Summary
כאן, אנו מציגים את פרוטוקול לסינתזה של היפרדות כונדרויטין סולפט א איגוד פפטיד (plCSA-BP)-מצומדת השומנים-פולימר חלקיקים באמצעות צעד אחר צעד sonication bioconjugate וטכניקות. חלקיקים אלה מהווים כלי הרומן למסירה יישוב של הרפוי גידולים האנושי ביותר, היפרדות trophoblasts לטיפול סרטן והפרעות היפרדות.
Abstract
שיטה טיפולית יעילה לסרטן מפחית ומסלקת גידולים עם רעילות מינימלית מערכתית. חלקיקים באופן פעיל מיקוד מציעים גישה מבטיחה לטיפול בסרטן. גליקוזאמינוגליקן היפרדות כונדרויטין סולפט (plCSA) מתבטאת במגוון רחב של תאים סרטניים trophoblasts היפרדות, ואת מלריה חלבון ש-var2csa ניתן לאגד במיוחד plCSA. פפטיד מחייב דווח על היפרדות כונדרויטין סולפט A (plCSA-BP), נגזר מלריה חלבון VAR2CSA, באפשרותך לאגוד גם באופן ספציפי כדי plCSA על התאים הסרטניים, היפרדות trophoblasts. לפיכך, plCSA-BP-מצומדת חלקיקים יכול לשמש ככלי למשלוח שיגור תרופות סרטן אנושיים, היפרדות trophoblasts. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה לסנתז plCSA-BP-מצומדת השומנים-פולימר חלקיקים טעונים עם דוקסורוביצין (plCSA-DNPs); השיטה מורכבת צעד בודד sonication וטכניקות bioconjugate. בנוסף, מספר שיטות אפיון plCSA-DNPs, כולל החלטה physicochemical תכונותיהם ואת ספיגת התאית על ידי תאים choriocarcinoma היפרדות (JEG3), מתוארים.
Introduction
שיטה טיפולית יעילה לסרטן מפחית ומסלקת גידולים עם רעילות מינימלית מערכתית. ומכאן, גידול סלקטיבי המיקוד הוא המפתח לחקור שיטות טיפוליות מוצלחות. חלקיקים מציעים הזדמנות מבטיחה לטיפול בסרטן, הרכבות מולקולרית עם קבוצות פונקציונליות שונות לשפר את יעילות התרופה ולצמצם את תופעות לוואי המשויך1,2. יתר על כן, ננו-חלקיק מערכות לנצל בעיקר פסיביים ואקטיביים מיקוד כדי להגיע למטרה גידולים3.
פילוח פסיבי מנצלת את מאפייני מולדת של חלקיקים, חדירות משופרת ואפקטים השמירה (EPR) כדי להגיע תאים סרטניים. ליפוזומים cationic שימשו בהצלחה להעביר תרופות נגד סרטן שונים גידולים יישומים קליניים-4,-5,-6. למרות ההשפעה הפוטנציאלי טיפולית יעילה לסרטן, ריכוז נמוך סמים באזור הגידול ואת חוסר היכולת להבחין בין תאים סרטניים מרקמות נורמלי הן שתי מגבלות הגדולות של חלקיקים פסיבית פילוח7.
אסטרטגיות מיקוד פעיל את היתרון של אנטיגן-נוגדן, קולטן ליגנד אחרים ואינטראקציות הכרה מולקולרית במיוחד לספק סמים גידולים8. גליקוזאמינוגליקן היפרדות כונדרויטין סולפט (plCSA), מתבטאת בהרחבה על רוב התאים הסרטניים, היפרדות trophoblasts. יתר על כן, החלבון מלריה VAR2CSA יכול במיוחד לאגד9,plCSA10. לפיכך, VAR2CSA יכול להיות כלי מיקוד תאים סרטניים אנושיים. עם זאת, כאשר VAR2CSA היא מצומדת כדי חלקיקים, החלבון באורך מלא עלולה להגביל את חדירת חלקיקים לתוך תאים סרטניים. לאחרונה גילינו פפטיד איגוד plCSA (plCSA-BP), נגזר החלבון מלריה VAR2CSA. plCSA-BP-מצומדת השומנים-פולימר חלקיקים במהירות בונדד choriocarcinoma תאים, דוקסורוביצין ולעלייה משמעותית (DOX) פעילות נגד סרטן ויוו11; חלקיקים אלה גם באופן ספציפי בונדד כדי היפרדות trophoblasts, יכול לשמש כלי למסירה יישוב של סמים כדי שליה12.
השומנים-פולימר חלקיקים מורכבים של פגז טפט השומנים, גרעין הידרופובי פולימריים ולייצג נשא חדש עבור משלוח סמים. חלקיקים אלה לשלב את היתרונות של ליפוזומים, nanocarriers פולימריים, כגון גודל nanoparticle לשליטה, הביו גבוהה, שחרור התרופה מתמשכת, סמים גבוהה הטעינה יעילות (LE) יציבות מעולה13. בעבודה זו, השתמשנו בשיטה צעד אחר צעד sonication לסנתז השומנים-פולימר חלקיקים. שיטה זו מהירה, נוח ומתאים הסולם, כבר בשימוש נרחב כדי להכין השומנים-פולימר חלקיקים שלנו11,קבוצה14 ואחרים15,16,17,18 .
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide הידרוכלוריד (EDC) הוא carbodiimide הפופולרי משמש כסוכן crosslinking conjugating מולקולות המכילות אמינים, carboxylates19. בנוסף EDC, N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) היא הכימית ההטיה הנפוצה ביותר השטח, ננו-חלקיק ההטיה תגובות20,21. NHS באפשרותך להפחית את מספר ריאקציות צדדיות ולשפר את היציבות ואת התשואה של אסתר intermediates22,23.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור סינתזה השומנים-פולימר, ממוקדות plCSA חלקיקים. ראשית, מתואר הסינתזה sonication צעד אחר צעד של חלקיקים טעונים DOX שומנים בדם-פולימר (DNPs). לאחר מכן, הוא הציג טכניקה bioconjugate EDC/NHS ליצירת חלקיקים plCSA-BP-מצומדת השומנים-פולימר. טכניקה זו bioconjugate יכול לשמש גם כדי נזווג נוגדנים אחרים, פפטידים כדי חלקיקים. לבסוף, אנו מתארים וזמינותו המאפיינים ואת במבחנה physicochemical המשמש לאפיון חלקיקים, ממוקדות plCSA השומנים-פולימר. אנו מאמינים כי חלקיקים אלה השומנים-פולימר, ממוקדות plCSA עשויה להוות מערכת יעילה עבור המשלוח יישוב של תרופות סרטן אנושיים ביותר ואת משלוח יישוב דים לטיפול בהפרעות היפרדות השליה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת מלאי פתרונות
- הכן תמיסה מימית של 4% אתנול על ידי דילול 4 מ"ל אתנול מוחלטת עם 100 מ של מים הנדסה גנטית. לאחסן את הפתרון ב 4 º C.
הערה: הנדסה גנטית מים מוגדר מים ללא מזהמים כגון חיידקים, חלקיקים, יונים או nucleases. הנדסה גנטית מים היה המתקבלים מערכת טיהור מים עם resistivity היעד של 18.2 עד mΩ·cm, כלומר זיהום anionic נמוכה. - להכין 1 מ"ג/מ"ל לציטין סויה פתרון מניות על ידי המסת 20 מ ג של לציטין סויה ב- 20 מ של התמיסה המימית של 4% אתנול. חנות לציטין סויה פתרון מניות ב 4 º C.
- הכן 25 מ"ג/מ"ל DSPE-יתד (2000)-COOH מניות פתרון על ידי המסת 100 מ ג של DSPE-פג-COOH ב 4 מ"ל של התמיסה המימית של 4% אתנול. חנות הפתרון מניות ב-20 ° C.
- הכן 10 מ"ג/מ"ל DOX פתרון מניות על ידי המסת 50 מ"ג של DOX ב 5 מ ל מים הנדסה גנטית. אחסן את הפתרון DOX מניות ב 4 ° C בחושך.
- להכין 2 מ"ג/מ"ל פתרון מניות PLGA על ידי המסת 20 מ ג של PLGA ב- 10 מ"ל של acetonitrile. חנות הפתרון מניות PLGA ב 4 º C.
התראה: Acetonitrile הוא דליק, רעיל. לפעול בזהירות בשכונה fume, ללבוש ציוד אישי המתאים, כגון חלוקי מעבדה, בטיחות משקפיים, כפפות גומי. - להכין 0.1 M 2-(morpholino) ethanesulfonic חומצה (MES, pH 6.0) מניות פתרון על ידי המסת 2.17 גר' MES ב- 100 מ של מים הנדסה גנטית. חנות הפתרון מניות ב 4 º C.
2. סינתזה של DNPs
הערה: כדי למנוע השפלה פוטו אטמוספרי DOX, כל הפעולות בוצעו בחושך.
חלקיקים היו מסונתז על ידי13,1411,שיטת sonication צעד אחר צעד שדווחה בעבר.
- להוסיף 3 מ"ל של התמיסה המימית של 4% אתנול שפופרת צנטרפוגה סטרילי 10 מ"ל. לאחר מכן, להוסיף µg 90 של הפתרון מניות של לציטין סויה, µg 210 של הפתרון מניות DSPE-פג-COOH, µg 750 של הפתרון מניות DOX עד 3 מ"ל של התמיסה המימית של 4% אתנול.
- להכניס את הצינור צנטריפוגה בתוך אמבטיית קרח, ומניחים את אמבטיית קרח על מעבד אולטראסוניות.
- עם מזרק 1 מ"ל, פיפטה 2 מ"ג של הפתרון מניות PLGA dropwise (s טיפה/4-6 1) לתוך הצינור צנטריפוגה. בינתיים, sonicate את הצינורית באמצעות מעבד אולטראסוניות ב תדירות של 20 kHz והמרביים של פלט של 30% עבור 5 דקות כדי לסנתז את DNPs.
הערה: לסנתז חלקיקים אחיד בגדלים קטנים, המהירות שבה הפתרון PLGA שמטפטפים לתוך הצינור צריך להיות איטי, דור בועה להימנע. - לטהר את DNPs על ידי שטיפת הפתרון במאגר MES 0.1 M (pH 6.0) 3 פעמים באמצעות מסנן צנטריפוגה (MWCO, 10 kDa). צנטריפוגה ב 4 ° C ו- 1000 g × 3 דקות בכל פעם. לבסוף, כ 1 מ"ל של חלקיקים נפתרה-MES צריכים להישאר.
הערה: זה מהווה נקודת עצירה מקובלת במסגרת ההליך. אם לא נהגה נזווג פפטידים, חלקיקים יכולים להיטהר על ידי PBS מאגר (pH 7.4), DNPs מטוהרים ניתן לאחסן ב 4° C בחושך.
3. ההטיה של פפטידים כדי DNPs
-
אסתר הפעלה
- להוסיף 0.4 מ"ג EDC (ריכוז סופי 2 מ מ) עד 1 מ"ל של DNPs.
- להוסיף 0.24 מ"ג NHS התגובה (ריכוז סופי 2 מ מ).
הערה: עבור תוספת קלה של הכמות הנכונה של EDC, NHS, פתרון מניות עשוי להיות מוכן אם ריאגנטים הם התפרקה, שימוש באופן מיידי. - מערבבים את רכיבי התגובה היטב, ומניחים את התגובה על מטרף; אפשר תגובה במשך 30 דקות - 1 h בטמפרטורת החדר בחושך.
-
תגובה אמין
- להגדיל את מאגר ה-pH 7.2-7.5 באמצעות PBS (20 ×, pH 7.4).
- להוסיף 0.5 מ ג של פפטיד פילוח plCSA (plCSA-BP, EDVKDINFDTKEKFLAGCLIVSFHEGKC) הפתרון התגובה.
הערה: לפני חיבור, לפזר את פפטידים 20% acetonitrile. אם פפטידים אינם נמסים, sonication ב sonicator אמבטיה ייתכן מועיל. - מערבבים היטב את הפתרון, ולאחר מכן מקם על מטרף; לאפשר את התגובה להמשיך ב 4 ° C בלילה בחושך.
- במקום פתרון תרכיב לתוך שקיות הדיאליזה (MWCO, 3,500 Da) כדי dialyze ולטהר את plCSA-DNPs באמצעות מאגר PBS (pH 7.4) בטמפרטורת החדר במשך 24 שעות ביממה בחושך.
הערה: לחלופין, טיהור יכול להתבצע כמו שלב 2.4 כדי לקבל plCSA-DNPs. - ליישומים התרבות תאים, לסנן את הפתרון משוקם דרך מסנן סטרילי מזרק מיקרומטר 0.22 להסיר פוחת משקעים פוטנציאליים.
4. אפיון של השומנים, ממוקדות plCSA-חלקיקי הפולימר
-
מדידה של גודל ננו-חלקיק hydrodynamic באמצעות פיזור אור דינאמי (DLS)
- לדלל חלקיקים במים הנדסה גנטית (דילול 50-fold). טען µL 500 של המדגם cuvette על פי ההוראות של המכשיר פוטנציאליים DLS או זטא.
הערה: DLS וואקום ופוטנציאל זטה יכולים להיות שונים בהתבסס על המפרט של המכשיר. - בסיום המדידה, להקליט את החלקיקים קוטר, polydispersity אינדקס (PDI) ואת פוטנציאל זטה. ממוצע התוצאות המתקבלות מ- 4 קריאות חוזרות, לחשב את סטיית התקן.
- לדלל חלקיקים במים הנדסה גנטית (דילול 50-fold). טען µL 500 של המדגם cuvette על פי ההוראות של המכשיר פוטנציאליים DLS או זטא.
-
במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM)
הערה: המורפולוגיה של חלקיקים נצפתה על ידי TEM עם השיטה כתם שלילי. 24- לדלל חלקיקים במים הנדסה גנטית (דילול 400-fold). הוסף 20 µL של המדגם על גבי רשת TEM, מאפשרים לשבת במשך 5 דקות.
- להוסיף 100 µL של חומצה phosphotungstic 2% (w/v) ואפשר לשבת 2 דק הפתיל משם ה-droplet.
- יבש את הרשת TEM בטמפרטורת החדר.
- הגדר את מתח ההאצה TEM 80 kV, והגדילו את התמונה × 100,000 להמחיש חלקיקים.
-
נחישות ליעילות כימוס (EE) ולה
- דור עיקול רגיל. להמיס DOX במים הנדסה גנטית כדי להכין DOX פתרונות של חמש ריכוזים שונים: µg 1/mL, µg 5/mL, 10 µg/mL, µg 50/mL ו- 100 µg/mL. למדוד את הספיגה של הפתרונות DOX-480 ננומטר עם ספקטרומטר UV-VIS. ליצור עיקול רגיל המבוסס על ריכוז DOX.
- לדלל 25 µL של חלקיקים עם 500 µL של מים הנדסה גנטית. למדוד את הספיגה-480 ננומטר עם ספקטרומטר UV-VIS. לחשב את ריכוז התרופה לפי העקומה סטנדרטי.
- לחשב את LE באמצעות המשוואה הבאה:
LE = ((כמות של תרופות חלקיקים) / (סה כ משקל של חומרים)) × 100%. - לחשב את הנדסת חשמל באמצעות המשוואה הבאה:
הנדסת חשמל = ((כמות של תרופות חלקיקים) / (כמות נוסף סמים)) × 100%.
-
מדידת יעילות ההטיה באמצעות חומצה bicinchoninic (BCA) וזמינותו 25 , 26 , 27
- פיפטה 25 µL של פתרונות סטנדרטיים פפטיד (טבלה 1) או plCSA-DNPs לתוך בארות microplate כפילויות. להוסיף 200 µL מהתרכובת עבודה מכל קידוח, ומערבבים את הצלחת גם על צלחת מטרף ב-30 s.
- לכסות את הצלחת, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- למדוד את ספיגת במלון-562 ננומטר על קורא צלחת. השתמש העקומה תקן שנוצר כדי לחשב את ריכוזי plCSA plCSA-DNPs.
- לחשב את יעילות ההטיה באמצעות המשוואה הבאה:
יעילות ההטיה = ((כמות של פפטיד בחלקיקים) / (כמות נוסף פפטיד)) × 100%.
| בקבוקון | נפח של diluent (μL) | נפח ומקור פפטיד (μL) | ריכוז פפטיד הסופי (μg/mL) |
| A | 0 | 300 מניות | 1000 |
| B | 250 | 250 של המבחנה לדילול | 500 |
| C | 250 | 250 של דילול מבחנה B | 250 |
| D | 250 | 250 של דילול המבחנה C | 125 |
| E | 300 | 200 של המבחנה D דילול | 50 |
| F | 250 | 250 של דילול המבחנה E | 25 |
| G | 400 | 100 של דילול המבחנה F | 5 |
| H | 500 | 0 | 0 |
טבלה 1. הכנה של פפטידים סטנדרטי
5. קרינה פלואורסצנטית הערכה מיקרוסקופיה של ספיגת ננו-חלקיק, ממוקדות plCSA בתאים Choriocarcinoma (JEG3)
- זרע תאים על גבי לוחות 12-ובכן סטרילי 1.0 × 104 תאים/טוב עם DMEM מלאה/F12 (cDMEM/F12, המכיל 1% פניצילין/סטרפטומיצין ו-10% עוברית שור סרום (FBS)). מאפשרים לתאים לגדול 60% הנהרות-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 בתנאי לחות.
- להסיר את המדיה, ולהוסיף 1 מ"ל של מדיה טריים קרים עם תוכן בסרום נמוכה (5% FBS) ו DNPs או plCSA-DNPs (5 µg של DOX המקבילה).
- דגירה התערובת של חלקיקים ב 4 ° C עבור 1 h והתאים.
- לאחר דגירה, מסיר את המדיה, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS. לאחר מכן, הוסף 1 מ"ל של cDMEM טריים/F12, דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- להסיר את cDMEM/F12, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS.
- להוסיף 2 מ של 4% קר paraformaldehyde (PFA), דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות לתקן את התאים.
- הסר את כדורגלן. לשטוף את התאים עם 2 מ של PBS פעם אחת. להוסיף 1 מ"ל של PBS המכיל דאפי (1 µg/mL) עבור גרעינים מכתים, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
- האחות של PBS, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS.
- להוסיף הרכבה בינונית, תמונה של זריחה עם מיקרוסקופ זריחה, באמצעות ערוצי ירוק וכחול כדי להמחיש את DOX ואת הגרעינים, בהתאמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ב פרוטוקול זה, לציטין PLGA, DSPE-פג-COOH, סויה הן נציג פולימר, המספר המשלים השומנים-פג-COOH השומנים, בהתאמה. הסינתזה של חלקיקים השומנים-פולימר, ממוקדות plCSA ויה צעד אחר צעד sonication שיטה, טכניקה EDC/NHS מודגם באיור1. ראשית, בתנאים sonication, לציטין סויה, PLGA, DSPE-פג-COOH בעצמם טופס הליבה-פגז מובנים DNPs. הליבה מורכבת PLGA DOX שעברו אנקפסולציה, המעטפת מורכבת DSPE-פג-COOH, טפט לציטין סויה ממוקם על הממשק של הקליפה והליבה. לאחר מכן, הקבוצות - COOH נחשף על פני DNP היו מצומדת עם קבוצות2 -NH של פפטיד באמצעות הטכניקה EDC/NHS לסנתז plCSA-DNPs.
DNPs המבושלות פרוטוקול זה היו 82.3 nm ± 4.7 בקוטר, לאחר נטיה ל plCSA-BP, הקוטר של DNPs העיקרי עלה ל ± 5.9 109.3 nm (איור 2). PDI של DNPs ו- plCSA-DNPs היה 0.127±0.005 ו ± 0.134 0.065, בהתאמה. TEM תמונות של DNPs ו- plCSA-DNPs הראה גם כי חלקיקים פוזרו טוב, בדרך-כלל היו כדורי מורפולוגיות (איור 3). פוטנציאל זטה של DNPs ו- plCSA-DNPs היה-20.1 ± 1.32 mV ו-29.9 ± 3.56 mV, בהתאמה (טבלה 2). לפיכך, חלקיקים אלה צפויים להיות יציב מאוד.
| חלקיקים | Diameter(nm) | PDI | פוטנציאל זטה (mV) |
| DNPs | 82.3±4.7 | 0.127±0.005 | -20.1±1.32 |
| plCSA-DNPs | 109.3±5.9 | 0.134±0.065 | -29.9±3.56 |
| אינדקס PDI:polydispersity. הנתונים מוצגים זאת אומרת ± SD (n = 3). | |||
בטבלה 2. איפיון חלקיקים
הנדסת חשמל ו- LE של חלקיקים חשובים עבור יישומים קליניים. הנדסת חשמל של DOX על ידי DNPs ו plCSA-DNPs היה 40.3 ± 1.67% 39.5 ± 1.94%, בהתאמה. האותיות של DOX ב DNPs ו plCSA-DNPs היה 6.2 ± 0.74% 5.1 ± 0.42%, בהתאמה. נתונים אלה הראו כי היקף התרופה וטעינה של סמים כימוס נשמר לאחר קישוט plCSA-BP. היעילות קישוט של BP-plCSA על פני השטח של DNPs נקבע על ידי וזמינותו BCA (איור 4). יעילות ההטיה plCSA-BP נמצאה להיות 45.5 ± 3.7%.
וזמינותו ספיגת הסלולר JEG3 ציינו כי plCSA-DNPs במהירות קשורה JEG3 תאים בתוך 30 דקות (איור 5). לכן, plCSA-BP היה ביעילות מצומדת השטח DNP ב פרוטוקול זה. יתר על כן, plCSA-BP יכול במהירות לאגד JEG3 תאים, להגביר את ספיגת הסלולר של חלקיקים.
איור 1. איור סכמטי של השיטה לסנתז חלקיקים השומנים-פולימר, ממוקדות plCSA. ראשית, שיטה צעד אחר צעד sonication שימש לסנתז השומנים-פולימר חלקיקים (DNPs) ולאחר מכן הטכניקה EDC/NHS שימש נזווג פפטידים למשטחים ננו-חלקיק (plCSA-DNPs). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. גודל הפצה של חלקיקים שונים. גודל hydrodynamic DNPs (א) ו- (ב) נמדדת DLS plCSA-DNPs. דמויות נציג מוצגים כדי להדגים את גודל החלקיקים ואת התפלגות גודל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3. ננו-חלקיק מורפולוגיה מאופיין TEM. תמונת TEM אופייני של DNPs (א) ו- (ב) נצפתה עם 2% חומצה מכתים phosphotungstic plCSA-DNPs. סרגל קנה מידה = 100 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 4. מדידת יעילות ההטיה באמצעות וזמינותו BCA- עיקול רגיל פפטידים-562 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5. ספיגת ננו-חלקיק על ידי תאים JEG3. תאים JEG3 נותחו על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ לאחר 30 דקות של דגירה עם 5 חלקיקים שונים µg/mL. אדום: DOX, כחול: גרעינים התווית על-ידי דאפי. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מספק שיטה לשחזור ויעיל עבור סינתזה plCSA-BP-מצומדת השומנים-פולימר חלקיקים. בשיטת צעד אחר צעד sonication להכין את השומנים-פולימר חלקיקים הוא מהיר, הדירים שונה בשיטות nanoprecipitation טיפוסי כולל חימום, vortexing או אידוי. לפיכך, השיטה שפותחה מפחית באופן משמעותי את הזמן סינתזה. בנוסף, bioconjugate EDC/NHS בשימוש פרוטוקול זה היא טכניקה בשימוש נפוץ ונוח מאוד? משהו שנובח פפטידים, נוגדנים חלקיקים. לכן, השילוב של שיטת sonication צעד אחר צעד עם הטכניקה bioconjugate EDC/NHS לסנתז פילוח plCSA השומנים-פולימר חלקיקים וניתן לשנותם עבור יישומים קליניים.
תהליכים מסוימים הם קריטיים עבור סינתזה ואפיון plCSA-DNPs בהצלחה. ראשית, הריכוזים היחסיים של לציטין, PLGA ו- DSPE-פג-COOH לקבוע את גודל ננו-חלקיק השומנים-פולימר ואת polydispersity. כאשר הריכוז של הלציטין הוא קבוע, ריכוז גבוה יותר של DSPE-פג-COOH תוצאות ב polydispersity התחתון ואת גודל ננו-חלקיק קטן יותר,13,15 אשר כתוצאה מכך מפחית את התרופה LE. כאשר הריכוז של PLGA הוא קבוע, נוסף DSPE-פג-COOH מוחלף על ידי לציטין, המוביל polydispersity nanoparticle גבוה nanoparticle גדול גודל15. במצב זה, חלקיקים הם יותר לא יציב צבירה בקלות. ב פרוטוקול זה, היחס בין משקל DSPE-פג-COOH/PLGA 0.11, היחס המוני לציטין/DSPE-פג-COOH הוא 0.43. גודל ננו-חלקיק השומנים-פולימר הוא כ 82 nm עם PDI של 0.127.
שנית, רמת ה-pH של התמיסה במהלך הבניין של פפטידים אל חלקיקים הוא בעל חשיבות עליונה. רמת ה-pH האופטימלי של אסתר הפעלה 5.0-6.0, הינם התגובה amine היא היעילה ביותר ב- pH 7.2-7.519,28,29. לקבלת תוצאות מיטביות, התגובה צריכה להתבצע בשני שלבים. ראשית, הפעלת אסתר מתרחש MES (או noncarboxylate אחר, nonamine מאגר) pH 5.0-6.0. לאחר מכן, מכוון את ה-pH 7.2-7.5 באמצעות PBS (או עוד מאגר nonamine) מיד לפני התגובה עם מולקולת אמין המכיל19. בהתחשב בעובדה half-life של אסטרים NHS היא h 4-5 pH 7.019, משך התגובה amine חורג h 10-4 מעלות צלזיוס.
הגורם הקריטי הסופי הוא ספיגת ננו-חלקיק. ספיגת nontargeted של DNPs על ידי תאים JGE3 חוסל בניתוח פונקציה של תפיסה ממוקד על ידי שליטה הזמן תרבות ואת הטמפרטורה ריכוז FBS במדיום. ב פרוטוקול זה, תאים JEG3 היו מודגרות עם 5% FBS ב 4 מעלות צלזיוס למשך שעה ולאחר מכן בתרבית ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי למזער את ספיגת הסלולר DNP.
אם מתעוררות בעיות במהלך ההליך, ישנם שלושה שלבים לפתרון בעיות עיקריים הקשורים סינתזה אפיון של plCSA-DNPs. ראשית, השומנים-פולימר חלקיקים הוכנו על ידי הרכבה עצמית של PLGA, לציטין בתנאים sonication. PLGA מתמוסס רק ב הממס האורגני. לפיכך, על תוספת הממס הידרופיליות, PLGA ארגונייט שוקע במהירות חלקיקים קטנים. כדי לצמצם את ההשפעה של מהירות התוספת dropwise למנוע יצירת חלקיקים גדולים יותר, הכרחי sonication של תערובת למשך 1-2 דקות לפני הוספת PLGA. שנית, למרות ניתוח כמותי של יעילות ההטיה plCSA-BP בשיטת BCA הוא מהיר ונוח, וזמינותו ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) היא מדויקת יותר. הפרטים ניסיוני HPLC היה שתואר על ידי הקבוצה שלנו11 ועוד30,31,32. בסופו של דבר, התנאים אופטימליים עבור ספיגת הסלולר plCSA-DNP עשויים להיות שונים עבור תאים סרטניים אחרים. בהדרגה להקטין את הריכוז FBS, הגדלת זמן הדגירה ב 37 ° C עשוי לעזור לקבוע את התנאים אופטימליים.
מגבלה אחת של הפרוטוקול היא כי hydrophobicity של סמים קובע את EE של התרופות. לעומת הידרופילית סמים, סמים הידרופובי יש יש זיקה חזקה עבור PLGA, כשהתוצאה היא תרופה מוגברת הנדסת חשמל. במקרים אלה, ההליכים לסינתזה של חלקיקים, ממוקדות plCSA השומנים-פולימר יהיה חייב להיבדק השפעול כדי לקבוע את שיטת סינתזה היעיל שמביאה התרופה האידיאלית LE ו הנדסת חשמל.
כפי שהוזכר לעיל, plCSA גליקוזאמינוגליקן מתבטאת במיוחד על רוב התאים הסרטניים, היפרדות trophoblasts. לפיכך, חשוב לציין כי יש להשתמש plCSA-NPs למסירה יישוב של הרפוי תאים סרטניים nonpregnant רק בבעלי חיים ובבני אדם, כי אלה חלקיקים טעונים סמים יוביל תופעות לוואי את השליה של חיות בהריון ו בני אדם.
לסיכום, תארנו שיטה פשוטה ונוחה לסנתז השומנים-פולימר, ממוקדות plCSA חלקיקים. המשמעות של פרוטוקול זה הוא כי היא מגבירה את הזמינות סמים-גידולים, השליה, תוך מזעור רעילות והמצוות. גישה זו צריכה להיות שימושית עבור משלוח ממוקד של סמים גידולים, השליה, עשוי להיות יורה כדי להתכונן השומנים-פולימר, ממוקדות plCSA חלקיקים יישומים קליניים בעתיד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
X.f. ב עורכים: ב"צ הממציאים על הפטנטים PCT/CN2017/108646, 201710906587.6 נאספו האירוע מתקיים שמכסה על שיטת סינתזה nanoparticle ממוקדות plCSA ויישום בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. אין פוטנציאל ניגודי עניינים פורסמו על ידי המחברים האחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המחקר מפתח הלאומי, תוכנית פיתוח של סין (2016YFC1000402), הקרן מדעי הטבע הלאומית (81571445 ו- 81771617), את מדעי הטבע קרן של בפרובינצית גואנג-דונג (2016A030313178) כדי X.f. ב, קרן מחקר בסיסי שנג'ן (JCYJ20170413165233512) כדי x.f. ב
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plCSA peptide | Shanghai GL Biochem | 573518 | for peptide synthesis |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical | 10009218 | for nanoparticles synthesis |
| Soybean lecithin | Avanti Polar Lipids | 441601 | for nanoparticles synthesis |
| DSPE-PEG-COOH | Avanti Polar Lipids | 880125 | for nanoparticles synthesis |
| Doxorubicin | JKChemical | 113424 | for nanoparticles synthesis |
| Acetonitrile | Shanghai Lingfeng | 1008621 | for nanoparticles synthesis |
| PLGA | Sigma-Aldrich | 719897 | for nanoparticles synthesis |
| Ultrasonic processor | Sonics | VCX130 | for nanoparticles synthesis |
| Centrifuge filter (MWCO 10 kDa) | Millipore | UFC801024 | for nanoparticles purification |
| centrifuge | Sigma | 3-18KS | for nanoparticles purification |
| 2-[morpholino]ethanesulfonic acid(MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | for peptide conjugation |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | 3450 | for peptide conjugation |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 56480 | for peptide conjugation |
| Dialysis bags | Spectrum | 132592T | for nanoparticles purification |
| PBS | Hyclone | SH30028.01 | for cell culture |
| 10 mL centrifuge tubes, polypropylene | Aladdin | S-025 | for nanoparticles synthesis |
| 15 mL centrifuge tubes, polypropylene | Corning | 430791 | for various applications |
| 0.22 μm sterile syringe filter | Millipore | SLGV033RB | for nanoparticles purification |
| 1 ml syringe, polypropylene | BD | 328421 | for nanoparticles synthesis |
| Malvern Zetasizer | Malvern | Nano ZS | for particle size analyer |
| Phosphotungstic acid | for TEM | ||
| TEM grid | EMCN | BZ10024a | for TEM |
| UV-VIS spectrometer | Leagene | DZ0035 | for TEM |
| Transmission electron microscope |
JEOL | JEM-100CXII | for particle size analyer |
| BCA reagent A | Thermo Fisher Scientific | 23228 | for BCA assay |
| BCA reagent B | Thermo Fisher Scientific | 23224 | for BCA assay |
| 96-Well Plates | Corning | 3599 | for BCA assay |
| Plate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan™ GO | for BCA assay |
| 12-well plates | Corning | 3513 | for cell culture |
| JEG3 cell | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | TCHu195 | Human placenta |
| DMEM/F12 | Hyclone | SH30272.01 | phenol red-free |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10100 | for cell culture |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO | 15070063 | for cell culture |
| Fluorescence microscope | OLYMPUS | CKK53 | for celluar uptake |
| Paraformaldehyde | Shanghai Lingfeng | 1372021 | for celluar uptake |
| DAPI | Sangon Biotech | A606584 | for celluar uptake |
| Mounting medium | Life | P36961 | for celluar uptake |
References
- Davis, M. E., Shin, D. M. Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (9), 771 (2008).
- Nie, S., Xing, Y., Kim, G. J., Simons, J. W. Nanotechnology applications in cancer. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 257-288 (2007).
- Jabir, N. R., et al. An overview on the current status of cancer nanomedicines. Current Medical Research and Opinion. 34 (5), 911-921 (2018).
- Pillai, G. Nanomedicines for Cancer Therapy: An Update of FDA Approved and Those under Various Stages of Development. SOJ Pharmacy & Pharmaceutical Sciences. 1 (2), 1-13 (2014).
- Marta, T., Luca, S., Serena, M., Luisa, F., Fabio, C. What is the role of nanotechnology in diagnosis and treatment of metastatic breast cancer? Promising Scenarios for the Near Future. Journal of Nanomaterials. 2016, e5436458 (2016).
- Dasari, S., Tchounwou, P. B. Cisplatin in cancer therapy: molecular mechanisms of action. European journal of Pharmacology. 740, 364-378 (2014).
- Brigger, I., Dubernet, C., Couvreur, P. Nanoparticles in cancer therapy and diagnosis. Advanced Drug Delivery Reviews. 64, 24-36 (2012).
- Steichen, S. D., Caldorera-Moore, M., Peppas, N. A. A review of current nanoparticle and targeting moieties for the delivery of cancer therapeutics. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 48 (3), 416-427 (2013).
- Salanti, A., et al. Targeting human cancer by a glycosaminoglycan binding malaria protein. Cancer Cell. 28 (4), 500-514 (2015).
- Seiler, R., et al. An Oncofetal Glycosaminoglycan Modification Provides Therapeutic Access to Cisplatin-resistant Bladder Cancer. European Urology. 72 (1), 142-150 (2017).
- Zhang, B., et al. Targeted delivery of doxorubicin by CSA-binding nanoparticles for choriocarcinoma treatment. Drug Delivery. 25 (1), 461-471 (2018).
- Zhang, B., et al. Placenta-specific drug delivery by trophoblast-targeted nanoparticles in mice. Theranostics. 26 (2), 130-137 (2018).
- Zhang, L., et al. Self-assembled lipid--polymer hybrid nanoparticles: a robust drug delivery platform. ACS Nano. 2 (8), 1696-1702 (2008).
- Zheng, M., et al. Single-step assembly of DOX/ICG loaded lipid-polymer nanoparticles for highly effective chemo-photothermal combination therapy. ACS. 7 (3), 2056-2067 (2013).
- Fang, R. H., Aryal, S., Hu, C. -M. J., Zhang, L. Quick synthesis of lipid− polymer hybrid nanoparticles with low polydispersity using a single-step sonication method. Langmuir. 26 (22), 16958-16962 (2010).
- Gu, L., et al. Folate-modified, indocyanine green-loaded lipid-polymer hybrid nanoparticles for targeted delivery of cisplatin. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 28 (7), 690-702 (2017).
- Mandal, B., Mittal, N. K., Balabathula, P., Thoma, L. A., Wood, G. C. Development and in vitro evaluation of core-shell type lipid-polymer hybrid nanoparticles for the delivery of erlotinib in non-small cell lung cancer. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 81, 162-171 (2016).
- Shi, T., et al. Enhanced legumain-recognition and NIR controlled released of cisplatin-indocyanine nanosphere against gastric carcinoma. European Journal of Pharmacology. 794, 184-192 (2017).
- Grabarek, Z., Gergely, J. Zero-length crosslinking procedure with the use of active esters. Analytical Biochemistry. 185 (1), 131-135 (1990).
- Hadjipanayis, C. G., et al. EGFRvIII Antibody-Conjugated Iron Oxide Nanoparticles for Magnetic Resonance Imaging-Guided Convection-Enhanced Delivery and Targeted Therapy of Glioblastoma. Cancer Research. 70 (15), 6303-6312 (2010).
- Sadhukha, T., Wiedmann, T. S., Panyam, J. Inhalable magnetic nanoparticles for targeted hyperthermia in lung cancer therapy. Biomaterials. 34 (21), 5163-5171 (2013).
- Jennings, M., Nicknish, J. Localization of a site of intermolecular cross-linking in human red blood cell band 3 protein. Journal of Biological Chemistry. 260 (9), 5472-5479 (1985).
- Staros, J. V. N-hydroxysulfosuccinimide active esters: bis(N-hydroxysulfosuccinimide) esters of two dicarboxylic acids are hydrophilic, membrane-impermeant, protein cross-linkers. Biochemistry. 21 (17), 3950-3955 (1982).
- Valencia, P. M., et al. Single-step assembly of homogenous lipid− polymeric and lipid− quantum dot nanoparticles enabled by microfluidic rapid mixing. ACS. 4 (3), 1671-1679 (2010).
- Altintas, I., et al. Nanobody-albumin nanoparticles (NANAPs) for the delivery of a multikinase inhibitor 17864 to EGFR overexpressing tumor cells. Journal of Controlled Release. 165 (2), 110-118 (2013).
- Maya, S., et al. Cetuximab conjugated O-carboxymethyl chitosan nanoparticles for targeting EGFR overexpressing cancer cells. Carbohydrate Polymers. 93 (2), 661-669 (2013).
- Deepagan, V. G., et al. In vitro targeted imaging and delivery of camptothecin using cetuximab-conjugated multifunctional PLGA-ZnS nanoparticles. Nanomedicine. 7 (4), 507-519 (2012).
- Totaro, K. A., et al. Systematic investigation of EDC/sNHS-mediated bioconjugation reactions for carboxylated peptide substrates. Bioconjugate Chemistry. 27 (4), 994-1004 (2016).
- Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions. Mass Spectrometry Reviews. 25 (4), 663-682 (2006).
- Zhang, B., et al. LDLR-mediated peptide-22-conjugated nanoparticles for dual-targeting therapy of brain glioma. Biomaterials. 34 (36), 9171-9182 (2013).
- Koren, E., Apte, A., Sawant, R. R., Grunwald, J., Torchilin, V. P. Cell-penetrating TAT peptide in drug delivery systems: proteolytic stability requirements. Drug Delivery. 18 (5), 377-384 (2011).
- Chu, Y., et al. Topical ocular delivery to laser-induced choroidal neovascularization by dual internalizing RGD and TAT peptide-modified nanoparticles. International Journal of Nanomedicine. 12, 1353-1368 (2017).
