Summary
Uzun vadeli bir kültür model sığır granulosa hücre serum-Alerjik koşullar altında açıklanmıştır. Araştırmacılar farklı kaplama yoğunlukları östrojen üretimi ve özellikleri olarak etkileri çeşitli faktörler ve koşulları incelemek bu modeli verir sığır granulosa hücreleri.
Abstract
Yumurtalık granulosa hücreleri (GC) estradiol sentez önemli kaynağıdır. Preovulatory luteinizan hormon (LH) dalgalanma tarafından indüklenen, hücreleri granulosa ve, özellikle, granulosa hücre katmanı derinden onların morfolojik, fizyolojik ve moleküler özelliklerini değiştirmek ve progesteron üretimi gövde formu luteum gebelik bakımından sorumludur. Hücre kültür modelleri temel düzenleyici mekanizmaları folliculo luteal dönüşüm içinde yer alan eğitim için gerekli araçları vardır. Yalıtım yordam ve köklerinin (< 6 mm) küçük ve orta boyutlu dan bovine GC dondurma sunulan Protokolü odaklanır. Bu teknik ile GC neredeyse saf nüfusu elde edilebilir. Dondurma işlemi büyük ölçüde zaman hücre kültürü yönetiminin bağımsız olarak doğrudan birincil doku (yumurtalık) tedarik kolaylaştırır. Bu iletişim kuralı sığır GC estradiol aktif durumunu taklit eden bir serum serbest hücre kültür modeli açıklar. Başarılı steroid-aktif hücre kültürü için gerekli olan önemli koşulları boyunca protokolünün ele alınmıştır. Hücreleri kaplama yoğunluğu artan belirli bir tepki bir değişmiş gen ifade profil ve hormon üretimi tarafından belirtildiği şekilde indükler gösterilmiştir. Ayrıca, bu modeli daha da GC farklılaşması üzerine çalışmalar için bir temel oluşturur ve diğer uygulamaları sağlar.
Introduction
Farklı somatik foliküler hücre tipleri ince ayarlanmış ve iyi orkestra moleküler değişiklikler başarılı yumurtlama ve luteinization bağlıdır. Bu gelişim süreçleri ayrıntılarını tam olarak henüz anlaşılır değil beri daha fazla açıklama gereklidir. Vivo yaklaşımlar ayrıntılı ve pahalı ve özellikle, folliculogenesis sırasında ortaya çıkan adresi belirli moleküler mekanizmaları için başarısız. Bu nedenle, reductionistic vitro modelleri Ayrıca, hücresel ve moleküler ayrıntıları içgörü sağlamak için ihtiyaç vardır. Farklı çalışmalar Kültür bağlamında vitro fertilizasyon teknikleri1,2,3, Bütün köklerinin açıklar. Araştırmacılar farklılaşma mekanizmalar baktılar olduğundan, birçok çalışma foliküler GC üzerinde odaklanın. Bu hücreler, oosit ile doğrudan ilişkili östrojen üretiminin önemli kaynaklarıdır ve böylece, folliculogenesis ve luteinization4boyunca önemli bir rol oynamaktadır.
GC satırlarının farklı türlerden geliştirilmiştir hücre ölümsüzleştirdi. Bunların çoğu, ancak, yeterli bir steroid hormon üretimi5göstermek değil. Şimdiye kadar sadece bir telefon hattı GC oldu sığır6kurulan ama bu satırı steroidogenic faaliyete çeşitli pasajlar7' den sonra kaybetti. Bu nedenle, steroidogenesis beri ve özellikle de, estradiol üretim GC işlevlerin gerekli bir özelliktir, bu yönleriyle birincil hücre kültür modelleri incelemek için tavsiye edilir. Önceki çalışmalarda önemli estradiol üretim sadece serum serbest kültür koşulları8,9altında üremesini gösterilmiştir. GC başarısız olarak progesteron androstenedion10' a çevirmek için gerekli enzim ifade etmek daha fazla, estradiol sentez habercisi takviyesi başka bir, ön koşuldur. Ayrıca, FSH ve IGF-1 takviyesi vitro sinerjik etkisi aromataz, estradiol sentez11anahtar enzim en iyi duruma getirilmiş bir aktivite saptandı. Mevcut iletişim kuralında, GC kültür model üzerinde önemli bir etkiye sahip diğer önemli faktörler ayrıca açıklanmıştır. Özellikle, yoğunluk kaplama hücre12deneme sonucu üzerinde çok büyük etkileri vardır. Ayrıca, önemli ölçüde GC Fizyoloji kültür engel sığır GC dondurma tekniği oluşturulabilir. Bu teknik hücre kültür iş organizasyonu geliştirmeye ve tercih edilen kaplama yoğunluğu optimize etmek için yardımcı olur.
Protocol
Not: Sığır yumurtalıklar ticari bir mezbaha elde edilmiştir. Mezbaha yan topluluğu Alman yasalarına göre etik bir onay gerektirmez.
1. çalışma koşulları ve hazırlıkları
- Kısırlık garantilemek için tüm medya gerçekleştirmek ve doku hazırlık yanı sıra tüm kültür bir laminar akış Bank kullanarak bir özel hücre kültür laboratuarda çalışıyorum.
- 1 x 100 IU penisilin, 0.1 mg/mL streptomisin ve yumurtalık taşıtlar için 0,5 µg/µL amfoterisin ile takıma fosfat tamponlu tuz (PBS, pH 7,4) hazırlayın.
Not: Bu kurulum içinde 2 h yumurtalık alma ve GC yalıtma arasında maksimal süresi kadardır.
2. izolasyon sığır Granulosa hücre
-
Yalıtım yordamına başlamadan önce yüzeyden herhangi bir kan kaldırmak için yumurtalıklarda birkaç kez 1 x PBS (100 IU penisilin, 0.1 mg/mL streptomisin ve 0,5 µg/µL amfoterisin ile) yıkayın. Bir ölçek kullanın, yumurtalık içinde yer, 1 x PBS ile doldurun ve PBS tekrar atmak.
- Yumurtalık kalan herhangi bir kan temizlenir bu kadar yıkama 3 – 4 x, tekrarlayın.
- Bir yumurtalık mümkün contaminations en aza indirmek için % 70 alkol ile batırılmış bir laboratuvar silin kullanarak silin.
- 3 mL şırınga ve bir 18 G iğne ile küçük ve orta boyutlu köklerinin delinme tarafından GC Aspire edin (< cetvelle ölçülür 6 mm) ve bir 50 mL santrifüj tüpü foliküler sıvı Havuzu.
Not: şırınga nemlendirmek için 1 x PBS (100 IU penisilin, 0.1 mg/mL streptomisin ve 0,5 µg/µL amfoterisin ile) küçük bir miktar alır. Bu Folliküler sıvı az miktarda toplamak için yardımcı olur ve hücre şırınga yapışmasını önler. - Birkaç köklerinin delinme sonra şırınga ve iğne ara temizlik için 1 x PBS ile yıkayın.
3. hücre dondurma
-
Trypan mavi boyama kullanın ve bir hemasitometre altında hücreleri saymak.
- Hücrelerin sayısını saymak için bir tüp ile 1,5 µL % 0,25 trypan mavi çözüm hazırlamak.
Not: trypan mavi mavi görünür ölü hücreleri hücre bariyer sadece erişebildiğinden canlı hücreler günahı kalır. - 15 µL granulosa hücre süspansiyon trypan mavi ekleyin ve onları hafifçe karıştırın.
- Karışımı bir hemasitometre her iki odasında yerleştirin. Yaşam saymak (günahıÖrneğin,) bir büyük kare başına odası hücrelerde.
Not: her ne kadar bazı kan hücreleri görülebilir, onlar onların çok küçük boyutuna göre ayrılır. - Genel esaslarına göre her iki odası kareler ortalaması ile canlı hücreler sayısını hesaplamak; canlı hücreler oranını yumurtalık arasında değişebilir ama %6013aşmalıdır.
- Hücrelerin sayısını saymak için bir tüp ile 1,5 µL % 0,25 trypan mavi çözüm hazırlamak.
-
Bir örnek daha ayrıntılı bir çözümleme için bir başvuru olarak taze izole granulosa hücre havuzundan al.
- İzole GC hücre sayısı bağlı olarak, uygun bir sayı hücre başvuru örnekleri RNA, DNA veya protein hazırlık için bir kenara.
Not: sonraki diğer analizleri farklı, genellikle yüksek hücre sayıları gerektirebilir RNA izolasyon sonraki gen ifadesinin değerlendirilmesi için 1 x 105 hücreleri yeterli, olanlardır. - Bir veya daha fazla aliquots başvuru hücre taze bir tüp içinde yerleştirin ve oda sıcaklığında ve hücre Pelet elde etmek için en yüksek hızı (12.000 x g) 1 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant atmak.
- Hemen şok-örnekleri sıvı azot kıpırdama. Örnek-80 ° C'de depolayın
- İzole GC hücre sayısı bağlı olarak, uygun bir sayı hücre başvuru örnekleri RNA, DNA veya protein hazırlık için bir kenara.
-
Dondurma aşağıdaki gibi yapın.
- Dondurucu orta % 80 fetal buzağı serum (FCS) ve % 20 dimetil sülfoksit (DMSO) kullanarak hazırlayın.
- Yavaşça GC cips için GC için oda sıcaklığında ve 500 x g3 dk santrifüj kapasitesi.
- Süpernatant dikkatli bir şekilde çıkarın ve yavaşça hücreleri resuspend yok daha fazla hücre kadar % 100 FCS (Örneğin, 1 mL) içinde kümeleri görülebilir.
- 1 birim (Örneğin, 1 mL) hazır dondurma Orta hücre süspansiyon ekleyin ve karışımı kriyojenik bir şişe aktarın.
Not: Soğutucu koruma medya son konsantrasyonu % 90 FCS ve % 10 DMSO olacaktır. - Kriyojenik şişeyi hızlı donma engelleyen bir uzman (ticari olarak mevcut) dondurma kapsayıcısına getirin. Soğutma hızı örnekleri-1 ° C/dak Transfer dondurma konteyner içine en az 4 h için-80 ° C dondurucu aşmaması gerekir.
- Daha uzun depolama için kriyojenik şişeleri Ultra düşük sıcaklık kaplarda (Örneğin, sıvı faz azot konteynerler) yerleştirin.
Not: protokol, burada, dondurma daha uzun depolama sağlar gibi durdurulabilir.
4. medya ve kültür plakaları için hazırlanması hücre kültürü
-
Hücre kültür plakaları %0.02 kollajen R. ile kat
Not: Kollajen R GC geliştirilmiş bir ek olarak kültür için gerekli olduğu bilinmektedir.- Arıtılmış su hücre kültürü için uygun bir %0.02 kollajen R çözümle hazırlayın.
- İyi ücret 150 µL bir 24-şey tabak içinde eklemek (= 2 cm2/de) ve kültürünün bütün yüzeyi de kolajen R çözüm ile kaplıdır.
- Bir kaç saatliğine açık kapaklı kuru veya laminar akış mahallede bir gecede çözüm ver.
- Kültür plaka tamamen kuru olduğunda, onları kirlenme en aza indirmek 10-15 dk için UV ışığıyla ışınlatayım.
- Gerekirse, plakayı 4 ° C'de 2 aya kadar saklayın.
- Medya ve kültür iş laminar akış başlık altında için ek hazırlamak. GC başarılı bir kurtarma için onlar hemen çözdürme sonra işlenmek üzere var.
-
Aşağıdaki ortam hazırlamak.
- 2 mM L-glutamin, %0.084 sodyum bikarbonat, % 0,1 sığır serum albumin (BSA), 20 mM HEPES, 4 ng/mL Sodyum selenit, 5 µg/mL transferrin, 10 ng/mL insülin ve 1 mM esansiyel olmayan amino asitler ile α-Minimal gerekli ortam (α-MEM) ek.
- Ayrıca, 100 IU penisilin ve 0.1 mg/mL streptomisin ortamına Ekle.
Not: bir kez ısındı, antibiyotikler, yaklaşık 48 saat için stabildir. Bu nedenle, aliquot kültür set-up için medya ve planlanan medya istenilen miktarda Döviz. Yalnızca medya aliquots 37 ° c su banyosu içinde önceden ısıtmak. Hazırlanan medya artık 3 aydan fazla için 4 ° C'de muhafaza edilebilir. - Steroid kültürlü sığır GC etkinliğinde ikna etmek için α-MEM Ayrıca 20 ng/mL folikül - uyarıcı hormon (FSH) ile 50 ng/mL R3 IGF-1 ve 2 µM androstenedion takviyesi.
Not: Her zaman kısa bir süre önce bir kültür veya ortam değişimi başlangıcı bu bileşenler ek. Bu steroid etkinlik tehlikeye atabilir FSH ve IGF-1 hisse senedi çözümleri için tekrarlanan donma-çözülme döngüsü önlemek.
5. hücre kültür çalışma
- Hücreleri hızlı bir şekilde su banyosu için 3-4 dk 37 ° C'de erimek ve hücre süspansiyon 37 ° C önceden ısıtılmış α-MEM (olmadan hormon takviyesi) içine aktarın. Santrifüjü için son hacmi 10 mL önerilir.
- 3 dakika oda sıcaklığında ve 500 x gde GC santrifüj kapasitesi. Süpernatant atmak. Önceden ısıtılmış ve desteklenmiştir α-MEM ekleyin ve hücreleri dikkatle resuspend.
- Tohum GC, 1 x 105 veya iyi başına 1 x 106 hücre yoğunluğu son hacmi 500 µL. Teknik çoğaltır koşul başına en az üç kültür Wells içerir.
- 8 d için bir kuluçka-37 ° c % 5 CO2 hücre kültüründe kuluçkaya.
- Ortam değişimi her geçen gün gerçekleştirmek. Sadece üçte iki kültür ortamının stresi azaltmak için ve taze medya hücrelere uyarlaması kolaylaştırmak için değiştirin.
Not: GC kültür birkaç gün sonra tipik bir fibroblast benzeri fenotip oluşturmak ve birlikte küme eğilimindedir. Yüksek hücre yoğunluğu kültüründe daha büyük kümeler normal yoğunluk GC Kültür (Şekil 1, doğru kapı aynası sol vs ) ile karşılaştırıldığında daha sık bulunmuştur.
6. daha sonraki analiz kültürlü Granulosa hücre
- Steroid hormon analizi gerçekleştirmek için ortam toplamak ve -20 ° C'de dondurmak Harcanan medya [Örneğin, radioimmunoassay (RIA)]14östradiol ve progesteron konsantrasyon çözümlemek için uygun yöntemleri kullanın.
- Farklı hedef molekülleri (RNA, DNA, protein vb.)sonraki analiz için uygun bir lysing Ajan ile kültür çanak doğrudan hücrelerde tedarikçi tarafından önerildiği gibi koşullar.
Not: lysed hücreleri-20 ° C'de 1 hafta kadar saklanabilir çoğu yalıtım yordamları için burada, protokolü durdurmak mümkündür. Daha uzun depolama için hücreleri-80 ° C'de tutulmaları gerekir - Transkript bereket belirlemek, cDNA sentez ve nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) teknikleri15tarafından belirli transkript ölçmek için. İstatistiksel değerlendirme farklı hücre kültürleri, farklı hücre hazırlıkları (biyolojik çoğaltır) kökenli en az üç çoğaltmalar içermelidir.
Representative Results
GC fibroblastlar için karşılaştırılabilir bir hücre uzantısı biçimi olarak tipik bir fibroblast benzeri görünüm 1 x 105 hücreleri/iyi göstermek vasıl kaplama ve kümeleri (Şekil 1a ve 1 c) oluşturmak eğilimindedir. Kaplama yoğunluğu tarafından 10 kat artan 1 x 106 hücreler/iyi morfolojisi değişmedi ama daha fazla hücre kümeleri (Şekil 1b ve 1 d, oklar) görülebilir. Zaten gösterildiği gibi bir önceki yayın, kollajen kaplama kültür yemekleri büyük ölçüde hücreleri13eki geliştirilmiş.
İlk dondurma hücre kültürü ile karşılaştırıldığında bu doğrudan taze izole örnekleri kültürlü fizyolojik özellikleri önemli ölçüde değişmedi. Bu Şekil 2 ' de (qPCR tarafından ölçülen) transkript bereket birkaç işaretleyicinin genlerin ne zaman karşılaştırmak kültürlü hücreleri dondurulmuş ya da taze izole havuzlarından türetilmiş farklı değil gösterilir.
Şekil 3 sığır GC normal vs yüksek yoğunluklu kültürlü temsilcisi (RIA tarafından ölçülen) steroid hormon analizi sonuçlarını gösterir. Progesteron üretimi daha yüksek olma eğilimi ise estradiol konsantrasyonunu normal yoğunluk kültüre göre yüksek yoğunluklu kültüründe önemli ölçüde azalır.
Genlerin (qPCR tarafından ölçülen) çeşitli kültürlerde yüksek - vs normal yoğunluk karşılaştırmalı analizi önemli etkisi (Şekil 4) saptandı. CYP19A1anahtar enzim estradiol biyosentezi aromataz yanı sıra gonadotropin reseptör FSHR, kodlama, önemli ölçüde aşağı-düzenlenmiş. Buna ek olarak, RGS2 ve VNN2 genler önemli bir up-regülasyon gösterdi. Bu sonuçlar açıkça hücresel farklılaşma belirli işlemleri yoğunluk kaplama hücre artırarak indüklenir öneririz.
Şekil 1: kültürlü sığır granulosa hücreleri normal (sol kapı aynası) ve yüksek hücre yoğunluğu (doğru kapı aynası). 1 x 105 hücreleri/iyi bir yoğunluk kültürlü (a ve c) hücreler tipik bir fibroblast benzeri fenotip görüntülenir. (b ve d) GC büyük hücre kümeleri (oklar) formu eğilimi bir yüksek kaplama yoğunluğuna (1 x 106 hücreler/de) daha sık hücreleri normal yoğunluk (sol panelde) altında karşılaştırıldığında kültürlü. Ölçek çubukları 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: yalıtım hemen sonra ve sonra dondurma kültürlü hücreleri karşılaştırılması. Hücreleri de başına 1 x 105 hücre yoğunluğu, kültürlü. Birkaç işaret transkript gen ekspresyonu değerlendirildi ve kültürlü hücreleri ile veya olmadan bir ilk dondurma arasında hiçbir fark ortaya koymuştur. Kutu çizimi n sayılarının gösterir = 3. İki kuyruklu öğrenci t-testi, p-dahil değerlerdir. Bu rakam tekrar Baufeld ve Vanselow16oluşturulur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Steroid hormon konsantrasyonu granulosa hücrelerinde farklı kaplama yoğunlukları kültürlü. Progesteron (P4) konsantrasyon sadece daha yüksek olma eğilimi ise estradiol (E2) toplama ne zaman GC yüksek hücre yoğunluğu kültürlü önemli ölçüde azalmıştır. Hormon konsantrasyonu farklı hücre sayıları için normalize etmek DNA içeriği için giderilmiştir. Ortalama ve SEM n = 3 gösterilir. p > 0.05, iki kuyruklu öğrenci t-test. Bu rakam Baufeld ve ark. çoğaltılamaz 15. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Kültürlü granulosa hücrelerinde fonksiyonel anahtar transkript bolluk bir normal vs yüksek kaplama yoğunluğu. Sığır GC 8 d için serum serbest koşullarda kültürlü belirli bir düzenleme birkaç seçili marker gen saptandı. Kutu çizimi n sayılarının görüntüler 3 bireysel çoğaltır =. p < 0,05, iki kuyruklu öğrenci t-test. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Sunulan hücre kültür modeli granulosa hücre farklılaşması içinde vitroanaliz etmek için bir araç sağlar. Çeşitli çalışmalarda serum-Alerjik ekimi kültürlü sığır GC veya diğer türler8,9GC steroid etkinliğini korumak için bir ön koşul olduğunu gösterdi. Ayrıca, hücre dışı matriks (Örneğin, kollajen R)13bileşenleri ile kültür çanak kaplama, ekin hücrelerin belirgin bir biçimde iyileştirilmiş. Bir diğer önemli özelliği uzun süreli kültür dönemdir. Son zamanlarda, uzun vadeli bir kültür yeterli steroidogenic etkinliği ve granulosa hücre kimlik işaretleri17dengeli bir ifade elde etmek gerekli olduğunu kanıtlanmıştır. Görünüşe göre GC yalıtım işlem sırasında fiziksel stresten kurtarmak için zaman gerektirir.
FSH, IGF-1 ve androstenedion aromataz etkinliğinde ikna etmek için bilinen medya takviyeleri GC kültürlü. Özellikle, ile androstenedion takviyesi kesinlikle gereklidir GC olarak bir habercisi estradiol sentezi için gerekir. Bu oldu daha önce11,18 yayınlandı ve bu nedenle, daha fazla çalışmanın sırasında soruşturma değil. Ancak, FSH, IGF-1 ve androstenedion konsantrasyonları bir uyarlaması deneysel diğer set-up için gerekli olabilir.
Burada açıklanan dondurma tekniği yanında yapım onları daha yumurtalık ile değişen kaynağından bağımsız doku kültürü deneyleri organizasyonu geliştirmeye yardımcı olabilir. Önceki test göre dondurma GC fenotip veya steroid kültür üretiminde etkilemez. Ayrıca, işaretleyici transkript kültürlü hücrelerdeki bereket önemli farklılıklar taze izole hücreler bu daha önce dondurma16için tabi ile hazırlanan örnekleri karşılaştırma olmadığını göstermiştir.
Mevcut GC kültür modeli için çok önemli bir parametre yoğunluğu kaplama hücredir. Temsilcisi sonuçlarıtarafından gösterildiği gibi kaplama yoğunluğu artan fizyolojik ve moleküler özellikleri dikkat çekici değişiklikler indüklenen. Çeşitli genler LH stimülasyon vivo içinde4,19tarafından indüklenir değişiklikleri benzeyen belirli bir şekilde düzenlenmiştir. Artan bir hücre yoğunluğu kültürlü sığır GC farklılaşma benzeri işlemler sürebilirim aslında titizlikle bu GC vitro modelde çoğaltır arasında çakışan sonuçları önlemek için dikkate alınması gereken vardır. Bu nedenle, diğer çalışmalar çelişkili sonuçlar için farklı hücre yoğunluğu atfedilen ve daha yakından incelenmesi gerekir.
Açıklanan kültür modeli algılama sınıra yakın reseptör LHCGR transkript bir çoğu burada ortaya LH için olmayan duyarlı olmak. Bu nedenle, hem LH dalgalanma bir simülasyon vivo içinde durum farklılaşma13ikna etmek başarısız oldu. Yine de, bu modeli estradiol aktif GC birincil kültür eğitim için yararlı bir araç sağlar, şu anda özellikle kadar hayır fonksiyonel sığır GC satır yok.
Farklı tedavi protokollerinin steroid üretim ya da GC farklılaşma düzenleyici mekanizmaları çözmeye yardımcı mevcut GC kültür modeli test edilebilir. Gelişim süreçlerinde söz konusu daha fazla, tek etkenler ayrı ayrı analiz edilebilir. Bu nedenle, bu kültür model birçok farklı uygulama için bir temel sağlar.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Biz Veronica Schreiter onun mükemmel teknik yardım ve kurulan dondurma tekniği ve hücre kültür modeli yararlı değişiklikler için teşekkür ederim. Ayrıca, biz gibi Maren Anders ve Swanhild Rodewald daha sonraki analiz onların mükemmel teknik yardım için teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS Instamed w/o Ca2+, Mg2+ | Merck-Millipore | L 182-05 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
| penicillin / streptomycin (10,000 IU / 10,000 µg/mL) | Merck-Millipore | A 2213 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
| amphotericin (250 µg/mL) | Merck-Millipore | A 2612 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
| 3 mL syringe (Omnifix Luer) | Braun | 4616025V | |
| 18 G needle | Roth | C724.1 | |
| fetal calf serum | Merck-Millipore | S 0115 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
| cryo-preservation vials (2 mL) | TPP Faust | TPP 89020 | |
| CoolCell LX cell freezing container | Corning | 432004 | |
| culture dish, 24-well, flat bottom | TPP Faust | TPP 92424 | |
| collagen R (0.2 %) | Serva | 47254 | |
| α-MEM | Merck-Millipore | F 0915 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
| L-Glutamin (200 mM) | Merck-Millipore | K 0282 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
| sodium bicarbonate | Merck-Millipore | L 1713 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
| BSA | Sigma | A3311 | |
| HEPES | Merck-Millipore | L 1603 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
| sodium selenite | Sigma | S9133 | dissolved in sterile water |
| transferrin | Sigma | T1283 | dissolved in sterile water |
| insulin (10 mg/mL) | Sigma | I0516 | dissolved in 1x PBS |
| NEA | Merck-Millipore | K 0293 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
| FSH | Sigma | F4021 | we prefer to use a stock solution of 2 µg/mL, diluted in 0.9 % NaCl |
| LR3-IGF-1 | Sigma | I1146 | we use a stock solution of 2 µg/mL, dissolved in 10 mM HCl and 1x PBS with 1 mg/mL BSA |
| androstenedione | Sigma | 46033 | we use a stock solution of 10 mM, diluted in 100 % ethanol |
References
- Gutierrez, C. G., Ralph, J. H., Telfer, E. E., Wilmut, I., Webb, R. Growth and antrum formation of bovine preantral follicles in long-term culture in vitro. Biology of Reproduction. 62 (5), 1322-1328 (2000).
- Cortvrindt, R., Hu, Y., Smitz, J. Recombinant luteinizing hormone as a survival and differentiation factor increases oocyte maturation in recombinant follicle stimulating hormone-supplemented mouse preantral follicle culture. Human Reproduction. 13 (5), 1292-1302 (1998).
- Paes, V. M., et al. Effect of heat stress on the survival and development of in vitro cultured bovine preantral follicles and on in vitro maturation of cumulus-oocyte complex. Theriogenology. 86 (4), 994-1003 (2016).
- Christenson, L. K., et al. Research resource: preovulatory LH surge effects on follicular theca and granulosa transcriptomes. Molecular Endocrinology. 27 (7), 1153-1171 (2013).
- Havelock, J. C., Rainey, W. E., Carr, B. R. Ovarian granulosa cell lines. Molecular and Cellular Endocrinology. 228 (1-2), 67-78 (2004).
- Bernath, V. A., et al. Cyclic AMP inhibits fibronectin gene expression in a newly developed granulosa cell line by a mechanism that suppresses cAMP-responsive element-dependent transcriptional activation. The Journal of Biological Chemistry. 265 (30), 18219-18226 (1990).
- Lerner, A. A., Salamone, D. F., Chiappe, M. E., Baranao, J. L. Comparative studies between freshly isolated and spontaneously immortalized bovine granulosa cells: protein secretion, steroid metabolism, and responsiveness to growth factors. Journal of Cellular Physiology. 164 (2), 395-403 (1995).
- Gutierrez, C. G., Campbell, B. K., Webb, R. Development of a long-term bovine granulosa cell culture system: induction and maintenance of estradiol production, response to follicle- stimulating hormone, and morphological characteristics. Biology of Reproduction. 56 (3), 608-616 (1997).
- Campbell, B. K., Scaramuzzi, R. J., Webb, R. Induction and maintenance of oestradiol and immunoreactive inhibin production with FSH by ovine granulosa cells cultured in serum-free media. Journal of Reproduction and Fertility. 106 (1), 7-16 (1996).
- Hillier, S. G., Whitelaw, P. F., Smyth, C. D. Follicular Oestrogen Synthesis - The Two-Cell, Two- Gonadotrophin Model Revisited. Molecular and Cellular Endocrinology. 100, 51-54 (1994).
- Silva, J. M., Price, C. A. Effect of follicle-stimulating hormone on steroid secretion and messenger ribonucleic acids encoding cytochromes P450 aromatase and cholesterol side-chain cleavage in bovine granulosa cells in vitro. Biology of Reproduction. 62 (1), 186-191 (2000).
- Portela, V. M., Zamberlam, G., Price, C. A. Cell plating density alters the ratio of estrogenic to progestagenic enzyme gene expression in cultured granulosa cells. Fertility and Sterility. 93 (6), 2050-2055 (2010).
- Baufeld, A., Vanselow, J. Increasing cell plating density mimics an early post-LH stage in cultured bovine granulosa cells. Cell and Tissue Research. 354, 869-880 (2013).
- Schneider, F., Brüssow, K. P. Effects of a preovulatory administered depot gonadotrophin-releasing hormone agonist on reproductive hormone levels and pregnancy outcome in gilts. Reproduction, Fertility and Development. 18 (8), 857-866 (2006).
- Baufeld, A., Koczan, D., Vanselow, J. Induction of altered gene expression profiles in cultured bovine granulosa cells at high cell density. Reproductive Biology and Endocrinology. 15 (1), (2017).
- Baufeld, A., Vanselow, J. Lactate promotes specific differentiation in bovine granulosa cells depending on lactate uptake thus mimicking an early post-LH stage. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 15 (2018).
- Yenuganti, V. R., Vanselow, J. Cultured bovine granulosa cells rapidly lose important features of their identity and functionality but partially recover under long-term culture conditions. Cell and Tissue Research. 368 (2), 397-403 (2017).
- Hamel, M., Vanselow, J., Nicola, E. S., Price, C. A. Androstenedione Increases Cytochrome P450 Aromatase Messenger Ribonucleic Acid Transcripts in Non-Luteinizing Bovine Granulosa Cells. Molecular Reproduction and Development. 70, 175-183 (2005).
- Gilbert, I., Robert, C., Dieleman, S., Blondin, P., Sirard, M. A. Transcriptional effect of the LH surge in bovine granulosa cells during the peri-ovulation period. Reproduction. 141 (2), 193-205 (2011).
