78 (2004).
- Bernath, V. A., et al. Cyclic AMP inhibits fibronectin gene expression in a newly developed granulosa cell line by a mechanism that suppresses cAMP-responsive element-dependent transcriptional activation. The Journal of Biological Chemistry. 265 (30), 18219-18226 (1990).
- Lerner, A. A., Salamone, D. F., Chiappe, M. E., Baranao, J. L. Comparative studies between freshly isolated and spontaneously immortalized bovine granulosa cells: protein secretion, steroid metabolism, and responsiveness to growth factors. Journal of Cellular Physiology. 164 (2), 395-403 (1995).
- Gutierrez, C. G., Campbell, B. K., Webb, R. Development of a long-term bovine granulosa cell culture system: induction and maintenance of estradiol production, response to follicle- stimulating hormone, and morphological characteristics. Biology of Reproduction. 56 (3), 608-616 (1997).
- Campbell, B. K., Scaramuzzi, R. J., Webb, R. Induction and maintenance of oestradiol and immunoreactive inhibin production with FSH by ovine granulosa cells cultured in serum-free media. Journal of Reproduction and Fertility. 106 (1), 7-16 (1996).
- Hillier, S. G., Whitelaw, P. F., Smyth, C. D. Follicular Oestrogen Synthesis - The Two-Cell, Two- Gonadotrophin Model Revisited. Molecular and Cellular Endocrinology. 100, 51-54 (1994).
- Silva, J. M., Price, C. A. Effect of follicle-stimulating hormone on steroid secretion and messenger ribonucleic acids encoding cytochromes P450 aromatase and cholesterol side-chain cleavage in bovine granulosa cells in vitro. Biology of Reproduction. 62 (1), 186-191 (2000).
- Portela, V. M., Zamberlam, G., Price, C. A. Cell plating density alters the ratio of estrogenic to progestagenic enzyme gene expression in cultured granulosa cells. Fertility and Sterility. 93 (6), 2050-2055 (2010).
- Baufeld, A., Vanselow, J. Increasing cell plating density mimics an early post-LH stage in cultured bovine granulosa cells. Cell and Tissue Research. 354, 869-880 (2013).
- Schneider, F., Brüssow, K. P. Effects of a preovulatory administered depot gonadotrophin-releasing hormone agonist on reproductive hormone levels and pregnancy outcome in gilts. Reproduction, Fertility and Development. 18 (8), 857-866 (2006).
- Baufeld, A., Koczan, D., Vanselow, J. Induction of altered gene expression profiles in cultured bovine granulosa cells at high cell density. Reproductive Biology and Endocrinology. 15 (1), (2017).
- Baufeld, A., Vanselow, J. Lactate promotes specific differentiation in bovine granulosa cells depending on lactate uptake thus mimicking an early post-LH stage. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 15 (2018).
- Yenuganti, V. R., Vanselow, J. Cultured bovine granulosa cells rapidly lose important features of their identity and functionality but partially recover under long-term culture conditions. Cell and Tissue Research. 368 (2), 397-403 (2017).
- Hamel, M., Vanselow, J., Nicola, E. S., Price, C. A. Androstenedione Increases Cytochrome P450 Aromatase Messenger Ribonucleic Acid Transcripts in Non-Luteinizing Bovine Granulosa Cells. Molecular Reproduction and Development. 70, 175-183 (2005).
- Gilbert, I., Robert, C., Dieleman, S., Blondin, P., Sirard, M. A. Transcriptional effect of the LH surge in bovine granulosa cells during the peri-ovulation period. Reproduction. 141 (2), 193-205 (2011).
