Summary
여기, 선물이 placental chondroitin 황산 염 A 바인딩 펩 티 드 (plCSA-BP)의 합성에 대 한 프로토콜-지질 고분자 나노 입자를 통해 단일 단계 쥡니다 bioconjugate 기법을 활용. 이 입자는 가장 인간의 종양 및 암 및 태 반 장애 치료에 태 반 trophoblasts 치료제의 대상된 배달에 대 한 새로운 도구를 구성 합니다.
Abstract
효과적인 암 치료 방법 감소 하 고 최소한의 조직 독성으로 종양을 제거 합니다. 적극적으로 대상 나노 암 치료 하는 유망한 접근 방식을 제공합니다. glycosaminoglycan placental chondroitin 황산 염 (plCSA)에 다양 한 암 세포와 태 반 trophoblasts 및 말라리아 단백질 VAR2CSA plCSA 바인딩할 수 있는 구체적으로 표현 된다. 암 세포와 태 반 trophoblasts plCSA 보고 placental chondroitin 황산 염 A 바인딩 펩 티 드 (BP plCSA), 말라리아 단백질 VAR2CSA에서 파생 또한 구체적으로 바인딩할 수 있습니다. 따라서, plCSA BP 활용 된 나노 입자는 인간의 암 및 placental trophoblasts 대상된 약물 전달에 대 한 도구로 사용 될 수 있습니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 독 소 루비 (plCSA-DNPs); 로드 plCSA BP 활용 된 지질 고분자 나노 입자를 합성 하는 방법 단일 쥡니다 단계 및 bioconjugate 기술 방법에 의하여 이루어져 있다. 또한, plCSA-DNPs, 그들의 물리 화학적 특성 및 태 반 choriocarcinoma (JEG3) 셀에 의해 세포질 통풍 관을 결정 하는 포함 한 특성화를 위한 여러 가지 방법은 설명 합니다.
Introduction
효과적인 암 치료 방법 감소 하 고 최소한의 조직 독성으로 종양을 제거 합니다. 따라서, 선택적 종양을 대상으로 성공적인 치료 방법을 탐구 하는 열쇠입니다. 암 치료를 위한 유망한 기회를 제공 하는 나노 입자 그리고 다른 기능적인 그룹 분자 어셈블리 약물 효능을 강화 하 고 관련된 부작용1,2감소. 또한, 나노 시스템은 주로 수동 및 활성 대상 종양3연결할 대상 사용 합니다.
수동 타겟팅 나노 입자와 향상 된 침투성 및 종양 세포에 도달 하는 보존 (EPR) 효과의 타고 난 특성을 이용 한다. 양이온 리 종양 임상 응용4,,56에 다양 한 항 암 제 약물 전달에 성공적으로 사용 되었습니다. 잠재적인 효과적인 암 치료 효과도 불구 하 고 종양과 정상 조직에서 종양 세포를 구별 하는 무 능력에서 낮은 약물 농도 수동 타겟팅 나노7의 두 가지 주요 제한.
활성 타겟팅 전략 활용 항 원-항 체, 리간드-수용 체와 특히 종양8약물을 전달 하기 위해 다른 분자 인식 상호 작용. glycosaminoglycan placental chondroitin 황산 염 (plCSA)은 대부분 암 세포에 placental trophoblasts 광범위 하 게 표현 된다. 또한, 말라리아 단백질 VAR2CSA 바인딩할 수 있습니다 특히 plCSA9,10. 따라서, VAR2CSA는 인간의 암 세포를 대상으로 하는 도구 수 있습니다. 그러나, VAR2CSA은 나노 입자를 활용 때 전체 단백질 종양 세포에 나노 입자의 침투를 제한할 수 있습니다. 최근에, 우리는 plCSA 바인딩 펩 티 드 (BP plCSA), 말라리아 단백질 VAR2CSA에서에서 파생 된 발견. plCSA BP 활용 된 지질 고분자 나노 입자는 급속 하 게 choriocarcinoma 세포와 크게 증가 독 소 루비 (DOX) 항 암 제 활동 vivo 에서11;에 보 세 이 입자는 또한 특별히 placental trophoblasts에 접착 하 고 태12약물의 타겟된 납품을 위한 도구가 될 수 있을.
지질 고분자 나노 입자는 지질 단층 셸 및 소수 성 고분자 코어의 구성 고 약물 전달에 대 한 새로운 캐리어를 대표 한다. 이러한 나노 리 및 제어할 수 있는 나노 입자 크기, 높은 생체 적합성, 지속적인된 약물 방출, 높은 마약 로드 (르), 효율과 우수한 안정성13등 고분자 nanocarriers의 장점을 결합합니다. 이 작품에서는, 우리는 지질 고분자 나노 입자를 합성 하 단일 단계 쥡니다 메서드를 사용. 이 방법은 빠르고, 편리 하 고 확장에 적합 및 널리 이용 되는 지질 고분자 나노 입자를 준비 우리의 그룹11,14 다른 사람에 의해15,,1617,18 .
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide 염 산 염 (EDC) 아민 및 carboxylates19를 포함 하는 생체 변화에 대 한 교차 결합 시키는 대리인으로 사용 하는 인기 있는 carbodiimide 이다. EDC, 뿐만 아니라 N-hydroxysulfosuccinimide (NHS)은 표면 및 나노 활용 반응20,21에서 가장 일반적인 활용 시 약 이다. 보 건국 측 반응의 수를 줄일 수 및 안정성을 향상 하 고 에스터의 수율 중개자22,23.
여기, 우리는 plCSA 대상 지질 고분자 나노 입자를 합성 하는 프로토콜을 설명 합니다. 첫째, DOX 로드 지질 고분자 나노 입자 (DNPs)의 단일 단계 쥡니다 합성 설명 되어 있습니다. 그런 다음, plCSA BP 활용 된 지질 고분자 나노 입자를 생성 하기 위한 EDC/NHS bioconjugate 기술 도입. 이 bioconjugate 기술은 또한 다른 항 체와 펩 티 드 나노 입자를 켤레를 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 우리는 plCSA 대상 지질 고분자 나노 입자의 특성을 사용 하는 물리 화학적 속성 및 생체 외에서 분석 결과 설명 합니다. 우리는 이러한 plCSA 대상 지질 고분자 나노 입자 가장 인간의 암과 태 반 장애 치료에 태 반에 페이로드의 대상된 배달 하는 약물의 타겟된 배달에 대 한 효과적인 시스템을 구성 수 있습니다 믿습니다.
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Protocol
1입니다. 재고 솔루션의 준비
- 초순의 100 mL와 절대 에탄올의 4 mL를 희석 하 여 4% 에탄올 용액을 준비 합니다. 4 ° c.에 솔루션 저장
참고: 초순 박테리아, 입자, 이온, 또는 nucleases 등 오염 물질 없이 물으로 정의 됩니다. 초순 까지의 18.2 ㏁, 낮은 음이온 오염 즉 대상 저항력과 물 정화 시스템에서 얻은 했다. - 20 mg의 콩 레 시 틴 4% 에탄올 용액 20 mL에 용 해 하 여 1 mg/mL 콩 레 시 틴 재고 솔루션을 준비 합니다. 4 ° c.에는 콩 레 시 틴 재고 솔루션 저장
- 100mg DSPE-말뚝-COOH의 4% 에탄올의 수성 해결책의 4 mL에 용 해 하 여 25 mg/mL DSPE 말뚝 (2000)-COOH 재고 솔루션을 준비 합니다. -20 ° c.에 재고 솔루션 저장
- 초순의 5 mL에 DOX의 50 밀리 그램을 용 해 하 여 10 mg/mL DOX 재고 솔루션을 준비 합니다. 어둠 속에서 4 ° C에 DOX 재고 솔루션을 저장 합니다.
- 20mg PLGA의 이기의 10 mL에 용 해 하 여 2 mg/mL PLGA 재고 솔루션을 준비 합니다. 4 ° c.에서 PLGA 재고 솔루션 저장
주의: 이기는 가연성 및 독성. 증기 두건에 주의 하며 적절 한 개인 장비, 실험실 코트, 안전 유리, 라텍스 장갑 등을 착용 한다. - 2.17 g MES의 초순 물 100 mL에 용 해 하 여 0.1 m M 2-(morpholino) ethanesulfonic 산 (MES, pH 6.0) 재고 솔루션을 준비 합니다. 4 ° c.에 재고 솔루션 저장
2입니다. DNPs의 합성
참고: DOX 광화학 저하를 방지 하려면 모든 작업 어둠 속에서 수행 했다.
나노 입자는 이전에 보고 된 단일 단계 쥡니다 방법11,13,14에 의해 합성 되었다.
- 살 균 10 mL 원심 관에 4% 에탄올 용액 3 mL를 추가 합니다. 다음, 콩 레 시 틴 재고 솔루션의 90 µ g, DSPE-말뚝-COOH 재고 솔루션의 210 µ g와 DOX 재고 솔루션의 750 µ g의 4% 에탄올 용액 3 mL를 추가 합니다.
- 얼음 목욕으로 원심 분리기 튜브를 놓고 초음파 프로세서에 얼음 목욕을 배치 합니다.
- 1 mL 주사기 원심 분리기 튜브에 dropwise PLGA 재고 솔루션의 2 mg (1 드롭/4-6 s) 플라스틱. 한편,는 DNPs 합성 20 kHz의 주파수 및 5 분에 대 한 30%의 출력 진폭에 초음파 프로세서를 사용 하 여 튜브 sonicate.
참고: 작은 크기와 균일 한 입자를 합성 하는 PLGA 솔루션은 틈에 다 떨어뜨린 튜브에 속도 느려질 수 필요가 및 거품 발생을 피해 야 한다. - DNPs 0.1 M MES 버퍼 (pH 6.0)에 위의 솔루션을 세척 하 여 정화 3 번 사용 하 여 원심 분리기 필터 (MWCO, 10 kDa). 4 ° C에서 원심 분리기와 3 분 때마다 1000 × g 마지막으로, 약 1 mL MES 해결 나노 입자의 있어야 합니다.
참고:이 절차에서 허용 중지 지점입니다. 그렇지 않다면 켤레 펩 티 드에 사용 되는 나노 입자 수 정화 PBS 버퍼 (pH 7.4)에 의해 고 정화 DNPs 어둠 속에서 4 ° C에서 저장 될 수 있다.
3입니다. DNPs에 펩 티 드의 활용
-
에스테 르 활성화
- EDC의 0.4 mg을 추가 (최종 농도 2 m m) DNPs의 1 ml.
- 반응에 NHS의 0.24 mg을 추가 (최종 농도 2 m m).
참고: 쉽게 추가 EDC와 보 건국의 정확한 수량, 재고 솔루션 수 있습니다 준비는 시 약은 녹이 고 즉시 사용 하는 경우. - 잘, 반응 구성 요소를 혼합 하 고 통;에 반응 장소 어둠 속에서 실 온에서 반응에 대 일 분-1 시간을 허용 합니다.
-
아민 반응
- 증가 버퍼 pH 7.2-7.5를 사용 하 여를 PBS (20 ×, pH 7.4).
- 반응 솔루션에는 plCSA을 대상으로 펩 티 드 (plCSA-혈압, EDVKDINFDTKEKFLAGCLIVSFHEGKC)의 0.5 mg을 추가.
참고: 또한, 전에 20% 이기에 펩 티 드를 용 해. 펩 티 드를 분해할 수 없는 경우, 목욕 sonicator에 쥡니다 도움이 있습니다. - 혼합 솔루션을 잘, 그리고 통;에 장소 밤새 어둠 속에서에서 4 ° C에서 진행 하는 반응을 수 있습니다.
- 투 석 가방 (MWCO, 3500 다) dialyze plCSA DNPs 정화 하 켤레 솔루션 장소 어둠 속에서 24 시간 실 온에서 PBS (pH 7.4) 버퍼를 사용 하 여.
참고: 또는, 정화 수 수행 단계 plCSA DNPs를 2.4에서. - 셀 문화 응용 프로그램에 대 한 잠재적인 침전 제거 하 0.22 μ m 무 균 주사기 필터를 통해 재구성된 솔루션을 필터링 합니다.
4. plCSA-타겟 지질 특성-고분자 나노 입자
-
동적 산란 (DL)을 사용 하 여 유체 나노 크기의 측정
- 초순 수 (50-fold 희석)와 나노 입자를 희석. DL 또는 제타 잠재적인 악기의 지시에 따라 멧에 500 µ L의 샘플을 로드 합니다.
참고: Zeta 잠재력과 DL 큐 벳 다 수 있습니다 악기의 사양에 따라. - 측정 완료 후 입자 직경, 증가할수록 인덱스 (PDI)와 제타 잠재적인 기록 합니다. 평균 4에서 얻은 결과 판독, 반복 하 고 표준 편차를 계산.
- 초순 수 (50-fold 희석)와 나노 입자를 희석. DL 또는 제타 잠재적인 악기의 지시에 따라 멧에 500 µ L의 샘플을 로드 합니다.
-
전송 전자 현미경 (TEM)
참고:는 나노 입자의 형태 부정적인 얼룩 방법으로 TEM으로 관찰 되었다. 24- 초순 수 (400-fold 희석)와 나노 입자를 희석. TEM grid에 샘플의 20 µ L을 추가 하 고 5 분 동안 앉아 있게.
- 2% (w/v) phosphotungstic 산의 100 µ L을 추가 하 고 2 분 윅 거리는 물방울 앉아 허용.
- 실 온에서 가장 표를 건조.
- 80 편 가속 전압 설정 kV, 100000 ×는 나노 입자를 시각화 하는 이미지를 확대.
-
캡슐화 효율 (EE)의 결정 및 르
- 표준 곡선 생성입니다. 5 다른 농도의 DOX 솔루션 준비 하 초순에 DOX 분해: 1 µ g/mL, 5 µ g/mL, 10 µ g/mL, 50 µ g/mL, 및 100 µ g/mL. 480에 DOX 솔루션의 흡수 측정 nm UV 마주 분석기. DOX 농도에 따라 표준 곡선을 생성 합니다.
- 초순의 500 µ L와 나노 입자의 25 µ L를 희석. 480에 흡수 측정 nm UV 마주 분석기. 표준 곡선에 의해 약물 농도 계산 합니다.
- 다음 수식을 사용 하 여 르 계산:
르 = ((나노 입자에 약물의 양) / (총 재료의 무게)) × 100%. - 다음 수식을 사용 하 여 전자 계산:
EE = ((나노 입자에 약물의 양) / (금액 추가 약)) × 100%.
-
Bicinchoninic 산 (BCA) 분석 결과 사용 하 여 활용 효율의 측정 25 , 26 , 27
- 중복에 미 판 우물에 표준 펩타이드 솔루션 (표 1) 또는 plCSA DNPs의 25 µ L 플라스틱. 각 잘 200 µ L 작업 시 약의 추가 하 고 혼합 30 판 통에 잘 접시 s.
- 커버 플레이트, 그리고 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.
- 562에서 흡 광도 측정 플레이트 리더에 nm. PlCSA-DNPs의 plCSA 농도 계산 하는 생성 된 표준 곡선을 사용 합니다.
- 다음 수식을 사용 하 여 활용 효율을 계산:
활용 효율 = ((펩 티 드에 나노 입자의 양) / (금액 추가 펩 티 드)) × 100%.
| 유리병 | 희석제 (μ)의 볼륨 | 볼륨 및 펩 티 드 (μ)의 소스 | 마지막 펩 티 드 농도 (μ g/mL) |
| A | 0 | 재고의 300 | 1000 |
| B | 250 | 유리병 희석 250 | 500 |
| C | 250 | 유리병 B 희석의 250 | 250 |
| D | 250 | 유리병 C 희석의 250 | 125 |
| E | 300 | 유리병 D 희석의 200 | 50 |
| F | 250 | 유리병 E 희석의 250 | 25 |
| G | 400 | 유리병 F 희석의 100 | 5 |
| H | 500 | 0 | 0 |
표 1입니다. 표준 펩 티 드의 준비
5. 형광 현미경 검사 법 평가 Choriocarcinoma (JEG3) 세포에 나노 통풍 관 plCSA 대상
- 씨앗에서 1.0 × 10 살 균 12-잘 접시에 셀4 셀/잘 완전 한 DMEM/F12 (cDMEM/F12, 1% 페니실린/스와 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 포함). 습 한 조건 하에서 37 ° C, 5% CO2 60% 합류에 성장 셀 수 있습니다.
- 미디어를 제거 하 고 차가운 신선한 미디어 콘텐츠를 낮은 혈 청 1 mL을 추가 (5 %FBS) 및 DNPs 또는 plCSA-DNPs (DOX 상응의 5 µ g).
- 셀과 1 시간에 4 ° C에서 나노 입자의 혼합물을 품 어.
- 부 화, 이후 미디어를 제거 하 고 3 회 PBS로 세포 세척. 그런 다음, 신선한 cDMEM/F12의 1 개 mL를 추가 하 고 30 분 동안 37 ° C에 세포를 품 어.
- CDMEM/F12, 제거 하 고 3 회 PBS로 세포 세척.
- 찬 4 %paraformaldehyde (PFA)의 2 개 mL를 추가 하 고 셀을 해결 하기 위해 15 분 동안 실 온에서 품 어.
- PFA는 제거 합니다. 2 mL PBS의 셀을 한 번 세척. DAPI를 포함 하는 PBS의 1 mL를 추가 (1 µ g/mL) 얼룩, 핵에 대 일 분 동안 실내 온도에 품 어 고.
- PBS, 발음 하 고 세 번 PBS 가진 세포를 씻어.
- 설치 매체를 추가 하 고 시각화 DOX와 핵, 각각 녹색 및 파랑 채널을 사용 하 여 형광 현미경으로 형광 이미지.
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Representative Results
이 프로토콜에서 PLGA, DSPE-말뚝-COOH와 콩 레 시 틴은 대표적인 폴리머, 지질-말뚝-COOH 공액 및 지질, 각각. EDC/NHS 기술과 쥡니다 메서드 를 통해 단일 단계 plCSA 대상 지질-폴리머 나노 입자의 합성은 그림 1에 나와 있습니다. 첫째, 조건 하에서 쥡니다, 콩 레 시 틴, PLGA와 DSPE-말뚝-COOH 자기 조립 형태의 코어-쉘 구조 DNPs. 핵심 PLGA와 캡슐화 된 DOX 이루어져, 셸 구성 DSPE-말뚝-COOH, 그리고 껍질과 코어의 인터페이스에는 콩 레 시 틴 단층. 다음,-COOH 그룹 DNP 표면에 노출 되는 펩 티 드 를 통해 EDC/NHS 기술을 합성 plCSA DNPs의-NH2 그룹으로 활용 했다.
이 프로토콜에 DNPs 직경, 82.3 ± 4.7 nm 되었고 plCSA BP를 활용, 후 주 DNPs의 직경 증가 109.3 ± 5.9 nm (그림 2). DNPs plCSA-DNPs의 PDI 되었고 0.127±0.005 0.134 ± 0.065, 각각. DNPs plCSA-DNPs의 TEM 이미지는 또한 입자 분산 잘 했다 하 고 일반적으로 구형 형태학 (그림 3) 했다 보여주었다. DNPs plCSA-DNPs의 zeta 잠재력은-20.1 ± 1.32 mV와-29.9 ± 3.56 mV, 각각 (표 2). 따라서, 이러한 나노 입자는 매우 안정적인 것으로 예상 됩니다.
| 나노 입자 | Diameter(nm) | PDI | Zeta 잠재력 (mV) |
| DNPs | 82.3±4.7 | 0.127±0.005 | -20.1±1.32 |
| plCSA-DNPs | 109.3±5.9 | 0.134±0.065 | -29.9±3.56 |
| PDI:polydispersity 인덱스입니다. 데이터는 표시 되는 평균 ± SD (n = 3). | |||
표 2입니다. 나노 입자의 특성
EE와 르 nanoparticles의 임상 응용 프로그램에 대 한 중요 하다. DNPs plCSA-DNPs에 의해 DOX EE 40.3 ± 1.67%와 39.5 ± 1.94%, 각각 이었다. DNPs 및 plCSA DNPs DOX 르 6.2 ± 0.74%와 5.1 ± 0.42%, 각각 이었다. 이러한 데이터는 plCSA BP 장식 후 마약 로드와 마약 캡슐화의 정도 유지 되었다 보여주었다. DNPs의 표면에 plCSA 혈압의 장식 효율 BCA 분석 결과 (그림 4)에 의해 결정 되었다. PlCSA-BP 활용 효율 될 45.5 ± 3.7% 발견 됐다.
JEG3 세포질 통풍 관 분석 결과 표시 plCSA DNPs 빠르게 30 분 (그림 5) 내의 JEG3 셀에 바인딩된. 따라서, plCSA-혈압이이 프로토콜에 DNP 표면에 효율적으로 활용 했다. 또한, plCSA BP 빠르게 바인딩할 JEG3 셀 고 수는 나노 입자의 세포질 통풍 관을 증가 있습니다.
그림 1입니다. PlCSA 대상으로 지질 고분자 나노 입자를 합성 하는 데 사용 하는 방법의 개요 그림. 첫째, 단일 단계 쥡니다 방법은 합성 지질 고분자 나노 입자 (DNPs), 사용 되었다 그리고 EDC/NHS 기술 나노 표면 (plCSA-DNPs)에 펩 티 드를 켤레에 사용 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 다른 나노 입자의 크기. 유체역학 크기 DNPs (A)와 (B) DL로 측정 plCSA-DNPs입니다. 대표적인 인물 입자 크기와 크기 분포를 보여 주기 위해 제공 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. 나노 입자 형태로 가장 특징. DNPs (A)와 plCSA-DNPs (B) 2 %phosphotungstic 산 성 얼룩과 관찰의 일반적인 TEM 이미지. 눈금 막대 = 100 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4입니다. BCA 분석 결과 사용 하 여 활용 효율성의 측정. 562에서 펩 티 드의 표준 곡선 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5입니다. JEG3 셀에 의해 나노 통풍 관. JEG3 세포는 5 µ g/mL 다른 나노 입자를 가진 외피의 30 분 후 형광 현미경 검사 법에 의해 분석 되었다. 레드: DOX, 파랑: DAPI 표시 된 핵. 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 프로토콜에는 plCSA BP 활용 된 지질 고분자 나노 입자를 합성 한 효율적이 고 재현 가능한 방법을 제공 한다. 지질 고분자 나노 입자를 준비 하는 단일 단계 쥡니다 메서드는 재현할 수 빠르고 난방, vortexing, 또는 증발을 포함 하는 일반적인 nanoprecipitation 방법에서 다른. 따라서, 개발된 방법은 크게 합성 시간을 줄일 수 있습니다. 또한,이 프로토콜에 사용 된 EDC/NHS bioconjugate 켤레 펩 티 드 및 나노 입자에 항 체를 일반적으로 사용 하 고 편리한 기술입니다. 따라서, 조합 plCSA을 대상으로 지질-폴리머 합성 EDC/NHS bioconjugate 기술로 단일 단계 쥡니다 메서드의 나노 확장할 수 있습니다 임상 응용 프로그램에 대 한.
특정 절차는 성공적으로 합성 및 plCSA DNPs에 대 한 중요 합니다. 첫째, 레 시 틴, PLGA와 DSPE-말뚝-COOH의 상대 농도 지질 고분자 나노 입자 크기와 증가할수록 결정합니다. 때 레 시 틴의 농도가 증가할수록 낮은 DSPE-말뚝-COOH의 높은 농도 더 작은 나노 크기, 따라서 감소 마약 르13,15 , 고정 됩니다. PLGA의 농도 고정 하는 경우 더 DSPE-말뚝-COOH는 높은 나노 증가할수록 및 큰 나노 크기15레 시 틴에 의해 대체 됩니다. 이 경우에는 나노 입자는 더 불안정 하 고 집계 쉽게. 이 프로토콜에서 DSPE-말뚝-COOH/PLGA 중량 비율은 0.11, 이며 레 시 틴/DSPE-말뚝-COOH 대량 비율은 0.43. 지질 고분자 나노 입자 크기는 약 82 약 0.127의 PDI nm.
둘째,은 나노 입자에 펩 티 드의 활용 하는 동안 솔루션의 pH 최대 중요성 이다. 에스테 르 활성화의 최적 pH는 5.0-6.0, 그리고 아민 반응 pH 7.2-7.519,,2829에 가장 효율적입니다. 최상의 결과 얻으려면에 대 한 반응이 두 단계에서 수행 되어야 합니다. 첫째, 에스테 르 활성화 pH 5.0-6.0에서 MES (또는 다른 noncarboxylate, nonamine 버퍼)에 발생합니다. 그런 다음 pH 7.2-7.5를 사용 하 여 PBS (또는 다른 nonamine 버퍼) 포함 하는 아민 분자19반응 직전 조정 됩니다. NHS 에스테 르의 반감기는 pH 7.019에서 4-5 h 고려, 아민 반응의 기간 초과 4 ° c.에 10 h
마지막 중요 한 요인은 나노 글귀 이다. JGE3 세포에 의해 DNPs의 nontargeted 이해 문화 시간 및 온도 매체에 있는 FBS의 농도 조절 하 여 대상된 통풍 관의 기능 분석에서 탈락 했다. 이 프로토콜에서 JEG3 셀은 알을 품을 5% FBS 1 h, 그리고 다음 30 분 동안 37 ° C에서 교양 4 ° C에서 DNP 세포질 통풍 관을 최소화 하기 위해.
절차 중에 문제가 발생 하는 경우 합성 및 plCSA DNPs의 특성에 관련 된 세 가지 주요 문제 해결 단계가 있습니다. 첫째, 지질 고분자 나노 입자에 의해 준비 되었다는 PLGA와 레 시 틴 쥡니다 조건 하에서 자기 조립. PLGA는만 유기 용 매에 녹 인 다. 따라서, 친수성 용 매 뿐만 아니라, 시 PLGA 침전 신속 하 게 작은 나노 입자에. Dropwise 추가의 속도의 효과 최소화 하 고 더 큰 입자를 생성 방지, PLGA를 추가 하기 전에 1-2 분을 위한 혼합물의 쥡니다 필요 이다. 둘째, BCA 메서드를 사용 하 여 plCSA BP 활용 효율의 정량 분석은 신속 하 고 편리한, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 분석 결과 더 정확 합니다. HPLC 실험 내용이 되었습니다30,,3132우리의 그룹11 등 설명. 마지막으로, plCSA-DNP 세포질 통풍 관에 대 한 최적의 조건을 다른 암 세포에 대 한 달라질 수 있습니다. 점차적으로 FBS 농도 감소 하 고 37 ° C에 외피 시간 최적의 조건을 확인할 수 있습니다.
프로토콜의 한 가지 한계는 약물의 hydrophobicity는 약물의 EE를 결정 합니다. 친수성 약물에 비해, 소수 성 약물 PLGA 증가 약물 EE에에서 어떤 결과 대 한 강한 친근감을가지고. 이러한 경우에 plCSA 대상 지질 고분자 나노 입자의 합성에 대 한 절차는 르와 EE 이상적인 약물에서 발생 하는 가장 효율적인 합성 방법을를 실험적으로 시험 될 할 것 이다.
위에서 설명 했 듯이, glycosaminoglycan plCSA 대부분의 암 세포와 태 반 trophoblasts에 구체적으로 표현 된다. 따라서, 그것은 중요 한만 nonpregnant 동물에 인간, 종양 세포를 치료의 대상 배달 plCSA-NPs를 사용 해야 합니다 이러한 약물 로드 입자 임신 동물의 태 반에 부작용으로 이어질 것이 고 인간입니다.
요약 하자면, 우리는 plCSA 대상 지질 고분자 나노 입자를 합성 하는 간단 하 고 편리한 방법을 설명 했습니다. 이 프로토콜의 중요성은 그것은 부수적인 독성을 최소화 하면서 종양 및 태 반, 마약 가용성 증가. 이 방법은 종양과 태 반에 약물의 타겟된 배달 위해 유용 해야 한다, 나중에 임상 응용 프로그램에 대 한 plCSA 대상 지질 고분자 나노 입자를 준비 하 조절 될 수 있습니다.
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Disclosures
X.F.와 B.Z.는 특허 PCT/CN2017/108646와 201710906587.6 님 민 plCSA 대상 나노 입자 합성 방법 및 응용 프로그램에 발명가. 잠재적인 충돌의 관심은 다른 작가 의해 공개 됐다.
Acknowledgments
이 작품에는 자연 과학 재단의 광둥 성 (2016A030313178), 국가 자연과학 기초 (81571445 및 81771617)와 중국의 개발 프로그램 (2016YFC1000402), 국가 핵심 연구에서 교부 금에 의해 지원 되었다 X.F. 및 X.F.에 심천 기본 연구 기금 (JCYJ20170413165233512)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plCSA peptide | Shanghai GL Biochem | 573518 | for peptide synthesis |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical | 10009218 | for nanoparticles synthesis |
| Soybean lecithin | Avanti Polar Lipids | 441601 | for nanoparticles synthesis |
| DSPE-PEG-COOH | Avanti Polar Lipids | 880125 | for nanoparticles synthesis |
| Doxorubicin | JKChemical | 113424 | for nanoparticles synthesis |
| Acetonitrile | Shanghai Lingfeng | 1008621 | for nanoparticles synthesis |
| PLGA | Sigma-Aldrich | 719897 | for nanoparticles synthesis |
| Ultrasonic processor | Sonics | VCX130 | for nanoparticles synthesis |
| Centrifuge filter (MWCO 10 kDa) | Millipore | UFC801024 | for nanoparticles purification |
| centrifuge | Sigma | 3-18KS | for nanoparticles purification |
| 2-[morpholino]ethanesulfonic acid(MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | for peptide conjugation |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | 3450 | for peptide conjugation |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 56480 | for peptide conjugation |
| Dialysis bags | Spectrum | 132592T | for nanoparticles purification |
| PBS | Hyclone | SH30028.01 | for cell culture |
| 10 mL centrifuge tubes, polypropylene | Aladdin | S-025 | for nanoparticles synthesis |
| 15 mL centrifuge tubes, polypropylene | Corning | 430791 | for various applications |
| 0.22 μm sterile syringe filter | Millipore | SLGV033RB | for nanoparticles purification |
| 1 ml syringe, polypropylene | BD | 328421 | for nanoparticles synthesis |
| Malvern Zetasizer | Malvern | Nano ZS | for particle size analyer |
| Phosphotungstic acid | for TEM | ||
| TEM grid | EMCN | BZ10024a | for TEM |
| UV-VIS spectrometer | Leagene | DZ0035 | for TEM |
| Transmission electron microscope |
JEOL | JEM-100CXII | for particle size analyer |
| BCA reagent A | Thermo Fisher Scientific | 23228 | for BCA assay |
| BCA reagent B | Thermo Fisher Scientific | 23224 | for BCA assay |
| 96-Well Plates | Corning | 3599 | for BCA assay |
| Plate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan™ GO | for BCA assay |
| 12-well plates | Corning | 3513 | for cell culture |
| JEG3 cell | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | TCHu195 | Human placenta |
| DMEM/F12 | Hyclone | SH30272.01 | phenol red-free |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10100 | for cell culture |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO | 15070063 | for cell culture |
| Fluorescence microscope | OLYMPUS | CKK53 | for celluar uptake |
| Paraformaldehyde | Shanghai Lingfeng | 1372021 | for celluar uptake |
| DAPI | Sangon Biotech | A606584 | for celluar uptake |
| Mounting medium | Life | P36961 | for celluar uptake |
References
- Davis, M. E., Shin, D. M. Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (9), 771 (2008).
- Nie, S., Xing, Y., Kim, G. J., Simons, J. W. Nanotechnology applications in cancer. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 257-288 (2007).
- Jabir, N. R., et al. An overview on the current status of cancer nanomedicines. Current Medical Research and Opinion. 34 (5), 911-921 (2018).
- Pillai, G. Nanomedicines for Cancer Therapy: An Update of FDA Approved and Those under Various Stages of Development. SOJ Pharmacy & Pharmaceutical Sciences. 1 (2), 1-13 (2014).
- Marta, T., Luca, S., Serena, M., Luisa, F., Fabio, C. What is the role of nanotechnology in diagnosis and treatment of metastatic breast cancer? Promising Scenarios for the Near Future. Journal of Nanomaterials. 2016, e5436458 (2016).
- Dasari, S., Tchounwou, P. B. Cisplatin in cancer therapy: molecular mechanisms of action. European journal of Pharmacology. 740, 364-378 (2014).
- Brigger, I., Dubernet, C., Couvreur, P. Nanoparticles in cancer therapy and diagnosis. Advanced Drug Delivery Reviews. 64, 24-36 (2012).
- Steichen, S. D., Caldorera-Moore, M., Peppas, N. A. A review of current nanoparticle and targeting moieties for the delivery of cancer therapeutics. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 48 (3), 416-427 (2013).
- Salanti, A., et al. Targeting human cancer by a glycosaminoglycan binding malaria protein. Cancer Cell. 28 (4), 500-514 (2015).
- Seiler, R., et al. An Oncofetal Glycosaminoglycan Modification Provides Therapeutic Access to Cisplatin-resistant Bladder Cancer. European Urology. 72 (1), 142-150 (2017).
- Zhang, B., et al. Targeted delivery of doxorubicin by CSA-binding nanoparticles for choriocarcinoma treatment. Drug Delivery. 25 (1), 461-471 (2018).
- Zhang, B., et al. Placenta-specific drug delivery by trophoblast-targeted nanoparticles in mice. Theranostics. 26 (2), 130-137 (2018).
- Zhang, L., et al. Self-assembled lipid--polymer hybrid nanoparticles: a robust drug delivery platform. ACS Nano. 2 (8), 1696-1702 (2008).
- Zheng, M., et al. Single-step assembly of DOX/ICG loaded lipid-polymer nanoparticles for highly effective chemo-photothermal combination therapy. ACS. 7 (3), 2056-2067 (2013).
- Fang, R. H., Aryal, S., Hu, C. -M. J., Zhang, L. Quick synthesis of lipid− polymer hybrid nanoparticles with low polydispersity using a single-step sonication method. Langmuir. 26 (22), 16958-16962 (2010).
- Gu, L., et al. Folate-modified, indocyanine green-loaded lipid-polymer hybrid nanoparticles for targeted delivery of cisplatin. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 28 (7), 690-702 (2017).
- Mandal, B., Mittal, N. K., Balabathula, P., Thoma, L. A., Wood, G. C. Development and in vitro evaluation of core-shell type lipid-polymer hybrid nanoparticles for the delivery of erlotinib in non-small cell lung cancer. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 81, 162-171 (2016).
- Shi, T., et al. Enhanced legumain-recognition and NIR controlled released of cisplatin-indocyanine nanosphere against gastric carcinoma. European Journal of Pharmacology. 794, 184-192 (2017).
- Grabarek, Z., Gergely, J. Zero-length crosslinking procedure with the use of active esters. Analytical Biochemistry. 185 (1), 131-135 (1990).
- Hadjipanayis, C. G., et al. EGFRvIII Antibody-Conjugated Iron Oxide Nanoparticles for Magnetic Resonance Imaging-Guided Convection-Enhanced Delivery and Targeted Therapy of Glioblastoma. Cancer Research. 70 (15), 6303-6312 (2010).
- Sadhukha, T., Wiedmann, T. S., Panyam, J. Inhalable magnetic nanoparticles for targeted hyperthermia in lung cancer therapy. Biomaterials. 34 (21), 5163-5171 (2013).
- Jennings, M., Nicknish, J. Localization of a site of intermolecular cross-linking in human red blood cell band 3 protein. Journal of Biological Chemistry. 260 (9), 5472-5479 (1985).
- Staros, J. V. N-hydroxysulfosuccinimide active esters: bis(N-hydroxysulfosuccinimide) esters of two dicarboxylic acids are hydrophilic, membrane-impermeant, protein cross-linkers. Biochemistry. 21 (17), 3950-3955 (1982).
- Valencia, P. M., et al. Single-step assembly of homogenous lipid− polymeric and lipid− quantum dot nanoparticles enabled by microfluidic rapid mixing. ACS. 4 (3), 1671-1679 (2010).
- Altintas, I., et al. Nanobody-albumin nanoparticles (NANAPs) for the delivery of a multikinase inhibitor 17864 to EGFR overexpressing tumor cells. Journal of Controlled Release. 165 (2), 110-118 (2013).
- Maya, S., et al. Cetuximab conjugated O-carboxymethyl chitosan nanoparticles for targeting EGFR overexpressing cancer cells. Carbohydrate Polymers. 93 (2), 661-669 (2013).
- Deepagan, V. G., et al. In vitro targeted imaging and delivery of camptothecin using cetuximab-conjugated multifunctional PLGA-ZnS nanoparticles. Nanomedicine. 7 (4), 507-519 (2012).
- Totaro, K. A., et al. Systematic investigation of EDC/sNHS-mediated bioconjugation reactions for carboxylated peptide substrates. Bioconjugate Chemistry. 27 (4), 994-1004 (2016).
- Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions. Mass Spectrometry Reviews. 25 (4), 663-682 (2006).
- Zhang, B., et al. LDLR-mediated peptide-22-conjugated nanoparticles for dual-targeting therapy of brain glioma. Biomaterials. 34 (36), 9171-9182 (2013).
- Koren, E., Apte, A., Sawant, R. R., Grunwald, J., Torchilin, V. P. Cell-penetrating TAT peptide in drug delivery systems: proteolytic stability requirements. Drug Delivery. 18 (5), 377-384 (2011).
- Chu, Y., et al. Topical ocular delivery to laser-induced choroidal neovascularization by dual internalizing RGD and TAT peptide-modified nanoparticles. International Journal of Nanomedicine. 12, 1353-1368 (2017).
