Summary
Här presenterar vi ett protokoll för syntesen av placenta chondroitin sulfat A bindande peptid (plCSA-BP)-konjugerad lipid-polymera nanopartiklar via steg ultraljudsbehandling och konjugationens tekniker. Dessa partiklar utgör ett nytt verktyg för riktade leverans av therapeutics att de flesta mänskliga tumörer och moderkakan trofoblaster att behandla cancer och placenta störningar.
Abstract
En effektiv cancer terapeutisk metod minskar och eliminerar tumörer med minimal systemisk toxicitet. Aktivt inriktning nanopartiklar erbjuder en lovande strategi för cancerbehandling. Den glykosaminoglykan placenta chondroitin sulfaten en (plCSA) uttrycks på ett brett utbud av cancerceller och moderkakan trofoblaster, och malaria protein VAR2CSA kan specifikt binder till plCSA. En rapporterad placenta chondroitin sulfat A bindande peptid (plCSA-BP), härrör från malaria protein VAR2CSA, kan också specifikt binder till plCSA på cancerceller och moderkakan trofoblaster. PlCSA-BP-konjugerad nanopartiklar kunde därför användas som ett verktyg för riktade drogen leverans till mänskliga cancerformer och moderkakan trofoblaster. I detta protokoll beskriver vi en metod att syntetisera plCSA-BP-konjugerad lipid-polymera nanopartiklar laddad med doxorubicin (plCSA-DNPs); metoden består av en enda ultraljudsbehandling steg och konjugationens tekniker. Dessutom beskrivs flera metoder för att karakterisera plCSA-DNPs, inklusive fastställande av sina fysikalisk-kemiska egenskaper och cellernas upptag av placenta choriocarcinoma (JEG3) celler.
Introduction
En effektiv cancer terapeutisk metod minskar och eliminerar tumörer med minimal systemisk toxicitet. Selektiv tumör inriktning är därför nyckeln till att utforska framgångsrika behandlingsmetoder. Nanopartiklar har en lovande möjlighet för cancerbehandling, och molekylär sammansättningar med olika funktionella grupper kommer att öka drogen effekt och minska associerade biverkningar1,2. Dessutom använder nanopartiklar system främst passiva och aktiva inriktning för att nå målet tumörer3.
Passiva inriktning utnyttjar medfödda egenskaper nanopartiklar och ökad permeabilitet och retention (EPR) effekter att nå tumörceller. Katjoniska liposomer har framgångsrikt använts för att leverera olika cytostatika till tumörer i kliniska tillämpningar4,5,6. Trots den potentiella effektiva terapeutiska effekten, en låg drog koncentration i regionen tumör och en oförmåga att skilja tumörceller från normala vävnader är två stora begränsningar av passiv-targeting nanopartiklar7.
Aktiv inriktning strategier utnyttja antigen-antikropp, ligand-receptorn och andra molekylär igenkänning interaktioner specifikt leverera läkemedel till tumörer8. Den glykosaminoglykan placenta chondroitin sulfaten en (plCSA) uttrycks i stort sett på de flesta cancerceller och moderkakan trofoblaster. Dessutom proteinet malaria VAR2CSA kan specifikt binder till plCSA9,10. Därför kan VAR2CSA vara ett verktyg för inriktning mänskliga cancerceller. Men när VAR2CSA är konjugerat med nanopartiklar, kan fullängds proteinet begränsa genomträngningen av nanopartiklar in tumörceller. Nyligen upptäckte vi en plCSA bindande peptid (plCSA-BP), härrör från malaria proteinet VAR2CSA. plCSA-BP-konjugerad lipid-polymera nanopartiklar bundna snabbt till choriocarcinoma celler och avsevärt ökad doxorubicin (DOX) cancer verksamhet i vivo11; dessa partiklar också specifikt bunden till moderkakan trofoblaster och kunde fungera som ett verktyg för riktade leverans av läkemedel till moderkakan12.
Lipid-polymera nanopartiklar består av en lipid enskiktslager skal och en hydrofob polymera kärna och representerar en ny bärare för drogen leverans. Dessa nanopartiklar kombinera fördelarna med liposomer och polymera nanocarriers, såsom kontrollerbara nanopartiklar storlek, höga biokompatibilitet, ihållande läkemedelsfrisättning, hög drog lastning effektivitet (LE) och utmärkt stabilitet13. I detta arbete använde vi en enda steg ultraljudsbehandling metod för att syntetisera lipid-polymera nanopartiklar. Denna metod är snabb, bekväm och lämplig för skala upp och har använts att förbereda lipid-polymera nanopartiklar av vår grupp11,14 och andra15,16,17,18 .
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydroklorid (EDC) är en populär carbodiimide som används som en crosslinking agent för konjugera biomolekyler som innehåller aminer och karboxylater19. Förutom att EDC är N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) den vanligaste konjugationen reagensen i ytan och nanopartiklar konjugation reaktioner20,21. NHS kan minska antalet sidoreaktioner och öka stabiliteten och avkastningen av ester intermediärer22,23.
Här beskriver vi ett protokoll för syntetisera plCSA-riktade lipid-polymera nanopartiklar. Först beskrivs steg ultraljudsbehandling syntesen av DOX-loaded lipid-polymera nanopartiklar (DNPs). Sedan introduceras en EDC/NHS konjugationens teknik för att generera plCSA-BP-konjugerad lipid-polymera nanopartiklar. Denna konjugationens teknik kan också användas till konjugat andra antikroppar och peptider för nanopartiklar. Slutligen beskriver vi de fysikalisk-kemiska egenskaper och in vitro- test används för att karakterisera de plCSA-riktade lipid-polymera nanopartiklarna. Vi anser att dessa plCSA-riktade lipid-polymera nanopartiklar kan utgöra ett effektivt system för riktade leverans av läkemedel till de flesta mänskliga cancerformer och riktade leverans av nyttolaster till moderkakan för att behandla sjukdomar i placenta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av stamlösningar
- Förbereda en vattenlösning av 4% etanol genom att späda ut 4 mL absolut etanol med 100 mL ultrarent vatten. Förvara lösningen vid 4 ° C.
Obs: Ultrarent vatten definieras som vatten utan föroreningar såsom bakterier, partiklar, joner eller nukleaser. Ultrarent vatten erhölls från en vattenreningssystem med en target resistivitet av upp till 18,2 mΩ·cm, vilket innebär låga anjon kontaminering. - Förbereda en 1 mg/mL sojalecitin stamlösning av upplösning 20 mg sojalecitin i 20 mL av en vattenlösning av 4% etanol. Lagra sojalecitin stamlösning vid 4 ° C.
- Förbereda en 25 mg/mL DSPE-PEG (2000)-COOH stamlösning av upplösning 100 mg DSPE-PEG-COOH i 4 mL av en vattenlösning av 4% etanol. Lagra stamlösning vid-20 ° C.
- Förbereda en 10 mg/mL stamlösning av DOX genom upplösning 50 mg DOX i 5 mL av ultrarent vatten. Lagra DOX stamlösning vid 4 ° C i mörker.
- Förbereda en 2 mg/mL PLGA stamlösning av upplösning PLGA 20 mg i 10 mL acetonitril. Lagra PLGA stamlösning vid 4 ° C.
FÖRSIKTIGHET: Acetonitril är brandfarligt och giftigt. Arbetar med omsorg i ett dragskåp och bära lämplig personlig utrustning, såsom lab rockar, skyddsglasögon och handskar latex. - Bered en 0,1 M 2-(morpholino) ethanesulfonic syra (MES, pH 6,0) lager genom upplösning 2,17 g mes i 100 mL ultrarent vatten. Lagra stamlösning vid 4 ° C.
2. Sammanfattning av DNPs
Obs: För att undvika DOX fotokemisk nedbrytning, alla operationer utfördes i mörkret.
Nanopartiklar var syntetiseras av en tidigare rapporterade steg ultraljudsbehandling metod11,13,14.
- Lägga till 3 mL vattenlösningen 4%-ig etanol i en steril 10 mL centrifugrör. Sedan lägger du till 90 µg sojalecitin stamlösning, 210 µg DSPE-PEG-COOH stamlösning och 750 µg DOX stamlösning 3 mL av en vattenlösning av 4% etanol.
- Placera centrifugröret i ett isbad och placera isbadet på en Ultraljuds-processor.
- Med en 1 mL spruta, överför med pipett 2 mg PLGA stamlösning droppvis (1 droppe/4-6 s) till centrifugröret. Under tiden Sonikera röret med en Ultraljuds-processor på en frekvens av 20 kHz och en utgång amplitud på 30% för 5 min för att syntetisera DNPs.
Obs: För att syntetisera enhetliga partiklar med små storlekar, hastigheten vid vilken den PLGA lösningen droppas i röret måste vara långsam och bubbla generation bör undvikas. - Rena DNPs genom tvättning ovanstående lösning i 0,1 M MES buffert (pH 6.0) 3 gånger med hjälp av en centrifug filter (MWCO, 10 kDa). Centrifugera vid 4 ° C och 1000 × g i 3 min varje gång. Slutligen, ungefär 1 mL av MES-löst nanopartiklar bör förbli.
Obs: Detta är en godtagbar stoppställe i förfarandet. Om inte brukade konjugat peptider, nanopartiklarna kan renas genom PBS-bufferten (pH 7,4), och de renade DNPs kan lagras vid 4° C i mörker.
3. konjugering av peptider till DNPs
-
Ester aktivering
- Lägg till 0,4 mg av EDC (slutlig koncentration 2 mM) 1 ml DNPs.
- Lägga till 0,24 mg av NHS i reaktionen (slutlig koncentration 2 mM).
Obs: För lätt tillägg av rätt mängd EDC och NHS, en stamlösning vara beredda om reagensen är upplöst och användas omedelbart. - Blanda reaktion komponenterna väl och placera reaktionen på en shaker; tillåta reaktion för 30 min - 1 h i rumstemperatur i mörkret.
-
Amin reaktion
- Öka buffert pH-värdet till 7,2-7,5 använder PBS (20 ×, pH 7,4).
- Lägg till 0,5 mg av plCSA-inriktning peptiden (plCSA-BP, EDVKDINFDTKEKFLAGCLIVSFHEGKC) till reaktion lösning.
Obs: Innan dessutom lös peptiderna i 20% acetonitril. Om peptider inte dissolvable, kan ultraljudsbehandling i ett bad någon sonikator var till hjälp. - Blanda lösningen väl och placera på en shaker; Låt reaktionen att gå vid 4 ° C över natten i mörkret.
- Placera konjugat lösning i dialys påsar (MWCO, 3500 Da) för att dialyze och rena de plCSA-DNPs med PBS (pH 7,4) buffert vid rumstemperatur för 24 h i mörkret.
Obs: Alternativt, rening kan göras som i steg 2,4 att erhålla plCSA-DNPs. - För cell kultur applikationer, filtrera lösningen genom ett 0,22 µm steril spruta filter ta bort potentiella fällningar.
4. karakterisering av plCSA riktade Lipid-polymera nanopartiklar
-
Mätning av hydrodynamisk nanopartiklar storlek använder dynamisk ljusspridning (DLS)
- Späd nanopartiklar med ultrarent vatten (50-faldig utspädning). Läsa in 500 µL av provet i en kyvetten enligt anvisningarna från DLS eller zeta potential instrumentet.
Obs: Zeta potential och DLS kyvetter kan variera beroende på instrumentets specifikationer. - När mätningen är klar, registrera partikeldiameter, polydispertion index (PDI) och zeta potential. Genomsnittliga resultat från 4 upprepade avläsningar och beräkna standardavvikelsen.
- Späd nanopartiklar med ultrarent vatten (50-faldig utspädning). Läsa in 500 µL av provet i en kyvetten enligt anvisningarna från DLS eller zeta potential instrumentet.
-
Transmissionselektronmikroskopi (TEM)
Obs: Morfologi av nanopartiklarna observerades av TEM med metoden negativa fläcken. 24- Späd nanopartiklar med ultrarent vatten (400-fold spädning). Tillsätt 20 µL av provet på ett TEM rutnät och låt sitta i 5 min.
- Tillsätt 100 µL av 2% (w/v) phosphotungstic syra och låt sitta i 2 min. Wick bort droplet-programmet.
- Torka rutnätet TEM vid rumstemperatur.
- Ange TEM acceleration spänningen på 80 kV och förstora bilden till 100 000 × att visualisera nanopartiklarna.
-
Bestämning av inkapsling effektiviteten (EE) och LE
- Standardkurvan generation. Upplösa DOX i ultrarent vatten för att förbereda DOX lösningar av fem olika koncentrationer: 1 µg/mL, 5 µg/mL, 10 µg/mL, 50 µg/mL och 100 µg/mL. Mäta upptaget av DOX lösningarna på 480 nm med en UV-VIS-spektrometer. Generera en standardkurva baserat på DOX koncentrationerna.
- Späd 25 µL av nanopartiklar med 500 µL av ultrarent vatten. Mäta upptaget på 480 nm med en UV-VIS-spektrometer. Beräkna läkemedelskoncentrationen av standardkurvan.
- Beräkna den LE med hjälp av följande ekvation:
LE = ((mängden narkotika i nanopartiklar) / (total vikt av material)) × 100%. - Beräkna den EE med hjälp av följande ekvation:
EE = ((mängden narkotika i nanopartiklar) / (mängden lagt narkotika)) × 100%.
-
Mätning av konjugation effektivitet med bicinchoninic syra (BCA) analys 25 , 26 , 27
- Pipettera 25 µL av standard peptid lösningar (tabell 1) eller plCSA-DNPs i mikroplattan brunnar i två exemplar. Tillsätt 200 µL av arbetande reagens till varje brunn och blanda plattan väl på en tallrik shaker för 30 s.
- Täcka plattan och inkubera vid 37 ° C i 30 min.
- Mät absorbansen vid 562 nm på en tallrik-läsare. Använda genererade standardkurvan för att beräkna plCSA koncentrationerna av plCSA-DNPs.
- Beräkna konjugation effektivitet med hjälp av följande ekvation:
Konjugation effektivitet = ((mängden peptid i nanopartiklar) / (mängden lagt peptid)) × 100%.
| Injektionsflaska | Volym spädningsvätska (μL) | Volym och källa av peptid (μL) | Slutliga peptid koncentration (µg/mL) |
| A | 0 | 300 i lager | 1000 |
| B | 250 | 250 av injektionsflaskan en utspädning | 500 |
| C | 250 | 250 av injektionsflaska B utspädning | 250 |
| D | 250 | 250 av injektionsflaskan C utspädning | 125 |
| E | 300 | 200 av injektionsflaskan D utspädning | 50 |
| F | 250 | 250 av injektionsflaskan E utspädning | 25 |
| G | 400 | 100 av injektionsflaskan F utspädning | 5 |
| H | 500 | 0 | 0 |
Tabell 1. Beredning av Standard peptider
5. fluorescence mikroskopi bedömning av plCSA-riktade nanopartiklar upptag i Choriocarcinoma (JEG3) celler
- Utsäde celler på sterila 12 brunnar på 1,0 × 104 celler per brunn med komplett DMEM/F12 (cDMEM/F12, som innehåller 1% penicillin/streptomycin och 10% fetalt bovint serum (FBS)). Tillåta cellerna att växa till 60% sammanflödet vid 37 ° C och 5% CO2 under fuktiga förhållanden.
- Ta bort media och tillsätt 1 mL kall färsk medier med ett lågt serum-innehåll (5% FBS) och DNPs eller plCSA-DNPs (5 µg DOX-ekvivalenter).
- Inkubera blandningen av celler och nanopartiklar vid 4 ° C för 1 h.
- Ta bort media efter inkuberingen och tvätta cellerna tre gånger med PBS. Sedan tillsätt 1 mL färsk cDMEM/F12 och inkubera cellerna vid 37 ° C i 30 min.
- Ta bort cDMEM/F12 och tvätta cellerna tre gånger med PBS.
- Tillsätt 2 mL kallt 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) och odla i rumstemperatur i 15 min att fixa cellerna.
- Ta bort PFA. Tvätta cellerna med 2 mL PBS en gång. Tillsätt 1 mL PBS som innehåller DAPI (1 µg/mL) för kärnor färgning, och odla i rumstemperatur i 10 min.
- Aspirera PBS och tvätta cellerna tre gånger med PBS.
- Lägg monteringsmedium och bild fluorescensen med en fluorescensmikroskopi, med gröna och blå kanalerna för att visualisera DOX och kärnor, respektive.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I detta protokoll, PLGA, DSPE-PEG-COOH och soja lecitin är en representativ polymer, lipid-PEG-COOH konjugat och lipid, respektive. Syntesen av plCSA riktade lipid-polymera nanopartiklar via ett enda steg ultraljudsbehandling metod och EDC/NHS-teknik illustreras i figur 1. Först under ultraljudsbehandling villkor, sojalecitin, PLGA och DSPE-PEG-COOH själv montera formuläret core-shell strukturerad DNPs. Kärnan består av PLGA och inkapslade DOX, skalet består av DSPE-PEG-COOH och den sojalecitin enskiktslager ligger vid gränssnittet mellan skalet och kärnan. Sedan var de - COOH-grupper utsatta på DNP ytan konjugerat med -NH2 grupperna av den peptid via EDC/NHS tekniken att syntetisera plCSA-DNPs.
De DNPs som upprättats i detta protokoll var 82,3 ± 4,7 nm i diameter, och efter konjugering till plCSA-BP, diameter av de primära DNPs ökat till 109,3 ± 5,9 nm (figur 2). PDI av DNPs och plCSA-DNPs var 0.127±0.005 och 0.134 ± 0,065, respektive. TEM bilder av DNPs och plCSA-DNPs visade också att partiklar var väl spridda och allmänt hade sfäriska morfologier (figur 3). Zeta potential av DNPs och plCSA-DNPs var -20,1 ± 1,32 mV och-29.9 ± 3,56 mV, respektive (tabell 2). Dessa nanopartiklar förutspås därför vara mycket stabil.
| Nanopartiklar | Diameter(Nm) | PDI | Zeta potential (mV) |
| DNPs | 82.3±4.7 | 0.127±0.005 | -20.1±1.32 |
| plCSA-DNPs | 109.3±5.9 | 0.134±0.065 | -29.9±3.56 |
| PDI:polydispersity index. Data presenteras medelvärde ± SD (n = 3). | |||
Tabell 2. Karakterisering av nanopartiklar
De EE och LE av nanopartiklar är viktiga för kliniska tillämpningar. De EE av DOX av DNPs och plCSA-DNPs var 40,3 ± 1,67% 39,5 ± 1,94%, respektive. LE av DOX i DNPs och plCSA-DNPs var 6,2 ± 0,74% 5,1 ± 0,42%, respektive. Dessa data visade att omfattningen av drogen lastning och drog inkapsling upprätthölls efter plCSA-BP dekoration. Dekoration effektiviteten i plCSA-BP på ytan av DNPs bestämdes enligt BCA-analysen (figur 4). PlCSA-BP konjugation effektivitet befanns vara 45,5 ± 3,7%.
JEG3 cellernas upptag analysen indikerade att de plCSA-DNPs snabbt bunden till JEG3 celler inom 30 min (figur 5). PlCSA-BP var därför effektivt konjugerat till DNP ytan i detta protokoll. PlCSA-BP kunde dessutom snabbt binder till JEG3 celler och öka cellulära upptaget av nanopartiklarna.
Figur 1. Schematisk illustration av den metod som används för att syntetisera plCSA-riktade lipid-polymera nanopartiklar. Först, en enda steg ultraljudsbehandling metod användes för att syntetisera lipid-polymera nanopartiklar (DNPs), och sedan EDC/NHS tekniken användes till konjugat peptider till nanopartiklar ytor (plCSA-DNPs). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Storlek fördelningen av de olika nanopartiklarna. Hydrodynamiska storleken på DNPs (A) och plCSA-DNPs (B) mätt med DLS. Representativa siffror presenteras för att demonstrera partikelstorlek och storleksfördelning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Nanopartiklar morfologi kännetecknas av TEM. Typiska TEM bild av DNPs (A) och plCSA-DNPs (B) observerats med 2% phosphotungstic syra färgning. Skalstapeln = 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Mätning av konjugation effektivitet med BCA analys. Standardkurvan av peptiderna på 562 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Nanopartiklar upptag av JEG3 celler. JEG3 celler analyserades av fluorescensmikroskopi efter 30 min av inkubation med 5 µg/mL olika nanopartiklar. Röd: DOX, blå: DAPI-märkt atomkärnor. Skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll ger en effektiv och reproducerbar metod för syntetisera plCSA-BP-konjugerad lipid-polymera nanopartiklar. Den enda steg ultraljudsbehandling metoden att förbereda lipid-polymera nanopartiklar är snabb, reproducerbar och skiljer sig från typiska nanoprecipitation metoder som involverar uppvärmning, vortexa eller avdunstning. Därför, den utvecklade metoden avsevärt minskar tid som syntes. Dessutom är den EDC/NHS konjugationens används i detta protokoll en vanligt förekommande och bekväm teknik till konjugat peptider och antikroppar för nanopartiklar. Därför, kombinationen av metoden steg ultraljudsbehandling med EDC/NHS konjugationens tekniken att syntetisera plCSA-inriktning lipid-polymer nanopartiklar kan skalas upp för kliniska tillämpningar.
Vissa förfaranden är avgörande för framgångsrikt syntetisera och karaktärisera plCSA-DNPs. Först bestämma den relativa koncentrationen av lecitin, PLGA och DSPE-PEG-COOH lipid-polymer nanopartiklar storlek och polydispertion. När koncentrationen av lecitin är fast, en högre koncentration av DSPE-PEG-COOH resulterar i lägre polydispertion och en mindre nanopartiklar storlek,13,15 vilket följaktligen minskar läkemedlet LE. När koncentrationen av PLGA är fast, ersätts mer DSPE-PEG-COOH av lecitin, leder till högre nanopartiklar polydispertion och större nanopartiklar storlek15. I det här fallet nanopartiklarna är mer instabila och sammanlagda enkelt. I detta protokoll, DSPE-PEG-COOH/PLGA viktförhållandet är 0,11 och lecitin/DSPE-PEG-COOH massa förhållandet är 0,43. Lipid-polymera nanopartiklar storlek är cirka 82 nm med en PDI av ungefärligt 0,127.
Andra är pH-värdet i lösningen under konjugationen av peptiderna till nanopartiklarna av yttersta vikt. Ester aktiveringen optimalt pH är 5.0-6.0, och amine reaktionen är mest effektivt vid pH 7,2-7,519,28,29. För bästa resultat, bör reaktionen utföras i två steg. Först, ester aktivering sker i MES (eller en annan noncarboxylate, nonamine buffert) vid pH 5,0-6,0. Sedan justeras pH-värdet till 7,2-7,5 med PBS (eller en annan nonamine buffert) omedelbart före reaktionen med amine-innehållande molekyl19. Med tanke på att halveringstiden av NHS estrar är 4-5 h pH 7,019, överskrider amine reaktionen 10 h vid 4 ° C.
Den sista kritiska faktorn är nanopartiklar upptag. Nontargeted upptag av DNPs av JGE3 celler eliminerades i en funktion analys av riktade upptaget genom att styra kultur tiden och temperaturen och koncentrationen av FBS i mediet. I detta protokoll, JEG3 celler inkuberades med 5% FBS vid 4 ° C i 1 h och sedan odlade vid 37 ° C i 30 min att minimera DNP cellernas upptag.
Om problem uppstår under förfarandet, finns det tre stora felsökningssteg relaterade till syntes och karakterisering av plCSA-DNPs. Först, lipid-polymera nanopartiklar utarbetades av den självmontering av PLGA och lecitin ultraljudsbehandling villkor. PLGA bara löses upp i organiskt lösningsmedel. Därmed påskyndar vid tillägg till en hydrofil lösningsmedel, PLGA snabbt in små nanopartiklar. För att minimera effekten av att droppvis tillsätta hastighet och undvika att genereras större partiklar, är ultraljudsbehandling av blandningen i 1-2 min innan du lägger till PLGA nödvändigt. För det andra, även om kvantitativ analys av plCSA-BP konjugation effektivitet med BCA-metoden är snabb och bekväm, en högpresterande vätskekromatografi (HPLC) analys är mer exakt. HPLC experimentella detaljer har varit beskrivs av våra grupp-11 och andra30,31,32. Slutligen kan de optimala förutsättningarna för plCSA-DNP cellernas upptag variera för andra cancerceller. Gradvis minskande FBS koncentrationen och öka inkubationstiden vid 37 ° C kan hjälpa till att fastställa optimala förutsättningar.
En begränsning i protokollet är att den vattenavvisande egenskaper av droger bestämmer EE av droger. Hydrofoba läkemedel jämfört med hydrofila läkemedel, och har en starkare affinitet för PLGA, vilket resulterar i en ökad drog EE. I dessa fall måste förfarandena för syntesen av de plCSA-riktade lipid-polymera nanopartiklarna undersökas experimentellt för att bestämma den mest effektiva syntesmetod som som resulterar i idealisk drogen LE och EE.
Som nämnts ovan uttrycks specifikt den glykosaminoglykan plCSA på de flesta cancerceller och moderkakan trofoblaster. Därför är det viktigt att notera att de plCSA-NPs ska användas för riktade leverans av therapeutics att tumörceller i endast icke-gravida djur och människor, och att dessa droger-laddade partiklar skulle leda till biverkningar i moderkakan hos dräktiga djur och människor.
Sammanfattningsvis har vi beskrivit en enkel och bekväm metod att syntetisera plCSA-riktade lipid-polymera nanopartiklar. Betydelsen av detta protokoll är att det ökar den drogen tillgängligheten på tumörer och placenta, samtidigt minimera samtidig toxicitet. Detta tillvägagångssätt bör vara användbart för riktade leverans av läkemedel till tumörer och moderkakan och kan skalas för att förbereda plCSA-riktade lipid-polymera nanopartiklar för kliniska tillämpningar i framtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
X.F. och B.Z. är uppfinnarna på den patent PCT/CN2017/108646 och 201710906587.6 har skickats in av SIAT som täcker en plCSA-riktade nanopartiklar syntesmetod och tillämpning. Inga potentiella intressekonflikter lämnades ut av andra författare.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av bidrag från den nationella nyckel-forskning och utveckling Program i Kina (2016YFC1000402), National Natural Sciences Foundation (81571445 och 81771617) och naturvetenskap Foundation i Guangdongprovinsen (2016A030313178) till X.F. och Shenzhen Basic Research Fund (JCYJ20170413165233512) till X.F.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plCSA peptide | Shanghai GL Biochem | 573518 | for peptide synthesis |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical | 10009218 | for nanoparticles synthesis |
| Soybean lecithin | Avanti Polar Lipids | 441601 | for nanoparticles synthesis |
| DSPE-PEG-COOH | Avanti Polar Lipids | 880125 | for nanoparticles synthesis |
| Doxorubicin | JKChemical | 113424 | for nanoparticles synthesis |
| Acetonitrile | Shanghai Lingfeng | 1008621 | for nanoparticles synthesis |
| PLGA | Sigma-Aldrich | 719897 | for nanoparticles synthesis |
| Ultrasonic processor | Sonics | VCX130 | for nanoparticles synthesis |
| Centrifuge filter (MWCO 10 kDa) | Millipore | UFC801024 | for nanoparticles purification |
| centrifuge | Sigma | 3-18KS | for nanoparticles purification |
| 2-[morpholino]ethanesulfonic acid(MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | for peptide conjugation |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | 3450 | for peptide conjugation |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 56480 | for peptide conjugation |
| Dialysis bags | Spectrum | 132592T | for nanoparticles purification |
| PBS | Hyclone | SH30028.01 | for cell culture |
| 10 mL centrifuge tubes, polypropylene | Aladdin | S-025 | for nanoparticles synthesis |
| 15 mL centrifuge tubes, polypropylene | Corning | 430791 | for various applications |
| 0.22 μm sterile syringe filter | Millipore | SLGV033RB | for nanoparticles purification |
| 1 ml syringe, polypropylene | BD | 328421 | for nanoparticles synthesis |
| Malvern Zetasizer | Malvern | Nano ZS | for particle size analyer |
| Phosphotungstic acid | for TEM | ||
| TEM grid | EMCN | BZ10024a | for TEM |
| UV-VIS spectrometer | Leagene | DZ0035 | for TEM |
| Transmission electron microscope |
JEOL | JEM-100CXII | for particle size analyer |
| BCA reagent A | Thermo Fisher Scientific | 23228 | for BCA assay |
| BCA reagent B | Thermo Fisher Scientific | 23224 | for BCA assay |
| 96-Well Plates | Corning | 3599 | for BCA assay |
| Plate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan™ GO | for BCA assay |
| 12-well plates | Corning | 3513 | for cell culture |
| JEG3 cell | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | TCHu195 | Human placenta |
| DMEM/F12 | Hyclone | SH30272.01 | phenol red-free |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10100 | for cell culture |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO | 15070063 | for cell culture |
| Fluorescence microscope | OLYMPUS | CKK53 | for celluar uptake |
| Paraformaldehyde | Shanghai Lingfeng | 1372021 | for celluar uptake |
| DAPI | Sangon Biotech | A606584 | for celluar uptake |
| Mounting medium | Life | P36961 | for celluar uptake |
References
- Davis, M. E., Shin, D. M. Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (9), 771 (2008).
- Nie, S., Xing, Y., Kim, G. J., Simons, J. W. Nanotechnology applications in cancer. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 257-288 (2007).
- Jabir, N. R., et al. An overview on the current status of cancer nanomedicines. Current Medical Research and Opinion. 34 (5), 911-921 (2018).
- Pillai, G. Nanomedicines for Cancer Therapy: An Update of FDA Approved and Those under Various Stages of Development. SOJ Pharmacy & Pharmaceutical Sciences. 1 (2), 1-13 (2014).
- Marta, T., Luca, S., Serena, M., Luisa, F., Fabio, C. What is the role of nanotechnology in diagnosis and treatment of metastatic breast cancer? Promising Scenarios for the Near Future. Journal of Nanomaterials. 2016, e5436458 (2016).
- Dasari, S., Tchounwou, P. B. Cisplatin in cancer therapy: molecular mechanisms of action. European journal of Pharmacology. 740, 364-378 (2014).
- Brigger, I., Dubernet, C., Couvreur, P. Nanoparticles in cancer therapy and diagnosis. Advanced Drug Delivery Reviews. 64, 24-36 (2012).
- Steichen, S. D., Caldorera-Moore, M., Peppas, N. A. A review of current nanoparticle and targeting moieties for the delivery of cancer therapeutics. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 48 (3), 416-427 (2013).
- Salanti, A., et al. Targeting human cancer by a glycosaminoglycan binding malaria protein. Cancer Cell. 28 (4), 500-514 (2015).
- Seiler, R., et al. An Oncofetal Glycosaminoglycan Modification Provides Therapeutic Access to Cisplatin-resistant Bladder Cancer. European Urology. 72 (1), 142-150 (2017).
- Zhang, B., et al. Targeted delivery of doxorubicin by CSA-binding nanoparticles for choriocarcinoma treatment. Drug Delivery. 25 (1), 461-471 (2018).
- Zhang, B., et al. Placenta-specific drug delivery by trophoblast-targeted nanoparticles in mice. Theranostics. 26 (2), 130-137 (2018).
- Zhang, L., et al. Self-assembled lipid--polymer hybrid nanoparticles: a robust drug delivery platform. ACS Nano. 2 (8), 1696-1702 (2008).
- Zheng, M., et al. Single-step assembly of DOX/ICG loaded lipid-polymer nanoparticles for highly effective chemo-photothermal combination therapy. ACS. 7 (3), 2056-2067 (2013).
- Fang, R. H., Aryal, S., Hu, C. -M. J., Zhang, L. Quick synthesis of lipid− polymer hybrid nanoparticles with low polydispersity using a single-step sonication method. Langmuir. 26 (22), 16958-16962 (2010).
- Gu, L., et al. Folate-modified, indocyanine green-loaded lipid-polymer hybrid nanoparticles for targeted delivery of cisplatin. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 28 (7), 690-702 (2017).
- Mandal, B., Mittal, N. K., Balabathula, P., Thoma, L. A., Wood, G. C. Development and in vitro evaluation of core-shell type lipid-polymer hybrid nanoparticles for the delivery of erlotinib in non-small cell lung cancer. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 81, 162-171 (2016).
- Shi, T., et al. Enhanced legumain-recognition and NIR controlled released of cisplatin-indocyanine nanosphere against gastric carcinoma. European Journal of Pharmacology. 794, 184-192 (2017).
- Grabarek, Z., Gergely, J. Zero-length crosslinking procedure with the use of active esters. Analytical Biochemistry. 185 (1), 131-135 (1990).
- Hadjipanayis, C. G., et al. EGFRvIII Antibody-Conjugated Iron Oxide Nanoparticles for Magnetic Resonance Imaging-Guided Convection-Enhanced Delivery and Targeted Therapy of Glioblastoma. Cancer Research. 70 (15), 6303-6312 (2010).
- Sadhukha, T., Wiedmann, T. S., Panyam, J. Inhalable magnetic nanoparticles for targeted hyperthermia in lung cancer therapy. Biomaterials. 34 (21), 5163-5171 (2013).
- Jennings, M., Nicknish, J. Localization of a site of intermolecular cross-linking in human red blood cell band 3 protein. Journal of Biological Chemistry. 260 (9), 5472-5479 (1985).
- Staros, J. V. N-hydroxysulfosuccinimide active esters: bis(N-hydroxysulfosuccinimide) esters of two dicarboxylic acids are hydrophilic, membrane-impermeant, protein cross-linkers. Biochemistry. 21 (17), 3950-3955 (1982).
- Valencia, P. M., et al. Single-step assembly of homogenous lipid− polymeric and lipid− quantum dot nanoparticles enabled by microfluidic rapid mixing. ACS. 4 (3), 1671-1679 (2010).
- Altintas, I., et al. Nanobody-albumin nanoparticles (NANAPs) for the delivery of a multikinase inhibitor 17864 to EGFR overexpressing tumor cells. Journal of Controlled Release. 165 (2), 110-118 (2013).
- Maya, S., et al. Cetuximab conjugated O-carboxymethyl chitosan nanoparticles for targeting EGFR overexpressing cancer cells. Carbohydrate Polymers. 93 (2), 661-669 (2013).
- Deepagan, V. G., et al. In vitro targeted imaging and delivery of camptothecin using cetuximab-conjugated multifunctional PLGA-ZnS nanoparticles. Nanomedicine. 7 (4), 507-519 (2012).
- Totaro, K. A., et al. Systematic investigation of EDC/sNHS-mediated bioconjugation reactions for carboxylated peptide substrates. Bioconjugate Chemistry. 27 (4), 994-1004 (2016).
- Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions. Mass Spectrometry Reviews. 25 (4), 663-682 (2006).
- Zhang, B., et al. LDLR-mediated peptide-22-conjugated nanoparticles for dual-targeting therapy of brain glioma. Biomaterials. 34 (36), 9171-9182 (2013).
- Koren, E., Apte, A., Sawant, R. R., Grunwald, J., Torchilin, V. P. Cell-penetrating TAT peptide in drug delivery systems: proteolytic stability requirements. Drug Delivery. 18 (5), 377-384 (2011).
- Chu, Y., et al. Topical ocular delivery to laser-induced choroidal neovascularization by dual internalizing RGD and TAT peptide-modified nanoparticles. International Journal of Nanomedicine. 12, 1353-1368 (2017).
