Summary
Qui, presentiamo un protocollo per la sintesi del peptide di associazione placentare condroitina solfato A (plCSA-BP)-coniugato del lipido-polimero nanoparticelle via passo singolo sonicazione e bioconjugate tecniche. Queste particelle costituiscono un nuovo strumento per la somministrazione mirata di terapeutica di tumori più umani e trofoblasto placentare per trattare tumori e disturbi placentare.
Abstract
Un metodo terapeutico del cancro efficace riduce ed Elimina i tumori con minima tossicità sistemica. Le nanoparticelle attivamente targeting offrono un approccio promettente per la terapia del cancro. Il solfato della condroitina placentare glycosaminoglycan un (plCSA) è espresso su una vasta gamma di cellule tumorali e trofoblasto placentare e malarica proteine che var2csa in particolare può essere associato a plCSA. Un peptide di associazione segnalata placentare condroitina solfato A (plCSA-BP), derivato dalla proteina malarica VAR2CSA, specificamente anche possibile associare a plCSA sulle cellule tumorali e trofoblasto placentare. Quindi, plCSA-BP-coniugato nanoparticelle potrebbero essere usate come uno strumento per somministrazione di farmaci mirati a cancri umani e trofoblasto placentare. In questo protocollo, descriviamo un metodo per sintetizzare nanoparticelle plCSA-BP-coniugato del lipido-polimero caricate con doxorubicina (plCSA-DNPs); il metodo consiste in un singolo sonicazione passo e bioconjugate tecniche. Inoltre, sono descritti diversi metodi per la caratterizzazione plCSA-DNPs, compresa la determinazione di loro proprietà fisico-chimiche e l'assorbimento cellulare di cellule placentari coriocarcinoma (JEG3).
Introduction
Un metodo terapeutico del cancro efficace riduce ed Elimina i tumori con minima tossicità sistemica. Quindi, targeting tumorale selettiva è la chiave per esplorare metodi di successo terapeutici. Le nanoparticelle offrono un'opportunità promettente per la terapia del cancro, e molecolare assembly con diversi gruppi funzionali saranno che permettono di migliorare l'efficacia dei farmaci e ridurre gli effetti collaterali associati1,2. Inoltre, i sistemi di nanoparticella utilizzano principalmente attivi e passivi di targeting per raggiungere target tumori3.
Passivo di targeting sfrutta le caratteristiche innate di nanoparticelle e permeabilità migliorata ed effetti di ritenzione (EPR) per raggiungere le cellule del tumore. Liposomi cationici sono stati utilizzati con successo per fornire varie droghe anticancro a tumori in applicazioni cliniche4,5,6. Nonostante il potenziale effetto terapeutico del cancro efficace, una concentrazione di farmaco basso nella regione del tumore e un'incapacità di distinguere le cellule del tumore dai tessuti normali sono due principali limitazioni del passivo-targeting nanoparticelle7.
Strategie di targeting attive approfitta di antigene-anticorpo, ligando-recettore e altre interazioni di riconoscimento molecolare per consegnare i farmaci specificamente a tumori8. Il solfato della condroitina placentare glycosaminoglycan un (plCSA) è largamente espresso sulla maggior parte delle cellule tumorali e trofoblasto placentare. Inoltre, la proteina malarica VAR2CSA specificamente possibile associare a plCSA9,10. Quindi, VAR2CSA può essere uno strumento per il targeting di cellule tumorali umane. Tuttavia, quando VAR2CSA è coniugato a nanoparticelle, la proteina full-length può limitare la penetrazione di nanoparticelle nelle cellule del tumore. Recentemente, abbiamo scoperto un peptide di associazione plCSA (plCSA-BP), derivato dalla proteina malarica VAR2CSA. plCSA-BP-coniugato del lipido-polimero nanoparticelle rapidamente legato ad coriocarcinoma cellule e significativamente aumentato doxorubicina (DOX) attività antitumorale in vivo11; Queste particelle anche specificamente legato al trofoblasto placentare e potrebbero servire come strumento per la somministrazione mirata di farmaci per la placenta12.
Le nanoparticelle lipidiche-polimero sono costituiti da un guscio di monostrato lipidico e un nucleo idrofobo polimerico e rappresentano un nuovo vettore per la consegna della droga. Queste nanoparticelle combinano i vantaggi dei liposomi e polimerici nanovettori, quali dimensioni delle nanoparticelle controllabile, elevata biocompatibilità, rilascio prolungato di farmaci, efficienza di carico alta droga (LE) e un'eccellente stabilità13. In questo lavoro, abbiamo usato un metodo a passo singolo sonicazione per sintetizzare nanoparticelle lipidiche-polimero. Questo metodo è veloce, comodo e adatto per scale-up ed è stato ampiamente utilizzato per preparare nanoparticelle lipidiche-polimero dal nostro gruppo11,14 e gli altri15,16,17,18 .
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide cloridrato (EDC) è un popolare carbodiimide usato come un agente di reticolazione per biomolecole contenenti ammine e carbossilati19di coniugazione. Oltre a EDC, N-Idrossisulfosuccinimide (NHS) è il più comune reagente di coniugazione in superficie e nanoparticelle coniugazione reazioni20,21. NHS può ridurre il numero di reazioni secondarie e migliorare la stabilità e rendimento di estere intermedi22,23.
Qui, descriviamo un protocollo per la sintesi di nanoparticelle di targeting per plCSA del lipido-polimero. In primo luogo, la sintesi di passo singolo sonicazione delle nanoparticelle di DOX-caricati del lipido-polimero (DNPs) è descritto. Quindi, una tecnica di bioconjugate EDC/NHS per la generazione di nanoparticelle plCSA-BP-coniugato del lipido-polimero è stato introdotto. Questa tecnica di bioconjugate è utilizzabile anche per coniugare altri anticorpi e peptidi alle nanoparticelle. Infine, descriviamo l'analisi fisico-chimica di proprietà e in vitro utilizzato per caratterizzare le nanoparticelle di targeting per plCSA del lipido-polimero. Crediamo che queste nanoparticelle di targeting per plCSA del lipido-polimero potrebbero costituire un sistema efficace per la somministrazione mirata di farmaci per tumori più umani e la somministrazione mirata di payload di placenta per trattare i disordini placentari.
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Protocol
1. preparazione delle soluzioni madri
- Preparare una soluzione acquosa di etanolo al 4% diluendo 4 mL di etanolo assoluto con 100 mL di acqua ultrapura. Conservare la soluzione a 4 ° C.
Nota: Acqua ultrapura è definita come acqua senza contaminanti come batteri, particelle, ioni o nucleasi. Acqua ultrapura è stata ottenuta da un sistema di purificazione dell'acqua con una resistività di destinazione di mΩ·cm fino a 18,2, che significa bassa contaminazione anionici. - Preparare un 1 mg/mL di soluzione madre di lecitina di soia sciogliendo 20 mg di lecitina di soia in 20 mL di soluzione acquosa di etanolo al 4%. Conservare la soluzione stock di lecitina di soia a 4 ° C.
- Preparate un 25 mg/mL soluzione di riserva (2000)-COOH DSPE-PEG sciogliendo 100mg di DSPE-PEG-COOH in 4 mL di soluzione acquosa di etanolo al 4%. Conservare la soluzione di riserva a-20 ° C.
- Preparate un 10 mg/mL soluzione di riserva di DOX sciogliendo 50 mg di DOX in 5 mL di acqua ultrapura. Conservare la soluzione di riserva di DOX a 4 ° C al buio.
- Preparate un 2 mg/mL soluzione di riserva di PLGA sciogliendo 20 mg di PLGA in 10 mL di acetonitrile. Conservare la soluzione stock di PLGA a 4 ° C.
Attenzione: Acetonitrile è infiammabile e tossico. Operare con cura in una cappa aspirante e indossare adeguati dispositivi personali, quali camici, occhiali di sicurezza e guanti in lattice. - Preparare una soluzione stock di 0.1 M 2-(morpholino) ethanesulfonic acido (MES, pH 6.0) sciogliendo 2,17 g di MES in 100 mL di acqua ultrapura. Conservare la soluzione di riserva a 4 ° C.
2. sintesi di DNPs
Nota: Per evitare la degradazione fotochimica DOX, tutte le operazioni sono state eseguite nel buio.
Le nanoparticelle sono state sintetizzate da un precedentemente segnalati passo singolo sonicazione metodo11,13,14.
- Aggiungere 3 mL di soluzione acquosa di etanolo al 4% in una provetta sterile da 10 mL. Quindi, aggiungere 90 µ g della soluzione madre di lecitina di soia, 210 µ g di soluzione di riserva DSPE-PEG-COOH e 750 µ g di soluzione di riserva DOX a 3 mL di soluzione acquosa di etanolo al 4%.
- Inserire la provetta da centrifuga in un bagno di ghiaccio e posizionare il bagno di ghiaccio su un processore ad ultrasuoni.
- Con una siringa da 1 mL, pipettare 2 mg di soluzione di riserva di PLGA goccia a goccia (1 goccia/4-6 s) nella provetta della centrifuga. Nel frattempo, Sonicare tubo usando un processore ad ultrasuoni ad una frequenza di 20 kHz e un'ampiezza di uscita di 30% per 5 min per sintetizzare il DNPs.
Nota: Per sintetizzare particelle uniformi con piccole dimensioni, la velocità alla quale la soluzione PLGA è gocciolata nella provetta deve essere lento, e generazione di bolla dovrebbe essere evitato. - Purificare il DNPs lavando la soluzione di cui sopra in tampone MES 0.1 M (pH 6.0) 3 volte usando un filtro di centrifuga (MWCO, 10 kDa). Centrifuga a 4 ° C e 1000 × g per 3 minuti ogni volta. Infine, dovrebbero rimanere circa 1 mL di nanoparticelle MES-risolto.
Nota: Questo è un punto di sosta accettabile nella procedura. Se non utilizzato per coniugare peptidi, le nanoparticelle possono essere purificate da tampone PBS (pH 7,4), e il DNPs purificata possono essere memorizzati a 4° C al buio.
3. coniugazione di peptidi a DNPs
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Attivazione dell'estere
- Aggiungere 0,4 mg di EDC (concentrazione finale di 2 mM) a 1 mL di DNPs.
- Aggiungere 0,24 mg di NHS alla reazione (concentrazione finale di 2 mM).
Nota: Per aggiungere facilmente la corretta quantità di EDC e NHS, una soluzione di riserva può essere preparata se i reagenti sono dissolti e utilizzati immediatamente. - Mescolare bene i componenti di reazione e posizionare la reazione su un agitatore; permettono di reazione per 30 min - 1 h a temperatura ambiente al buio.
-
Reazione di ammina
- Aumentare il tampone a pH 7.2-7.5 utilizzando PBS (20 ×, pH 7.4).
- Aggiungere alla soluzione di reazione 0,5 mg del peptide plCSA-targeting (plCSA-BP, EDVKDINFDTKEKFLAGCLIVSFHEGKC).
Nota: Prima dell'addizione, sciogliere i peptidi in 20% acetonitrile. Se peptidi non sono solubili, sonicazione in un sonicatore vasca può utili. - Mescolare bene la soluzione e poi posto su un agitatore; consentire la reazione di procedere a 4 ° C durante la notte nel buio.
- Posizionare la soluzione di coniugato in sacchetti di dialisi (MWCO, Da 3.500) a Dializzare e purificare il plCSA-DNPs utilizzando il tampone PBS (pH 7.4) a temperatura ambiente per 24 h al buio.
Nota: In alternativa, purificazione potrebbe essere eseguita come descritto al punto 2.4 per ottenere plCSA-DNPs. - Per applicazioni della coltura delle cellule, filtrare la soluzione ricostituita per filtro da 0,22 µm siringa sterile per rimuovere potenziali precipitati.
4. caratterizzazione del lipido plCSA-mirati-nanoparticelle polimeriche
-
Misurazione delle dimensioni delle nanoparticelle idrodinamico utilizzando diffusione dinamica della luce (DLS)
- Diluire le nanoparticelle con acqua ultrapura (diluizione 50 volte). Caricare 500 µ l di campione in una provetta secondo le istruzioni dello strumento potenziale DLS o zeta.
Nota: Potenziale Zeta e cuvette DLS possono variare basato sulle specifiche dello strumento. - Una volta completata la misurazione, registrare il diametro della particella, indice di polidispersione (PDI) e potenziale zeta. Media i risultati ottenuti da 4 ripetono letture e calcolare la deviazione standard.
- Diluire le nanoparticelle con acqua ultrapura (diluizione 50 volte). Caricare 500 µ l di campione in una provetta secondo le istruzioni dello strumento potenziale DLS o zeta.
-
Microscopia elettronica a trasmissione (TEM)
Nota: La morfologia delle nanoparticelle è stata osservata da TEM con il metodo della macchia negativa. 24- Diluire le nanoparticelle con acqua ultrapura (400-fold diluizione). Aggiungere 20 µ l del campione su una griglia TEM e lasciar per riposare per 5 min.
- Aggiungere 100 µ l di acido fosfotungstico 2% (p/v) e lasciar per riposare per 2 min. stoppino via la goccia.
- Asciugare la griglia TEM a temperatura ambiente.
- Impostare la tensione di accelerazione TEM a 80 kV e ingrandire l'immagine a 100.000 × visualizzare le nanoparticelle.
-
Determinazione dell'efficienza di incapsulamento (EE) e LE
- Generazione di curva standard. Sciogliere DOX in acqua ultrapura per preparare soluzioni DOX di cinque diverse concentrazioni: 1 µ g/mL, 5 µ g/mL, 10 µ g/mL, 50 µ g/mL e 100 µ g/mL. Misurare l'assorbimento delle soluzioni DOX a 480 nm con uno spettrometro UV-VIS. Generare una curva standard basata sulle concentrazioni di DOX.
- Diluire 25 µ l di nanoparticelle con 500 µ l di acqua ultrapura. Misurare l'assorbimento a 480 nm con uno spettrometro UV-VIS. La curva standard per calcolare le concentrazioni di farmaco.
- Calcolare LE usando la seguente equazione:
LE = ((quantità di droghe in nanoparticelle) / (Totale peso dei materiali)) × 100%. - Calcolare il EE usando la seguente equazione:
EE = ((quantità di droghe in nanoparticelle) / (quantità di aggiunta di droga)) × 100%.
-
Misurazione dell'efficienza coniugazione usando l'analisi (BCA) acido bicinconinico 25 , 26 , 27
- Dispensare 25 µ l di soluzioni del peptide standard (tabella 1) o plCSA-DNPs nei pozzetti di micropiastre in duplice copia. Aggiungere 200 µ l del reagente lavoro in ciascun pozzetto e mescolare la piastra bene su un agitatore per piastre per 30 s.
- Coprire la piastra e incubare a 37 ° C per 30 min.
- Misurare l'assorbanza a 562 nm su un lettore di piastra. Utilizzare la curva standard generata per calcolare le concentrazioni di plCSA di plCSA-DNPs.
- Calcolare l'efficienza di coniugazione usando la seguente equazione:
Efficienza di coniugazione = ((importo del peptide in nanoparticelle) / (quantità di aggiunta del peptide)) × 100%.
| Flaconcino | Volume di diluente (μL) | Volume e origine del peptide (μL) | Concentrazione finale del peptide (μg/mL) |
| A | 0 | 300 di Stock | 1000 |
| B | 250 | 250 di fiala una diluizione | 500 |
| C | 250 | 250 di diluizione flaconcino B | 250 |
| D | 250 | 250 di diluizione flacone C | 125 |
| E | 300 | 200 di diluizione fiala D | 50 |
| F | 250 | 250 di diluizione del flaconcino E | 25 |
| G | 400 | 100 di diluizione flaconcino F | 5 |
| H | 500 | 0 | 0 |
Tabella 1. Preparazione di peptidi Standard
5. fluorescenza microscopia valutazione dell'assorbimento di nanoparticelle plCSA-mirati in cellule di coriocarcinoma (JEG3)
- Le cellule sui 12 pozzetti sterili a 1.0 × 10 di semi4 cellule/pozzetto con completa DMEM/F12 (cDMEM/F12, contenente 1% penicillina/streptomicina e 10% siero bovino fetale (FBS)). Permettono alle cellule di crescere alla confluenza del 60% a 37 ° C e 5% di CO2 in condizioni umide.
- Rimuovere il supporto e aggiungere 1 mL di media freddo fresco con un contenuto basso del siero (5% FBS) e DNPs o plCSA-DNPs (5 µ g di equivalenti DOX).
- Incubare la miscela delle cellule e nanoparticelle a 4 ° C per 1 h.
- Dopo l'incubazione, rimuovere il supporto e lavare le cellule tre volte con PBS. Quindi, aggiungere 1 mL di fresco cDMEM/F12 e incubare le cellule a 37 ° C per 30 min.
- Rimuovere il cDMEM/F12 e lavare le cellule tre volte con PBS.
- Aggiungere 2 mL di freddo paraformaldeide al 4% (PFA) e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti per fissare le cellule.
- Rimuovere il PFA. Lavare le cellule con 2 mL di PBS una volta. Aggiungere 1 mL di PBS contenente DAPI (1 µ g/mL) per i nuclei di colorazione e incubare a temperatura ambiente per 10 min.
- Aspirare il PBS e lavare le cellule tre volte con PBS.
- Aggiungere liquido di montaggio e immagine della fluorescenza con un microscopio a fluorescenza, utilizzando canali verde e blu per visualizzare la DOX e nuclei, rispettivamente.
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Representative Results
In questo protocollo, PLGA, DSPE-PEG-COOH e soia lecitina sono un polimero rappresentativo, coniugato del lipido-PEG-COOH e lipidi, rispettivamente. La sintesi di nanoparticelle plCSA-mirati del lipido-polimero tramite un singolo passaggio sonicazione metodo e una tecnica EDC/NHS è illustrata nella Figura 1. In primo luogo, in condizioni di sonicazione, lecitina di soia, PLGA e DSPE-PEG-COOH si autoassemblano per formare nucleo-conchiglia strutturato DNPs. Il nucleo è costituito da PLGA e incapsulato DOX, il guscio è costituito da DSPE-PEG-COOH e il monostrato di lecitina di soia si trova nell'interfaccia della shell e il nucleo. Quindi, i gruppi - COOH esposti sulla superficie DNP sono stati coniugati con i gruppi di2 -NH della peptide tramite la tecnica EDC/NHS per sintetizzare plCSA-DNPs.
DNPs preparato in questo protocollo sono stati 82,3 ± 4.7 nm di diametro, e dopo coniugazione a plCSA-BP, il diametro della primaria DNPs aumentato a 109,3 ± 5,9 nm (Figura 2). Il PDI del DNPs e plCSA-DNPs era 0.127±0.005 e 0.134 ± 0.065, rispettivamente. Immagini TEM del DNPs e plCSA-DNPs hanno mostrato anche che le particelle erano ben dispersi ed hanno avuti generalmente sferiche morfologie (Figura 3). Il potenziale zeta del DNPs e plCSA-DNPs era -20,1 ± 1.32 mV e -29.9 mV ± 3,56, rispettivamente (tabella 2). Quindi, queste nanoparticelle sono prevedute per essere altamente stabile.
| Nanoparticelle | Diameter(Nm) | PDI | Potenziale Zeta (mV) |
| DNPs | 82.3±4.7 | 0.127±0.005 | -20.1±1.32 |
| plCSA-DNPs | 109.3±5.9 | 0.134±0.065 | -29.9±3.56 |
| Indice di PDI:polydispersity. I dati sono presentati media ± SD (n = 3). | |||
Tabella 2. Caratterizzazione di nanoparticelle
L'EE e LE nanoparticelle sono importanti per applicazioni cliniche. Il EE di DOX dal DNPs e plCSA-DNPs era 40,3 ± 1,67% e ± 39,5 1,94%, rispettivamente. Il LE di DOX nel DNPs e plCSA-DNPs era 6,2 ± 0,74% e 5.1 ± 0.42%, rispettivamente. Questi dati hanno mostrato che l'entità del carico di droga e droga incapsulamento è stato mantenuto dopo la decorazione plCSA-BP. L'efficienza di decorazione di plCSA-BP sulla superficie del DNPs è stata determinata dall'analisi della BCA (Figura 4). L'efficienza di coniugazione plCSA-BP è stato trovato per essere 45,5 ± 3,7%.
Il test di assorbimento cellulare JEG3 indicato che il plCSA-DNPs rapidamente associato a cellule JEG3 entro 30 min (Figura 5). Pertanto, plCSA-BP in modo efficiente è stato coniugato alla superficie di DNP in questo protocollo. Inoltre, plCSA-BP rapidamente potrebbero legarsi alle cellule JEG3 ed aumentare l'assorbimento cellulare delle nanoparticelle.
Figura 1. Illustrazione schematica del metodo utilizzato per sintetizzare plCSA-mirati del lipido-polimero nanoparticelle. In primo luogo, un metodo a passo singolo sonicazione è stato utilizzato per sintetizzare nanoparticelle lipidiche-polimero (DNPs), e quindi la tecnica EDC/NHS è stata utilizzata per coniugare peptidi alle superfici delle nanoparticelle (plCSA-DNPs). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. La distribuzione delle nanoparticelle diverse dimensione. Dimensioni idrodinamico di DNPs (A) e (B) misurata da DLS plCSA-DNPs. Figure rappresentative sono presentati per dimostrare la dimensione delle particelle e la distribuzione delle dimensioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Nanoparticella morfologia caratterizzata da TEM. Tipica immagine TEM di DNPs (A) e (B) osservato con 2% di colorazione acido fosfotungstico plCSA-DNPs. Barra della scala = 100 nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Misurazione dell'efficienza coniugazione usando l'analisi BCA. Curva standard dei peptidi a 562 nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5. L'assorbimento di nanoparticella dalle cellule JEG3. JEG3 cellule sono state analizzate mediante microscopia a fluorescenza dopo 30 min di incubazione con nanoparticelle diverse di 5 µ g/mL. Rosso: DOX, blu: DAPI-identificati i nuclei. Barra della scala = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo fornisce un metodo efficace e riproducibile per la sintesi di nanoparticelle plCSA-BP-coniugato del lipido-polimero. Il metodo di passo singolo sonicazione per preparare nanoparticelle lipidiche-polimero è veloce, riproducibile e diverso dai metodi di nanoprecipitazione tipici che coinvolgono riscaldamento, Vortex o evaporazione. Quindi, il metodo sviluppato riduce significativamente il tempo di sintesi. Inoltre, l'EDC/NHS bioconjugate utilizzato in questo protocollo è una tecnica comunemente usata e conveniente di coniugare peptidi e anticorpi alle nanoparticelle. Pertanto, la combinazione del metodo sonicazione passo singolo con la tecnica di bioconjugate EDC/NHS per sintetizzare plCSA-targeting del lipido-polimero nanoparticelle possono essere scalate per applicazioni cliniche.
Alcune procedure sono fondamentali per sintetizzare e caratterizzare plCSA-DNPs con successo. In primo luogo, le concentrazioni relative di lecitina, PLGA e DSPE-PEG-COOH determinano le dimensioni delle nanoparticelle lipidiche-polimero e polidispersità. Quando la concentrazione di lecitina è fissa, una maggiore concentrazione di risultati DSPE-PEG-COOH in polidispersità inferiore e una dimensione più piccola delle nanoparticelle,13,15 , che di conseguenza diminuisce la droga LE. Quando la concentrazione di PLGA è fissa, più DSPE-PEG-COOH è sostituito da lecitina, che porta a maggiore nanoparticella polidispersità e più grande nanoparticella dimensioni15. In questo caso, le nanoparticelle sono più instabili e aggregazione facilmente. In questo protocollo, il rapporto di peso DSPE-PEG-COOH/PLGA è 0.11, e il rapporto tra la massa lecitina/DSPE-PEG-COOH è 0,43. La dimensione di nanoparticelle lipidiche-polimero è circa 82 nm con un PDI di circa 0.127.
In secondo luogo, il pH della soluzione durante la coniugazione dei peptidi per le nanoparticelle è della massima importanza. Il pH ottimale di attivazione estere è 5.0-6.0, e la reazione di ammina è più efficiente a pH 7.2-7.519,28,29. Per risultati ottimali, la reazione deve essere eseguita in due fasi. In primo luogo, l'attivazione estere avviene in MES (o un altro noncarboxylate, buffer di nonamine) a pH 5.0-6.0. Quindi, il pH è regolato a 7.2-7.5 utilizzando PBS (o un altro nonamine buffer) immediatamente prima la reazione con la molecola di ammina-contenente19. Considerando che l'emivita di esteri NHS è 4-5 h a pH 7.019, la durata della reazione ammina supera 10 h a 4 ° C.
Il fattore critico finale è l'assorbimento delle nanoparticelle. L'assorbimento immaturi di DNPs dalle cellule JGE3 è stato eliminato in un'analisi di funzione dell'assorbimento mirato controllando il tempo di cultura e temperatura e la concentrazione di FBS nel mezzo. In questo protocollo, JEG3 cellule sono state incubate con 5% FBS a 4 ° C per 1 h e poi coltivate a 37 ° C per 30 min per ridurre al minimo l'assorbimento cellulare di DNP.
Se si verificano problemi durante la procedura, ci sono tre grandi fasi di risoluzione dei problemi relazionati alla sintesi e caratterizzazione di plCSA-DNPs. In primo luogo, le nanoparticelle lipidiche-polimero sono state preparate dall'auto-assemblaggio di PLGA e lecitina in condizioni di sonicazione. PLGA si scioglie solo in solvente organico. Quindi, con l'aggiunta di un solvente idrofilo, PLGA precipita rapidamente in piccole nanoparticelle. Per minimizzare l'effetto della velocità di aggiunta goccia a goccia e per evitare di generare le particelle più grandi, sonicazione della miscela per 1-2 minuti prima di aggiungere PLGA è necessario. In secondo luogo, anche se analisi quantitativa dell'efficienza coniugazione plCSA-BP utilizzando il metodo BCA è veloce e conveniente, un'analisi di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) è più accurata. I dettagli sperimentali di HPLC sono stati descritti dal nostro gruppo11 e altri30,31,32. Infine, le condizioni ottimali per l'assorbimento cellulare di plCSA-DNP possono differire per altre cellule cancerogene. Gradualmente diminuendo la concentrazione di FBS e aumentando il tempo di incubazione a 37 ° C può aiutare a determinare le condizioni ottimali.
Una limitazione del protocollo è che l'idrofobicità delle droghe determina l'EE dei farmaci. Rispetto ai farmaci idrofili, farmaci idrofobici hanno un'affinità più forte per PLGA, che si traduce in un aumento farmaco EE. In questi casi, le procedure per la sintesi di nanoparticelle plCSA-mirati del lipido-polimero dovrà essere esaminata sperimentalmente per determinare il metodo di sintesi più efficiente che provoca la droga ideale LE ed EE.
Come accennato in precedenza, il plCSA di glicosaminoglicani è espressa specificamente sulla maggior parte delle cellule tumorali e trofoblasto placentare. Quindi, è importante notare che i plCSA-PN dovrebbero essere usati per la somministrazione mirata di terapeutica di cellule tumorali non solo gravidi animali e gli esseri umani, e che queste droghe-caricato particelle porterebbe ad effetti collaterali nella placenta delle femmine gravide e esseri umani.
In sintesi, abbiamo descritto un metodo semplice e conveniente per sintetizzare nanoparticelle di targeting per plCSA del lipido-polimero. Il significato di questo protocollo è che aumenta la disponibilità di droga a tumori e la placenta, riducendo al minimo la tossicità concomitante. Questo approccio dovrebbe essere utile per la somministrazione mirata di farmaci di tumori e la placenta e può essere scalato per preparare nanoparticelle di targeting per plCSA del lipido-polimero per applicazioni cliniche in futuro.
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Disclosures
X.F. e B.Z. sono gli inventori il brevetto PCT/CN2017/108646 e 201710906587.6 inviato da SIAT che copre un metodo di sintesi di nanoparticelle plCSA-mirati e applicazione. Nessun potenziali conflitti di interesse sono stati divulgati dagli altri autori.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da nazionali chiave della ricerca e sviluppo programma della Cina (2016YFC1000402), la Fondazione nazionale di scienze naturali (81571445 e 81771617) e la Fondazione con scienze naturali della provincia di Guangdong (2016A030313178) per Il fondo di ricerca di Shenzhen Basic (JCYJ20170413165233512) a X.F. e X.F.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plCSA peptide | Shanghai GL Biochem | 573518 | for peptide synthesis |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical | 10009218 | for nanoparticles synthesis |
| Soybean lecithin | Avanti Polar Lipids | 441601 | for nanoparticles synthesis |
| DSPE-PEG-COOH | Avanti Polar Lipids | 880125 | for nanoparticles synthesis |
| Doxorubicin | JKChemical | 113424 | for nanoparticles synthesis |
| Acetonitrile | Shanghai Lingfeng | 1008621 | for nanoparticles synthesis |
| PLGA | Sigma-Aldrich | 719897 | for nanoparticles synthesis |
| Ultrasonic processor | Sonics | VCX130 | for nanoparticles synthesis |
| Centrifuge filter (MWCO 10 kDa) | Millipore | UFC801024 | for nanoparticles purification |
| centrifuge | Sigma | 3-18KS | for nanoparticles purification |
| 2-[morpholino]ethanesulfonic acid(MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | for peptide conjugation |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | 3450 | for peptide conjugation |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 56480 | for peptide conjugation |
| Dialysis bags | Spectrum | 132592T | for nanoparticles purification |
| PBS | Hyclone | SH30028.01 | for cell culture |
| 10 mL centrifuge tubes, polypropylene | Aladdin | S-025 | for nanoparticles synthesis |
| 15 mL centrifuge tubes, polypropylene | Corning | 430791 | for various applications |
| 0.22 μm sterile syringe filter | Millipore | SLGV033RB | for nanoparticles purification |
| 1 ml syringe, polypropylene | BD | 328421 | for nanoparticles synthesis |
| Malvern Zetasizer | Malvern | Nano ZS | for particle size analyer |
| Phosphotungstic acid | for TEM | ||
| TEM grid | EMCN | BZ10024a | for TEM |
| UV-VIS spectrometer | Leagene | DZ0035 | for TEM |
| Transmission electron microscope |
JEOL | JEM-100CXII | for particle size analyer |
| BCA reagent A | Thermo Fisher Scientific | 23228 | for BCA assay |
| BCA reagent B | Thermo Fisher Scientific | 23224 | for BCA assay |
| 96-Well Plates | Corning | 3599 | for BCA assay |
| Plate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan™ GO | for BCA assay |
| 12-well plates | Corning | 3513 | for cell culture |
| JEG3 cell | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | TCHu195 | Human placenta |
| DMEM/F12 | Hyclone | SH30272.01 | phenol red-free |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10100 | for cell culture |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO | 15070063 | for cell culture |
| Fluorescence microscope | OLYMPUS | CKK53 | for celluar uptake |
| Paraformaldehyde | Shanghai Lingfeng | 1372021 | for celluar uptake |
| DAPI | Sangon Biotech | A606584 | for celluar uptake |
| Mounting medium | Life | P36961 | for celluar uptake |
References
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