Summary
ここでは、胎盤のコンドロイチン硫酸 A 結合ペプチド (plCSA BP) の合成のためのプロトコルを提案する-共役脂質高分子ナノ粒子を介してシングル ステップ超音波処理とナノ診断技術。これらの粒子は、最もひと腫瘍と癌、胎盤疾患を治療するために胎盤トロホブに治療のターゲットを絞った配信するための新しいツールを構成します。
Abstract
効果的ながん治療法は減り、最小限の全身毒性を有する腫瘍をなくします。積極的にターゲットのナノ粒子は、ガン治療の有望なアプローチを提供しています。グリコサミノグリカン胎盤コンドロイチン硫酸 (plCSA) は、がん細胞と胎盤トロホブと VAR2CSA が plCSA にバインドできます特にマラリアの蛋白質の広い範囲で表されます。マラリア蛋白質 VAR2CSA から派生した報告された胎盤コンドロイチン硫酸 A 結合ペプチド (plCSA BP)、具体的にも、がん細胞と胎盤トロホブ plCSA にバインドできます。したがって、ひと腫瘍および胎盤トロホブへの標的化薬物送達のツールとして plCSA BP 共役系ナノ粒子を使用可能性があります。このプロトコルを装荷したドキソルビシン (plCSA DNPs); plCSA BP 共役脂質高分子ナノ粒子を合成する手法について述べるメソッドは、単一の超音波処理ステップやナノ診断技術で構成されます。さらに、plCSA-DNPs 胎盤絨毛癌 (JEG3) 細胞による細胞内取り込み、物理化学的性質などの特性評価法のいくつかを説明します。
Introduction
効果的ながん治療法は減り、最小限の全身毒性を有する腫瘍をなくします。したがって、ターゲットに選択的な腫瘍は、成功した治療法を探索するための鍵です。ナノ粒子がん治療の有望な機会を提供する、異なる官能基を持つ分子薬の有効性を強化し、関連する副作用1,2削減します。さらに、ナノ粒子系は主にパッシブとアクティブの目標ターゲット腫瘍3を利用します。
受動的ターゲティング ナノ粒子と高められた透磁率および腫瘍細胞に到達する保持 (EPR) 効果の生得的な性質を悪用します。カチオン性リポソームは、臨床応用4,5,6腫瘍に様々 な抗がん剤を提供する正常に使用されています。潜在的な効果的な癌治療効果にもかかわらず腫瘍領域と正常組織と腫瘍細胞を区別することができない低薬物濃度でナノ粒子の受動ターゲット7の 2 つの主要な制限は。
アクティブなターゲット戦略から抗原抗体、リガンド受容体、特に腫瘍8に薬を提供する他の分子認識の相互作用を活用します。グリコサミノグリカン胎盤コンドロイチン硫酸 (plCSA) は広く、ほとんどのがん細胞や胎盤トロホブ表されます。また、マラリアの蛋白質 VAR2CSA はすることができます具体的に plCSA9,10にバインドします。したがって、VAR2CSA は、ひと癌細胞をターゲットとするためのツールをすることができます。しかしときに、VAR2CSA のナノ粒子に共役は、実物大の蛋白質は腫瘍細胞へのナノ粒子の浸透を制限があります。最近、我々 はマラリア タンパク質 VAR2CSA 由来 plCSA 結合ペプチド (plCSA-BP) を発見しました。plCSA 共役 BP 脂質高分子ナノ粒子は急速に絨毛癌細胞と大幅に増加したドキソルビシン (DOX) 抗癌活性生体内で11に結合これらの粒子は具体的にも胎盤トロホブに接着し、胎盤12への薬物の対象となる配信のためのツールとして役立つことができます。
脂質高分子ナノ粒子はから成っている脂質単分子膜シェルと疎水性高分子コア、ドラッグデリバリーのための新しいキャリアを表します。これらのナノ粒子は、リポソームと制御可能なナノ粒子のサイズ、高い生体適合性、持続的な薬物放出、高い薬剤積載効率 (ル)、安定性に優れる13などの高分子ナノキャリアの利点を結合します。この作品は、脂質高分子ナノ粒子を合成するのにシングル ステップ超音波処理法を使用しました。このメソッドは、高速、便利でスケール アップに適した、脂質高分子ナノ粒子を準備する私たちグループ11,14等で広く使用されています15,16,17,18.
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) カルボジイミド塩酸塩 (EDC) はアミンとカルボン酸の19を含む生体分子の活用の架橋剤として使用される人気のあるカルボジイミド。EDC は、に加えて N hydroxysulfosuccinimide (NHS) は表面およびナノ粒子抱合反応20,21の最も一般的な活用試薬です。NHS は副反応の数を削減でき、安定性を高めるし、収量エステル中間体22,23。
ここでは、plCSA をターゲットとした脂質高分子ナノ粒子を合成するためのプロトコルについて述べる。まず、DOX ロード脂質高分子ナノ粒子 (DNPs) のシングル ステップ超音波合成を説明します。さらに、plCSA BP 共役脂質高分子ナノ粒子を生成するための EDC/NHS ナノ診断技術を導入します。このナノ診断手法は、他の抗体とナノ粒子にペプチド共役に使用もできます。最後に、我々 は plCSA をターゲットとした脂質高分子ナノ粒子を特徴付けるために使用プロパティと体外の物理化学的アッセイをについて説明します。我々 は、これらの plCSA をターゲットとした脂質高分子ナノ粒子がほとんどの人間のがん、胎盤疾患を治療するために胎盤にペイロードのターゲットを絞った配信に薬のターゲットを絞った配信のための効果的なシステムを構成する可能性が信じています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ストック溶液の調製
- 100 ml の超純水水エタノール 4 mL を希釈して 4% エタノール水溶液を準備します。4 ° C でソリューションを格納します。
注: 超純水は細菌、微粒子、イオン、核酸などの汚染物質がなく水として定義されます。純水は、ターゲット抵抗低い陰イオン性汚染を意味するまで 18.2 mΩ·cm の水の浄化システムから得られました。 - 4% のエタノール水溶液 20 mL に大豆レシチン 20 mg を溶解することにより大豆レシチン原液を 1 mg/mL を準備します。大豆レシチン原液 4 ° C で保存します。
- 4% のエタノール水溶液 4 mL DSPE-ペグ-COOH の 100 mg を溶解することにより DSPE ペグ (2000)-COOH 原液を 25 mg/mL を準備します。-20 ° C で原液を保存します。
- 5 mL の純水に DOX の 50 mg を溶解して DOX 原液 10 mg/mL を準備します。暗闇に 4 ° C で DOX 原液を格納します。
- 10 mL のアセトニ トリルに PLGA の 20 mg を溶解して PLGA 原液 2 mg/mL を準備します。4 ° C で PLGA 原液を保存します。
注意: アセトニ トリルは可燃性、有毒です。発煙のフード、ケアで動作し、適切なパーソナル機器、白衣、安全メガネ、ゴム手袋などを着用します。 - 0.1 M 2-(morpholino) ethanesulfonic 酸 (MES、pH 6.0) のストック溶液を準備するには、100 mL の純水に MES の 2.17 g 溶解します。4 ° C で原液を保存します。
2. DNPs の合成
注: DOX 光化学分解を避けるためには、すべての操作は暗闇の中で実行されました。
以前に報告されたシングル ステップ超音波法11,13,14によりナノ粒子を合成しました。
- 4% のエタノール水溶液の 3 mL を滅菌 10 mL の遠心管に追加します。4% のエタノール水溶液の 3 mL に大豆レシチン原液の 90 μ g、DSPE-ペグ-COOH 原液の 210 μ g、DOX 原液の 750 μ g を追加します。
- 氷浴に遠心管を置き、超音波プロセッサ上の氷浴を配置します。
- 1 mL 注射器ピペット滴 PLGA 原液 2 mg (1 ドロップ/4-6 秒) の遠心管に。一方、超音波照射、DNPs を合成する周波数が 20 kHz と 5 分の 30% の出力振幅超音波プロセッサを使用して管
注: 小さいサイズの均一な微粒子を合成する、PLGA ソリューションはチューブに滴下速度が遅く、する必要があります、バブル世代は避けるべきであります。 - 上記の解決策を 0.1 M MES バッファー (pH 6.0) で洗浄することにより、DNPs を浄化 3 回遠心フィルター (MWCO、10 kDa) を使用します。4 ° C で遠心して 3 分たびに 1000 × g。最後に、約 1 mL ナノ粒子の MES 解決のままです。
注: これはの手順で許容可能な停止ポイントです。ない場合、共役ペプチドを使用すると、ナノ粒子は PBS バッファー (pH 7.4) によって浄化することが、精製の DNPs は暗闇の中で 4 ° C で保存できます。
3. DNPs にペプチドの活用
-
エステルの活性化
- EDC の 0.4 mg を追加 (最終濃度 2 mM) DNPs 1 mL に。
- 反応する NHS の 0.24 mg を追加 (最終濃度 2 mM)。
注: EDC および NHS の正しい量を簡単に追加、試薬を溶解し、すぐに使用場合にストック溶液を調製可能性があります。 - 反応成分を混ぜる、シェーカー; に反応暗闇の中で室温で反応の 30 分、1 時間を許可します。
-
アミンの反応
- 7.2 7.5 を使用するバッファーの pH を高める PBS (20 ×、pH 7.4)。
- 反応液に 0.5 mg plCSA を対象としたペプチド (EDVKDINFDTKEKFLAGCLIVSFHEGKC plCSA BP) を追加します。
注: また、前に 20% アセトニ トリル中のペプチドを溶解します。ペプチド溶ける場合は、風呂超音波発生装置で超音波処理に役立つ可能性があります。 - まあ、ソリューションをミックスし、シェーカー。暗闇の中で一晩 4 ° C で進行する反応を許可します。
- 透析バッグ (MWCO、3,500 Da) dialyze plCSA DNPs を浄化しに共役ソリューションを配置暗闇の中 24 時間室温で PBS (pH 7.4) バッファーを使用します。
注: また、浄化をステップ 2.4 plCSA DNPs を取得するように実行でした。 - 細胞培養の応用潜在的な沈殿物を削除する 0.22 μ m の滅菌注射器フィルターを溶解した溶液をフィルタ リングします。
4 plCSA をターゲットとした脂質の特性-高分子ナノ粒子
-
動的光散乱 (DLS) を使用して流体力学的ナノ粒子サイズの測定
- 純水 (~ 50 倍希釈) を持つナノ粒子を希釈します。DLS またはゼータ電位器の指示に従ってキュベットに 500 μ L のサンプルをロードします。
メモ: ゼータ電位と DLS キュヴェットは計測器の仕様に基づいてすることができます異なります。 - 測定が完了した後に、粒子径、分散インデックス (PDI) ゼータ電位を記録します。平均 4 から得られた結果は、測定値を繰り返し、標準偏差を計算します。
- 純水 (~ 50 倍希釈) を持つナノ粒子を希釈します。DLS またはゼータ電位器の指示に従ってキュベットに 500 μ L のサンプルをロードします。
-
透過型電子顕微鏡 (TEM)
注: ナノ粒子の形態は、ネガティブ染色法による TEM で観察されました。24- 超純水 (400-fold 希釈) ナノ粒子を希釈します。TEM グリッド上にサンプルの 20 μ L を追加し、5 分間座ってできるようにします。
- 2% (w/v) リンタングステン酸の 100 μ L を追加し、液滴 2 分芯まで座ることができます。
- 室温で TEM グリッドを乾燥させます。
- 80 で電子顕微鏡の加速電圧を設定 kV、100,000 × ナノ粒子を可視化する画像の拡大と。
-
カプセル化効率 (EE) の定量とル
- 標準的な曲線の生成。5 つの異なる濃度の DOX ソリューションを準備する純水 DOX の溶解: 1 μ G/ml、5 μ g/mL、10 μ g/mL、50 μ g/mL、100 μ g/mL。480 で DOX ソリューションの吸光度 nm 紫外可視分光計。DOX 濃度に基づく標準的な曲線を生成します。
- 500 μ L の純水でナノ粒子の 25 μ L を希釈します。480 吸収を測定 nm 紫外可視分光計。標準曲線を用いた薬物濃度を計算します。
- ルの次の式を使用して計算します。
ル = ((ナノ粒子における薬の量)/(材料の重量を合計)) × 100%。 - 次の方程式を使用して EE を計算します。
EE = ((ナノ粒子における薬の量)/(量追加薬)) × 100%。
-
ビシンコニン酸 (BCA) アッセイを用いた活用効率の測定25,26,27
- 重複でマイクロ プレートのウェルに標準的なペプチッド解決 (表 1) または plCSA DNPs の 25 μ L をピペットします。各ウェルに作業試薬 200 μ L を追加し、ミックス 30 プレート シェーカーでよくプレート s。
- カバー プレート、および 30 分の 37 ° C で孵化させなさい。
- 562 で吸光度を測定プレート リーダーの nm。生成された標準的なカーブを使用して、plCSA DNPs の plCSA 濃度を計算します。
- 次の方程式を使って活用効率を計算します。
活用効率 = ((ナノ粒子におけるペプチドの量)/(量追加ペプチド)) × 100%。
| バイアル | 希釈剤 (μ L) のボリューム | ボリュームとペプチド (μ L) のソース | 最終的なペプチド濃度 (μ g/mL) |
| A | 0 | 株式の 300 | 1000 |
| B | 250 | バイアル希釈の 250 | 500 |
| C | 250 | バイアル B 希釈の 250 | 250 |
| D | 250 | C のバイアル希釈の 250 | 125 |
| E | 300 | D のバイアル希釈 200 | 50 |
| F | 250 | E のバイアル希釈の 250 | 25 |
| G | 400 | F のバイアル希釈 100 | 5 |
| H | 500 | 0 | 0 |
表 1。標準的なペプチドの作製
5 絨毛癌 (JEG3) 細胞のナノ粒子の取り込みを plCSA ターゲットの蛍光顕微鏡による評価
- 1.0 × 10 で滅菌 12 ウェル プレートの上に細胞を播く4細胞/ウェルと完全な DMEM/F12 (cDMEM/F12、1% ペニシリン/ストレプトマイシンと 10% 牛胎児血清 (FBS) を含む)。高温多湿条件下で CO2を 37 ° C、5% で 60% の合流点に成長する細胞を許可します。
- メディアを取り出して、低血清量と冷たい新鮮なメディアの 1 つの mL を追加 (5 %fbs) DNPs や plCSA DNPs (DOX と同等の 5 μ g)。
- セルと 1 h の 4 ° C でのナノ粒子の混合物を孵化させなさい。
- インキュベーション後、メディアを取り出して、洗浄 3 回 PBS のセル。新鮮な cDMEM/f12 キーの 1 つの mL を追加し、37 ° C、30 分で細胞をインキュベートします。
- CDMEM/f12 キーを取り外して洗浄 3 回 PBS のセル。
- 冷たい 4% パラホルムアルデヒド (PFA) 2 mL を追加し、セルを修復するのに 15 分間、室温でインキュベートします。
- PFA を削除します。2 ml の PBS のセルを一度洗ってください。DAPI を含む PBS の 1 mL を追加 (1 μ g/mL) 核染色、10 分間室温でインキュベートし、。
- PBS、吸引し、洗浄 3 回 PBS のセル。
- メディアをマウントを追加し、それぞれ DOX と核を視覚化する緑と青のチャンネルを使用して蛍光顕微鏡を用いた蛍光を画像します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
このプロトコルでは、PLGA、DSPE-ペグ-COOH、大豆レシチン、代表的なポリマー、脂質-ペグ-COOH 共役と脂質がそれぞれ。PlCSA をターゲットとした脂質高分子ナノ粒子を介してシングル ステップ超音波処理法の EDC/NHS 法合成は図 1に示します。まず、超音波照射条件下で大豆レシチン、PLGA と DSPE-ペグ-COOH フォーム コア-シェルに自己組み立てる構造 DNPs。中核は PLGA のカプセル化された DOX から成り、シェルから成っている DSPE-ペグ-COOH と大豆レシチン単分子膜は、シェルとコアのインターフェイスに位置しています。- COOH グループ大日本印刷表面に露出したは、ペプチドのを介してplCSA DNPs を合成する EDC/NHS 法 -NH2グループと共役しました。
このプロトコルの準備 DNPs 径 82.3 ± 4.7 nm、plCSA BP に後、プライマリ DNPs の直径は増資 109.3 ± 5.9 nm (図 2)。PlCSA DNPs DNPs の PDI は 0.127±0.005 と 0.134 ± 0.065 であった。DNPs plCSA DNPs の TEM 像がみられた粒子が分散したし、一般的に球状形態 (図 3) があった。Ζ 電位 DNPs と plCSA DNPs は-20.1 ± 1.32 mV と-29.9 3.56 ± mV、それぞれ (表 2)。したがって、これらのナノ粒子は、安定性の高いと予測されています。
| ナノ粒子 | Diameter(nm) | PDI | ゼータ電位 (mV) |
| DNPs | 82.3±4.7 | 0.127±0.005 | -20.1±1.32 |
| plCSA DNPs | 109.3±5.9 | 0.134±0.065 | -29.9±3.56 |
| PDI:polydispersity インデックス。 データを提示する平均 ± SD (n = 3)。 | |||
表 2。ナノ粒子のキャラクタリゼーション
EE およびナノ粒子のル臨床アプリケーションにとって重要です。DOX EE DNPs と plCSA DNPs は 40.3 ± 1.67%、39.5 ± 1.94% であった。DNPs と plCSA DNPs DOX のルは 6.2 ± 0.74%, 5.1 ± 0.42% であった.これらのデータは、plCSA BP 装飾後薬物読み込みおよび薬剤のカプセル化の範囲が維持されたことを示した。DNPs の表面に plCSA BP の装飾の効率は、BCA アッセイ (図 4) によって決定されました。PlCSA BP 活用効率が 45.5 ± 3.7% に認められました。
JEG3 細胞内取り込みアッセイは、plCSA DNPs 急速にセル 30 分 (図 5) 内の JEG3 にバインドされていることを示されました。したがって、plCSA BP はこのプロトコルで大日本印刷表面に共役効率的に。また、plCSA BP が急速に JEG3 のセルにバインド、ナノ粒子の細胞内取り込みを増加します。
図 1。PlCSA をターゲットとした脂質高分子ナノ粒子を合成するために使用法の模式図です。まず、シングル ステップ超音波法脂質高分子ナノ粒子 (DNPs) を合成するし、EDC/NHS 技術は、ナノ粒子表面 (plCSA DNPs) にペプチドを共役に使用されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。サイズの異なるナノ粒子分布。DNPs (A) および (B) DLS により測定した plCSA DNPs の流体サイズ。粒子サイズとサイズ分布を示す代表的な数字が掲載されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。TEM によって特徴付けられるナノ粒子形態。DNPs (A) および (B) 2% リンタングステン酸染色で観察 plCSA DNPs の典型的な TEM のイメージ。スケールバー = 100 nm。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4。BCA アッセイを用いた活用効率の測定。562 でペプチドの標準曲線 nm。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5。JEG3 細胞によるナノ粒子の取り込みします。JEG3 細胞は、5 μ g/mL の異なるナノ粒子と孵化の 30 分後に蛍光顕微鏡によって分析されました。赤: DOX、青: 核を DAPI ラベルします。スケールバー = 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
このプロトコルは、plCSA BP 共役脂質高分子ナノ粒子を合成するため効率的かつ再現性のある方法を提供します。脂質高分子ナノ粒子を準備するシングル ステップ超音波法は高速、再現性と暖房、ボルテックス、または蒸発を伴う典型的な nanoprecipitation メソッドとは異なる。したがって、開発した方法は、合成時間を著しく短縮します。さらに、このプロトコルで使われる EDC/NHS ナノ診断は共役ペプチド ・ ナノ粒子に対する抗体によく使用され、便利な手法です。したがって、組み合わせ plCSA ターゲット脂質高分子を合成する EDC/NHS ナノ診断手法でシングル ステップ超音波処理法のナノ粒子が臨床応用スケールできます。
特定の手順は、正常に合成と plCSA DNPs を特徴付けるのために重要です。まず、レシチン、PLGA と DSPE-ペグ-COOH の相対濃度は、脂質高分子ナノ粒子のサイズと多分散性を決定します。レシチン濃度が固定 DSPE-ペグ-COOH 結果低い多分散性の高い濃度およびより小さいナノ粒子のサイズ、13,15ル薬物を急低下させる。PLGA の濃度を固定するより多くの DSPE-ペグ-COOH が、高いナノ粒子の分散と大きなナノ粒子サイズ15につながるレシチンに置き換えられます。このような状況でナノ粒子はより不安定になり集計簡単に。このプロトコルでは DSPE-ペグ-COOH/PLGA 重量比は 0.11 とレシチン/DSPE-ペグ-COOH の質量比は 0.43。脂質高分子ナノ粒子のサイズは約 82 約 0.127 の PDI の nm。
第二に、ナノ粒子にペプチドの活用の中に溶液の pH は非常に重要です。エステルの活性化の最適 pH は 5.0 から 6.0 とアミンの反応は pH 7.2 7.519,28,29で最も効率的。最もよい結果の反応は 2 つの手順で実行してください。まず、MES (または別の noncarboxylate、nonamine バッファー) では、pH 5.0-6.0 でエステルの活性化が発生します。その後、pH が 7.2 7.519アミンを含む分子との反応の直前に PBS (または別の nonamine バッファー) を使用して調整されます。NHS エステルの半減期は pH 7.019で 4-5 時間であることを考えると、アミンの反応の期間は、4 ° C で 10 h を超えています
最終的な重要な要因は、ナノ粒子の取り込みです。JGE3 細胞によって DNPs の標的の取り込みは、培養時間と温度と培地で FBS の濃度を制御することによりターゲットの取り込みの機能解析で敗退しました。このプロトコルでは 5% を添加して JEG3 セル DNP の細胞内取り込みを最小限に抑えるための 1 h および 30 分の 37 ° C で培養し、4 ° C で FBS。
処理中に問題が発生した場合、合成と plCSA DNPs の特性に関連する 3 つの主要なトラブルシューティングの手順があります。まず、脂質高分子ナノ粒子が作製、PLGA と超音波照射条件下でレシチンの自己集合。PLGA は有機溶剤にのみ溶解します。したがって、親水性溶媒に加え、時に PLGA を沈殿させる迅速に小さなナノ粒子に。滴下速度の影響を最小化しより大きな粒子の生成を避ける、PLGA を追加する前に 1 〜 2 分のための混合物の超音波処理は必要です。第二に、BCA 法を用いた plCSA BP 活用効率の定量的解析が迅速かつ便利な高速液体クロマトグラフィー (HPLC) 法がより正確です。高速液体クロマトグラフィーの実験の詳細がされている30,31,32当社グループ11と他の人によって記述されています。最後に、他の癌細胞の plCSA DNP 細胞取り込みの最適条件が異なる場合があります。徐々 に FBS の濃度を減少し、37 ° C で培養時間の増加は、最適条件を決定するを助けるかもしれない。
プロトコルの制限の 1 つは、薬物の疎水性薬物の EE を決定することです。疎水性薬水溶性薬物と比較して、増加薬物 EE に PLGA の強い親和性があります。これらのインスタンスで plCSA をターゲットとした脂質高分子ナノ粒子の合成手順は、ルと EE に理想的な薬で得られる最も効率的な合成方法を決定するのに実験的に検討する必要があります。
前述のように、グリコサミノグリカン plCSA は具体的には、ほとんどの癌細胞や胎盤トロホブ表されます。したがって、のみ妊娠動物と人間、腫瘍細胞への治療のターゲットを絞った配信の plCSA NPs を使用することやこれらの薬ロード粒子が妊娠動物の胎盤の副作用につながることに注意することが重要だと人間。
要約すると、plCSA をターゲットとした脂質高分子ナノ粒子を合成する簡単で便利な方法を説明しました。このプロトコルの意義は、併用の毒性を最小限に抑えながら腫瘍と胎盤の薬物空室が増えることです。このアプローチは、腫瘍と胎盤を薬のターゲットを絞った配信に便利にする必要があります、将来的に臨床応用の plCSA をターゲットとした脂質高分子ナノ粒子を準備するスケール アップすることがあります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
X. f. B.Z. は、特許 PCT/CN2017/108646 と plCSA をターゲットとしたナノ粒子合成法と応用をカバーする SIAT 投稿 201710906587.6 の発明者。いいえ利害対立の可能性、他の著者によって明らかにされました。
Acknowledgments
広東省 (2016A030313178) の自然科学基礎国立自然科学財団 (81571445 と 81771617) と中国 (2016YFC1000402) の開発プログラム キー研究からへの補助金によってこの作品のサポートだったX. f. と、深セン基本研究基金 (JCYJ20170413165233512) x. f.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plCSA peptide | Shanghai GL Biochem | 573518 | for peptide synthesis |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical | 10009218 | for nanoparticles synthesis |
| Soybean lecithin | Avanti Polar Lipids | 441601 | for nanoparticles synthesis |
| DSPE-PEG-COOH | Avanti Polar Lipids | 880125 | for nanoparticles synthesis |
| Doxorubicin | JKChemical | 113424 | for nanoparticles synthesis |
| Acetonitrile | Shanghai Lingfeng | 1008621 | for nanoparticles synthesis |
| PLGA | Sigma-Aldrich | 719897 | for nanoparticles synthesis |
| Ultrasonic processor | Sonics | VCX130 | for nanoparticles synthesis |
| Centrifuge filter (MWCO 10 kDa) | Millipore | UFC801024 | for nanoparticles purification |
| centrifuge | Sigma | 3-18KS | for nanoparticles purification |
| 2-[morpholino]ethanesulfonic acid(MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | for peptide conjugation |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | 3450 | for peptide conjugation |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 56480 | for peptide conjugation |
| Dialysis bags | Spectrum | 132592T | for nanoparticles purification |
| PBS | Hyclone | SH30028.01 | for cell culture |
| 10 mL centrifuge tubes, polypropylene | Aladdin | S-025 | for nanoparticles synthesis |
| 15 mL centrifuge tubes, polypropylene | Corning | 430791 | for various applications |
| 0.22 μm sterile syringe filter | Millipore | SLGV033RB | for nanoparticles purification |
| 1 ml syringe, polypropylene | BD | 328421 | for nanoparticles synthesis |
| Malvern Zetasizer | Malvern | Nano ZS | for particle size analyer |
| Phosphotungstic acid | for TEM | ||
| TEM grid | EMCN | BZ10024a | for TEM |
| UV-VIS spectrometer | Leagene | DZ0035 | for TEM |
| Transmission electron microscope |
JEOL | JEM-100CXII | for particle size analyer |
| BCA reagent A | Thermo Fisher Scientific | 23228 | for BCA assay |
| BCA reagent B | Thermo Fisher Scientific | 23224 | for BCA assay |
| 96-Well Plates | Corning | 3599 | for BCA assay |
| Plate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan™ GO | for BCA assay |
| 12-well plates | Corning | 3513 | for cell culture |
| JEG3 cell | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | TCHu195 | Human placenta |
| DMEM/F12 | Hyclone | SH30272.01 | phenol red-free |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10100 | for cell culture |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO | 15070063 | for cell culture |
| Fluorescence microscope | OLYMPUS | CKK53 | for celluar uptake |
| Paraformaldehyde | Shanghai Lingfeng | 1372021 | for celluar uptake |
| DAPI | Sangon Biotech | A606584 | for celluar uptake |
| Mounting medium | Life | P36961 | for celluar uptake |
References
- Davis, M. E., Shin, D. M. Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (9), 771 (2008).
- Nie, S., Xing, Y., Kim, G. J., Simons, J. W. Nanotechnology applications in cancer. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 257-288 (2007).
- Jabir, N. R., et al. An overview on the current status of cancer nanomedicines. Current Medical Research and Opinion. 34 (5), 911-921 (2018).
- Pillai, G. Nanomedicines for Cancer Therapy: An Update of FDA Approved and Those under Various Stages of Development. SOJ Pharmacy & Pharmaceutical Sciences. 1 (2), 1-13 (2014).
- Marta, T., Luca, S., Serena, M., Luisa, F., Fabio, C. What is the role of nanotechnology in diagnosis and treatment of metastatic breast cancer? Promising Scenarios for the Near Future. Journal of Nanomaterials. 2016, e5436458 (2016).
- Dasari, S., Tchounwou, P. B. Cisplatin in cancer therapy: molecular mechanisms of action. European journal of Pharmacology. 740, 364-378 (2014).
- Brigger, I., Dubernet, C., Couvreur, P. Nanoparticles in cancer therapy and diagnosis. Advanced Drug Delivery Reviews. 64, 24-36 (2012).
- Steichen, S. D., Caldorera-Moore, M., Peppas, N. A. A review of current nanoparticle and targeting moieties for the delivery of cancer therapeutics. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 48 (3), 416-427 (2013).
- Salanti, A., et al. Targeting human cancer by a glycosaminoglycan binding malaria protein. Cancer Cell. 28 (4), 500-514 (2015).
- Seiler, R., et al. An Oncofetal Glycosaminoglycan Modification Provides Therapeutic Access to Cisplatin-resistant Bladder Cancer. European Urology. 72 (1), 142-150 (2017).
- Zhang, B., et al. Targeted delivery of doxorubicin by CSA-binding nanoparticles for choriocarcinoma treatment. Drug Delivery. 25 (1), 461-471 (2018).
- Zhang, B., et al. Placenta-specific drug delivery by trophoblast-targeted nanoparticles in mice. Theranostics. 26 (2), 130-137 (2018).
- Zhang, L., et al. Self-assembled lipid--polymer hybrid nanoparticles: a robust drug delivery platform. ACS Nano. 2 (8), 1696-1702 (2008).
- Zheng, M., et al. Single-step assembly of DOX/ICG loaded lipid-polymer nanoparticles for highly effective chemo-photothermal combination therapy. ACS. 7 (3), 2056-2067 (2013).
- Fang, R. H., Aryal, S., Hu, C. -M. J., Zhang, L. Quick synthesis of lipid− polymer hybrid nanoparticles with low polydispersity using a single-step sonication method. Langmuir. 26 (22), 16958-16962 (2010).
- Gu, L., et al. Folate-modified, indocyanine green-loaded lipid-polymer hybrid nanoparticles for targeted delivery of cisplatin. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 28 (7), 690-702 (2017).
- Mandal, B., Mittal, N. K., Balabathula, P., Thoma, L. A., Wood, G. C. Development and in vitro evaluation of core-shell type lipid-polymer hybrid nanoparticles for the delivery of erlotinib in non-small cell lung cancer. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 81, 162-171 (2016).
- Shi, T., et al. Enhanced legumain-recognition and NIR controlled released of cisplatin-indocyanine nanosphere against gastric carcinoma. European Journal of Pharmacology. 794, 184-192 (2017).
- Grabarek, Z., Gergely, J. Zero-length crosslinking procedure with the use of active esters. Analytical Biochemistry. 185 (1), 131-135 (1990).
- Hadjipanayis, C. G., et al. EGFRvIII Antibody-Conjugated Iron Oxide Nanoparticles for Magnetic Resonance Imaging-Guided Convection-Enhanced Delivery and Targeted Therapy of Glioblastoma. Cancer Research. 70 (15), 6303-6312 (2010).
- Sadhukha, T., Wiedmann, T. S., Panyam, J. Inhalable magnetic nanoparticles for targeted hyperthermia in lung cancer therapy. Biomaterials. 34 (21), 5163-5171 (2013).
- Jennings, M., Nicknish, J. Localization of a site of intermolecular cross-linking in human red blood cell band 3 protein. Journal of Biological Chemistry. 260 (9), 5472-5479 (1985).
- Staros, J. V. N-hydroxysulfosuccinimide active esters: bis(N-hydroxysulfosuccinimide) esters of two dicarboxylic acids are hydrophilic, membrane-impermeant, protein cross-linkers. Biochemistry. 21 (17), 3950-3955 (1982).
- Valencia, P. M., et al. Single-step assembly of homogenous lipid− polymeric and lipid− quantum dot nanoparticles enabled by microfluidic rapid mixing. ACS. 4 (3), 1671-1679 (2010).
- Altintas, I., et al. Nanobody-albumin nanoparticles (NANAPs) for the delivery of a multikinase inhibitor 17864 to EGFR overexpressing tumor cells. Journal of Controlled Release. 165 (2), 110-118 (2013).
- Maya, S., et al. Cetuximab conjugated O-carboxymethyl chitosan nanoparticles for targeting EGFR overexpressing cancer cells. Carbohydrate Polymers. 93 (2), 661-669 (2013).
- Deepagan, V. G., et al. In vitro targeted imaging and delivery of camptothecin using cetuximab-conjugated multifunctional PLGA-ZnS nanoparticles. Nanomedicine. 7 (4), 507-519 (2012).
- Totaro, K. A., et al. Systematic investigation of EDC/sNHS-mediated bioconjugation reactions for carboxylated peptide substrates. Bioconjugate Chemistry. 27 (4), 994-1004 (2016).
- Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions. Mass Spectrometry Reviews. 25 (4), 663-682 (2006).
- Zhang, B., et al. LDLR-mediated peptide-22-conjugated nanoparticles for dual-targeting therapy of brain glioma. Biomaterials. 34 (36), 9171-9182 (2013).
- Koren, E., Apte, A., Sawant, R. R., Grunwald, J., Torchilin, V. P. Cell-penetrating TAT peptide in drug delivery systems: proteolytic stability requirements. Drug Delivery. 18 (5), 377-384 (2011).
- Chu, Y., et al. Topical ocular delivery to laser-induced choroidal neovascularization by dual internalizing RGD and TAT peptide-modified nanoparticles. International Journal of Nanomedicine. 12, 1353-1368 (2017).
