Summary
Здесь мы представляем собой протокол для синтеза плацентарной хондроитин сульфат A привязки пептида (plCSA-BP)-конъюгированных липидов полимер наночастиц через единый этапа sonication и биоконъюгатов методов. Эти частицы являются роман инструмент для доставки целевых терапевтических средств большинство человеческих опухолей и плацентарной трофобласты для лечения рака и плацентарной расстройств.
Abstract
Лечебный метод эффективного рака уменьшает и устраняет опухоли с минимальными системной токсичности. Активно таргетинга наночастиц предлагают перспективный подход к терапии рака. Глюкозаминогликан плацентарной хондроитин сульфат (plCSA) выражается на широкий спектр раковых клеток и плаценты трофобласты и малярийные белка, который VAR2CSA конкретно можно привязать к plCSA. Также специально сообщил плацентарной хондроитин сульфат A привязки пептида (plCSA-BP), производные от малярии белка VAR2CSA, можно привязать к plCSA на раковые клетки и плацентарной трофобласты. Таким образом plCSA ВР конъюгированных наночастиц могут использоваться как инструмент для доставки целевых наркотиков человека раковые заболевания и плацентарной трофобласты. В этом протоколе мы описываем метод синтеза наночастиц plCSA BP-конъюгированных липидов полимер, загружен с доксорубицином (plCSA-DNPs); Этот метод состоит из одного sonication шаг и биоконъюгатов методов. Кроме того несколько методов для квалификации plCSA-DNPs, включая определение их физико-химических свойств и клеточного поглощения клетками плаценты хориокарцинома (JEG3), описаны.
Introduction
Лечебный метод эффективного рака уменьшает и устраняет опухоли с минимальными системной токсичности. Следовательно ориентация избирательного опухоли является ключом к изучению успешных терапевтические методы. Наночастицы предлагает многообещающие возможности для лечения рака, и повысит эффективность препарата и снизить связанные побочные эффекты1,2молекулярной сборки с различными функциональными группами. Кроме того наночастиц системы главным образом используют, пассивной и активной ориентации для достижения цели опухоли3.
Пассивной ориентации эксплуатирует врожденные характеристики наночастиц и повышение проницаемости и удержания (EPR) эффекты для достижения опухолевых клеток. Катионный липосомы успешно использовался для доставки различные противораковые препараты опухоли в клинических приложений4,5,6. Несмотря на потенциал эффективного рака терапевтический эффект концентрация низкая наркотиков в регионе опухоли и неспособность отличить опухолевых клеток от нормальных тканей являются два основных ограничения ориентации пассивного наночастиц7.
Активной ориентации стратегий воспользоваться антиген антитела, лиганд рецептор и другие взаимодействия молекулярного распознавания специально доставить опухоли8препаратов. Глюкозаминогликан плацентарной хондроитин сульфат (plCSA) широко выражается на большинство раковых клеток и плаценты трофобласты. Кроме того малярийные белка VAR2CSA можно конкретно связать plCSA9,10. Таким образом VAR2CSA может быть инструментом для ориентации человеческих раковых клеток. Однако когда VAR2CSA конъюгированных с наночастицами, полнометражные белка может ограничить проникновение наночастиц в опухолевые клетки. Недавно мы обнаружили plCSA пептид привязки (plCSA-BP), производные от малярии белка VAR2CSA. plCSA ВР конъюгированных липидов полимер наночастиц быстро тычковой хориокарцинома клетки и значительно увеличили доксорубицин (DOX) противоопухолевую активность в vivo11; Эти частицы также конкретно связан с плацентарной трофобласты и может служить инструментом для целенаправленной доставки препаратов плаценты12.
Липидов полимер наночастицы состоят из липидной оболочки монослоя и гидрофобных полимерных ядро и представляют новый носитель для доставки лекарств. Эти наночастицы сочетают в себе преимущества липосомы и полимерных nanocarriers, таких как размер управляемой наночастиц, высокой биосовместимостью, устойчивый наркотиков релиз, эффективность загрузки высокий препарата (LE) и отличную стабильность13. В этой работе мы использовали sonication одношаговый метод для синтеза липидов полимер наночастиц. Этот метод быстро, удобно и подходит для масштабирования и широко использовался подготовить липидов полимер наночастиц нашей группы11,14 и другие15,16,17,18 .
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) Карбодиимиды гидрохлорид (EDC) является популярным Карбодиимиды, используется в качестве агента сшивки для спрягать биомолекул, содержащие амины и карбоксилатов19. В дополнение к EDC N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) является наиболее распространенным спряжение реагента в поверхность и наночастиц спряжение реакции20,21. NHS может уменьшить количество побочных реакций и укреплению стабильности и доходности эфира промежуточные22,23.
Здесь мы описываем протокол для синтеза наночастиц plCSA ориентированные липидов полимер. Во-первых описан пошагово sonication синтеза наночастиц DOX-загружен липидов полимера (DNPs). Затем вводится методом биоконъюгатов EDC/NHS для генерации plCSA BP-конъюгированных липидов полимер наночастиц. Эта техника биоконъюгатов может также использоваться для конъюгата других антител и пептиды наночастиц. Наконец мы описываем физико-химических свойств и в пробирке assay, используемые для характеристики plCSA ориентированные липидов полимер наночастиц. Мы считаем, что эти наночастицы целевых plCSA липидов полимер может стать эффективной системы для целенаправленной доставки лекарств для большинства человеческих раков и целенаправленной доставки полезной нагрузки плаценты для лечения плацентарной расстройств.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. подготовка запасов решений
- Подготовьте путем разбавления 4 мл 100 мл ультрачистая вода абсолютного этанола водный раствор 4% этанола. Хранят раствор при 4 ° C.
Примечание: Ультрачистая вода определяется как вода без загрязнения, такие как бактерии, твердых частиц, ионы или nucleases. Ультрачистая вода была получена из системы очистки воды с целевой сопротивление до 18,2 mΩ·cm, что означает низкий анионные загрязнения. - Подготовьте раствор лецитина сои 1 мг/мл, растворяя 20 мг, лецитина сои в 20 мл водный раствор 4% этанола. Магазине соевого лецитина Стоковый раствор при 4 ° C.
- Подготовьте DSPE-ПЭГ (2000)-COOH Стоковый раствор 25 мг/мл, растворяя 100 мг DSPE-PEG-COOH в 4 мл водный раствор 4% этанола. Хранят раствор при температуре-20 ° C.
- Подготовка 10 мг/мл DOX Стоковый раствор путем растворения DOX 50 мг в 5 мл ультрачистая вода. Храните DOX Стоковый раствор при температуре 4 ° C в темноте.
- Готовить 2 мг/мл PLGA Стоковый раствор путем растворения 20 мг в 10 мл Ацетонитрил PLGA. Магазин PLGA Стоковый раствор при 4 ° C.
Предупреждение: Ацетонитрил горючих и токсичных. Действовать с осторожностью в вытяжного шкафа и носить соответствующие индивидуальной, например лаборатории пальто, защитные очки и перчатки. - Подготовьте 0,1 М 2-(morpholino) ethanesulfonic кислоты (MES, pH 6.0) раствор, растворяя 2,17 g в 100 мл воды сверхчистого МЧС. Хранят раствор при 4 ° C.
2. синтез DNPs
Примечание: Чтобы избежать DOX фотохимического полураспада, все операции проводились в темноте.
Наночастицы синтезированы sonication сообщалось ранее одношаговый метод11,13,14.
- Добавьте 3 мл водного раствора 4% этанола в стерильные 10 мл пластиковых пробирок. Затем добавьте 90 мкг Стоковый раствор лецитина сои, 210 µg DSPE-PEG-COOH Стоковый раствор и 750 мкг DOX Стоковый раствор 3 мл водного раствора 4% этанола.
- Место пластиковых пробирок в ванной на льду и поместите ледяной ванне на процессоре ультразвуковой.
- С 1 мл шприц Пипетка 2 мг PLGA каплям раствор (1 капля/4-6 s) в пластиковых пробирок. Тем временем sonicate трубки, с использованием ультразвуковой процессор на частоте 20 кГц и амплитуда выходного 30% на 5 мин синтезировать DNPs.
Примечание: Синтезировать форма частиц с небольшими размерами, скорость, на которой решение PLGA капала в трубку должен быть медленным, и пузырь поколения следует избегать. - Очищать DNPs путем мытья выше решение в 0,1 М MES буфере (рН 6,0) 3 раза с помощью центрифуги фильтра (MWCO, 10 кДа). Центрифуга на 4 ° C и g 1000 × 3 мин каждый раз. Наконец должен оставаться примерно в 1 мл наночастиц MES-решена.
Примечание: Это приемлемым остановочный пункт в процедуре. Если не используется для конъюгата пептиды, наночастицы могут быть очищены, PBS буфере (рН 7,4) и очищенного DNPs могут храниться при температуре 4° C в темноте.
3. спряжение пептидов DNPs
-
Эстер активации
- Добавить 0,4 мг EDC (конечная концентрация 2 мм) по 1 мл DNPs.
- Добавить 0.24 мг ГСЗ в реакции (конечная концентрация 2 мм).
Примечание: Для легко добавлять необходимое количество EDC и NHS, Стоковый раствор может быть готовы если реагентов растворяются и использованы немедленно. - Хорошо перемешайте компоненты реакции и место реакции на шейкер; разрешить реакции на 30 мин - 1 ч при комнатной температуре в темноте.
-
Реакция аминов
- Увеличение pH буфера до 7,2-7,5 с помощью PBS (20 ×, рН 7,4).
- Решение реакции, добавьте 0,5 мг plCSA таргетинг пептида (plCSA-BP, EDVKDINFDTKEKFLAGCLIVSFHEGKC).
Примечание: Перед добавлением, Растворите пептидов в ацетонитриле 20%. Если не растворимые пептидов, sonication в sonicator ванна может полезно. - Хорошо перемешать раствор, а затем поместить на шейкер; разрешить реакции перейти на 4 ° C на ночь в темноте.
- Поместите раствор конъюгата в мешки диализа (MWCO, 3500 да), чтобы dialyze и очистить plCSA-DNPs с использованием буфера PBS (рН 7,4) при комнатной температуре на 24 часа в темноте.
Примечание: в качестве альтернативы, очистка может быть выполнена как шаг 2.4 для получения plCSA-DNPs. - Для приложений, культуры клеток фильтр восстановленный решение через фильтр 0,22 мкм стерильный шприц для удаления потенциальных осадков.
4. характеристика целевых plCSA липидов-полимер наночастиц
-
Измерение размера гидродинамических наночастиц с помощью динамического рассеяния света (DLS)
- Разбавьте наночастиц с ультрачистая вода (производится разведение). Загрузите 500 мкл пример в кювет согласно инструкциям DLS или Зета потенциального инструмента.
Примечание: Зета потенциал и DLS кюветы можно различаются в зависимости от спецификации инструмента. - После завершения измерения, записи диаметр частиц, полиизопрена индекс (ДПИ) и Зета потенциал. Средние результаты, полученные от 4 повторил чтений и вычислить стандартное отклонение.
- Разбавьте наночастиц с ультрачистая вода (производится разведение). Загрузите 500 мкл пример в кювет согласно инструкциям DLS или Зета потенциального инструмента.
-
Просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА)
Примечание: Морфология наночастиц наблюдалось ТЕА с методом негативные пятно. 24- Разбавьте наночастиц с ультрачистая вода (400-fold разрежения). 20 мкл пример на сетку ТЕА и позволить сидеть в течение 5 мин.
- 100 мкл фосфорвольфрамовой кислоты 2% (w/v) и позволить сидеть в течение 2 мин фитиль от капли.
- Сухие сетке ТЕА при комнатной температуре.
- Установите напряжение ускорение ТЕА на 80 кв и увеличить изображение до 100 000 × визуализировать наночастиц.
-
Определение эффективности инкапсуляции (EE) и LE
- Поколение калибровочной кривой. Распустить DOX в ультрачистая вода для приготовления растворов DOX пяти различных концентраций: 1 мкг/мл, 5 мкг/мл, 10 мкг/мл, 50 мкг/мл и 100 мкг/мл. Измерение поглощения DOX решений на 480 Нм с UV-VIS спектрометр. Создание стандартной кривой, основанный на концентрации DOX.
- Разбавьте 25 мкл наночастиц с 500 мкл ультрачистая вода. Измерение поглощения на 480 Нм с UV-VIS спектрометр. Рассчитайте концентрации наркотиков по калибровочной кривой.
- Вычислите LE, используя следующее уравнение:
LE = ((количество наркотиков в наночастиц) / (общий вес материалов)) × 100%. - Вычислите EE, используя следующее уравнение:
EE = ((количество наркотиков в наночастиц) / (сумма добавляется наркотиков)) × 100%.
-
Измерение эффективности спряжение, используя assay кислоты (BCA) bicinchoninic 25 , 26 , 27
- Пипетка 25 мкл решения стандартных пептида (Таблица 1) или plCSA-DNPs в Гонав скважины в двух экземплярах. Добавить 200 мкл рабочего реагента для каждой скважины и смешивать пластины на пластину шейкер для 30 s.
- Крышка и инкубировать при 37 ° C за 30 мин.
- Измерение оптической плотности в 562 Нм на тарелку читателя. Используйте созданный калибровочной кривой для расчета концентрации plCSA plCSA-DNPs.
- Расчет эффективности спряжение, используя следующее уравнение:
Спряжение эффективность = ((количество пептида в наночастиц) / (сумма добавляется пептида)) × 100%.
| Во флаконе | Объем разбавителя (мкл) | Объем и источник пептида (мкл) | Концентрация окончательный пептида (мкг/мл) |
| A | 0 | 300 акций | 1000 |
| B | 250 | 250 флакон разрежения | 500 |
| C | 250 | 250 флакон B разрежения | 250 |
| D | 250 | 250 флакон C разбавления | 125 |
| E | 300 | 200 из флакона D разбавление | 50 |
| F | 250 | 250 флакон E разбавления | 25 |
| G | 400 | 100 из флакона F разрежения | 5 |
| H | 500 | 0 | 0 |
Таблица 1. Подготовка стандартных пептиды
5. Люминесцентная микроскопия оценки plCSA ориентированных наночастиц поглощения в клетках хориокарцинома (JEG3)
- Заполнение ячеек на стерильных пластин 12-ну 1.0 × 104 клетки/колодец с полным DMEM/F12 (cDMEM/F12, содержащей 1% пенициллина/стрептомицина и 10% плода бычьим сывороточным (ФБС)). Позволяют клеткам расти до 60% слияния при 37 ° C и 5% CO2 влажных условиях.
- Удалите средства массовой информации и добавить 1 мл холодного свежего СМИ с низким сыворотка содержимое (5% FBS) и DNPs или plCSA-DNPs (5 мкг DOX эквивалента).
- Инкубируйте смесь клеток и наночастиц на 4 ° C на 1 час.
- После инкубации удалите средства массовой информации и вымыть клетки три раза с PBS. Затем добавьте 1 mL свежих cDMEM/F12 и инкубации клеток при 37 ° C за 30 мин.
- Удалите cDMEM/F12 и вымыть клетки три раза с PBS.
- Добавить 2 мл холодного параформальдегида 4% (PFA) и инкубации при комнатной температуре 15 мин исправить клетки.
- Удаление PFA. Один раз мыть ячейки с 2 мл ФСБ. Добавьте 1 mL PBS, содержащих DAPI (1 мкг/мл) для окрашивания, ядер и инкубации при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Аспирационная PBS и вымыть клетки три раза с PBS.
- Добавление монтажа средних и изображение флуоресценции с флуоресцентной микроскопии, используя зеленого и синего каналов для визуализации DOX и ядер, соответственно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В настоящем Протоколе PLGA, DSPE-PEG-СООН и соевого лецитина являются представитель полимер, липидов PEG-COOH конъюгата и липидов, соответственно. Синтез наночастиц plCSA ориентированные липидов полимер через единый этапа sonication метода и EDC/NHS техника иллюстрируется на рисунке 1. Во-первых в условиях sonication, соевый лецитин, PLGA и DSPE-PEG-COOH самостоятельно собрать формы ядро оболочка структурированных DNPs. Ядро состоит из PLGA и инкапсулированные DOX, оболочка состоит из DSPE-PEG-COOH, и монослоя лецитин сои расположен на стыке корпуса и ядро. Затем группы - COOH, котор подвергли действию на поверхности ДНП были конъюгированных с группами2 -NH пептид через EDC/NHS техника синтезировать plCSA-DNPs.
DNPs, подготовленные в этом протоколе были 82.3 Нм ± 4,7 в диаметре, и после сопряжения для plCSA-BP, диаметр первичного DNPs увеличено до 109,3 ± 5,9 Нм (рис. 2). PDI DNPs и plCSA-DNPs был 0.127±0.005 и 0.134 ± 0,065, соответственно. ТЕА изображения DNPs и plCSA-DNPs также показали, что частицы были хорошо рассеяны и вообще имел сферическую морфологии (рис. 3). Зета потенциал DNPs и plCSA-DNPs был-20.1 ± 1,32 МВ и-29.9 МВ ± 3.56, соответственно (Таблица 2). Следовательно эти наночастицы прогнозируется весьма стабильными.
| Наночастицы | Diameter(NM) | PDI | Дзета потенциальных (mV) |
| DNPs | 82.3±4.7 | 0.127±0.005 | -20.1±1.32 |
| plCSA-DNPs | 109.3±5.9 | 0.134±0.065 | -29.9±3.56 |
| Индекс PDI:polydispersity. Данные представлены среднего SD ± (n = 3). | |||
Таблица 2. Характеристика наночастиц
EE и LE наночастиц важны для клинического применения. EE DOX DNPs и plCSA-DNPs был 40.3 ± 1,67% и 39,5 ± 1,94%, соответственно. LE DOX DNPs и plCSA-DNPs было 6,2 ± 0,74% и 5,1 ± 0,42%, соответственно. Эти данные показали, что степень загрузки наркотиков и наркотиков инкапсуляции сохранялось после plCSA-BP украшения. Эффективность украшение plCSA-BP на поверхности DNPs определяется BCA пробирного (рис. 4). PlCSA-BP спряжение эффективность оказалась 45.5 ± 3,7%.
Пробирного клеточного поглощения JEG3 указал, что plCSA-DNPs быстро привязан к JEG3 клеток в течение 30 мин (рис. 5). Таким образом plCSA ВР был эффективно конъюгированных к поверхности DNP в настоящем Протоколе. Кроме того plCSA-BP может быстро привязать к JEG3 клеток и увеличение клеточного поглощения наночастиц.
Рисунок 1. Схематическое изображение метод, используемый для синтеза наночастиц plCSA ориентированные липидов полимер. Во-первых sonication одношаговый метод был использован для синтеза липидов полимер наночастиц (DNPs), а затем EDC/NHS метод был использован для конъюгата пептидов на поверхности наночастиц (plCSA-DNPs). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Размер распределения различных наночастиц. Гидродинамические размер DNPs (A) и (B) измеряется DLS plCSA-DNPs. Представитель цифры представлены продемонстрировать размер частиц и распределения размеров. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Морфология наночастиц, характеризуется ТЕА. Типичный образ ТЕА DNPs (A) и (B) наблюдается с 2% фосфорвольфрамовой кислоты окрашивание plCSA-DNPs. Шкалы бар = 100 Нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Измерение эффективности спряжение, используя BCA assay. Калибровочной кривой пептидов в 562 Нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5. Наночастицы усвоение клетками JEG3. JEG3 клетки были проанализированы микроскопии флуоресцирования после 30 минут инкубации с 5 мкг/мл различных наночастиц. Красный: DOX, синий: DAPI-меченых ядер. Шкалы бар = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол обеспечивает эффективное и воспроизводимый метод синтеза наночастиц plCSA BP-конъюгированных липидов полимер. Метод single-step sonication подготовить липидов полимер наночастиц быстро, воспроизводимые и отличается от типичных nanoprecipitation методов, которые включают Отопление, vortexing или испарения. Следовательно разработанный метод значительно сокращает время синтеза. Кроме того биоконъюгатов EDC/Трансплантология, используемые в настоящем Протоколе — это часто используемые и удобный метод для конъюгата пептидов и антител к наночастиц. Таким образом, сочетание метода single-step sonication с техникой биоконъюгатов EDC/NHS синтезировать plCSA таргетинг липидов полимер наночастиц можно вычислить по маштабу для клинического применения.
Некоторые процедуры являются критическими для успешно обобщения и характеризующих plCSA-DNPs. Во-первых Относительная концентрация лецитин, PLGA и DSPE-PEG-COOH определить размер наночастиц липидов полимера и полиизопрена. Когда концентрация лецитин фиксируется, более высокую концентрацию DSPE-PEG-COOH результатов в нижней полиизопрена и меньший размер наночастиц,13,15 , который соответственно уменьшается наркотиков LE. Когда концентрация PLGA фиксируется, больше DSPE-PEG-COOH заменяется лецитин, приводит к более высокой наночастиц полиизопрена и больших наночастиц размер15. В этой ситуации, наночастиц более нестабильной и совокупных легко. В этом протоколе соотношение веса DSPE-PEG-СООН/PLGA 0,11, и лецитин/DSPE-PEG-COOH массы соотношение составляет 0,43. Липидов полимер наночастиц размер составляет примерно 82 нанометр с PDI приблизительно 0,127.
Во-вторых рН раствора во время спряжение пептиды для наночастиц имеет первостепенное значение. Оптимальный рН Эстер активации 5.0-6.0, и реакция аминов является наиболее эффективным при рН 7,2-7,519,,2829. Для достижения наилучших результатов реакция должна выполняться в два этапа. Во-первых Эстер Активация происходит в МЧС (или другой noncarboxylate, nonamine буфер) на рН 5,0-6,0. Затем pH корректируется 7.2-7,5 с помощью PBS (или другой nonamine буфер) непосредственно перед реакции с Амин содержащих молекулы19. Учитывая, что период полураспада NHS эфиры 4-5 ч при pH 7.019, продолжительность реакции аминов превышает 10 ч при 4 ° C.
Окончательный решающим фактором является поглощение наночастиц. Неадресных поглощение DNPs клетками JGE3 был ликвидирован в функции анализа целевых поглощения, контролируя время культуры и температуры и концентрации FBS в среде. В этом протоколе, JEG3 клетки инкубировали с 5% FBS на 4 ° C для 1 h, а затем культивировали при 37 ° C за 30 мин для сведения к минимуму DNP клеточного поглощения.
Если проблемы возникают во время процедуры, есть три основных действия по устранению неполадок, связанных с синтеза и характеристика plCSA-DNPs. Во-первых, были подготовлены липидов полимер наночастиц самосборки и PLGA лецитин в sonication условиях. PLGA только растворяется в органических растворителях. Таким образом при добавлении к гидрофильным растворителя, PLGA осаждает быстро в небольших наночастиц. Чтобы свести к минимуму эффект скорость прикапывают сложения и избежать возникновения крупных частиц, sonication смеси для 1-2 мин перед добавлением PLGA является необходимым. Во-вторых хотя количественный анализ эффективности спряжение plCSA ВР, с помощью метода BCA, быстро и удобно, пробирного высокопроизводительных жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) является более точным. Экспериментальные данные ВЭЖХ, были описаны в нашей группе11 и другие30,,3132. Наконец оптимальные условия для plCSA-DNP клеточного поглощения могут отличаться для других раковых клеток. Постепенно уменьшается концентрация FBS и увеличивая время инкубации при 37 ° C может помочь определить оптимальные условия.
Одно ограничение протокола является гидрофобность наркотиков определяет EE препаратов. По сравнению с гидрофильные препараты, гидрофобные препараты имеют сильнее сродство для PLGA, что приводит к увеличению наркотиков EE. В этих случаях процедуры для синтеза наночастиц plCSA ориентированные липидов полимер должны проверяться экспериментально определить наиболее эффективный метод синтеза, который приводит к идеальной наркотиков LE и EE.
Как упоминалось выше, Гликозаминогликан plCSA конкретно выражается на большинство раковых клеток и плаценты трофобласты. Следовательно, важно отметить, что plCSA-NPs должен использоваться для доставки целевых терапевтических средств опухолевых клеток в только небеременных животных и людей, и что эти препараты загружен частиц приведет к побочные эффекты в плаценте беременных животных и люди.
В целом мы описали простой и удобный метод для синтеза наночастиц plCSA ориентированные липидов полимер. Значимость этого протокола является, что он увеличивает доступность наркотиков в опухоли и плаценту, при сведении к минимуму сопутствующих токсичности. Этот подход должен быть полезным для целенаправленной доставки наркотиков опухоли и плаценту и могут быть расширены для подготовки целевых plCSA липидов полимер наночастиц для клинического применения в будущем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Изобретателей на патент PCT/CN2017/108646 и 201710906587.6, представленных СИАТ, который охватывает метод синтеза наночастиц, ориентированные на plCSA и приложения являются X.F. и Б.З. Другими авторами были раскрыты не потенциальные конфликты интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана субсидии от национального исследования ключ и Программа развития Китая (2016YFC1000402), Национальный фонд естественных наук (81571445 и 81771617) и Фонд провинции Гуандун естественных наук (2016A030313178) для X.F. и Шэньчжэнь Basic исследовательский фонд (JCYJ20170413165233512) X.F.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plCSA peptide | Shanghai GL Biochem | 573518 | for peptide synthesis |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical | 10009218 | for nanoparticles synthesis |
| Soybean lecithin | Avanti Polar Lipids | 441601 | for nanoparticles synthesis |
| DSPE-PEG-COOH | Avanti Polar Lipids | 880125 | for nanoparticles synthesis |
| Doxorubicin | JKChemical | 113424 | for nanoparticles synthesis |
| Acetonitrile | Shanghai Lingfeng | 1008621 | for nanoparticles synthesis |
| PLGA | Sigma-Aldrich | 719897 | for nanoparticles synthesis |
| Ultrasonic processor | Sonics | VCX130 | for nanoparticles synthesis |
| Centrifuge filter (MWCO 10 kDa) | Millipore | UFC801024 | for nanoparticles purification |
| centrifuge | Sigma | 3-18KS | for nanoparticles purification |
| 2-[morpholino]ethanesulfonic acid(MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | for peptide conjugation |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | 3450 | for peptide conjugation |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 56480 | for peptide conjugation |
| Dialysis bags | Spectrum | 132592T | for nanoparticles purification |
| PBS | Hyclone | SH30028.01 | for cell culture |
| 10 mL centrifuge tubes, polypropylene | Aladdin | S-025 | for nanoparticles synthesis |
| 15 mL centrifuge tubes, polypropylene | Corning | 430791 | for various applications |
| 0.22 μm sterile syringe filter | Millipore | SLGV033RB | for nanoparticles purification |
| 1 ml syringe, polypropylene | BD | 328421 | for nanoparticles synthesis |
| Malvern Zetasizer | Malvern | Nano ZS | for particle size analyer |
| Phosphotungstic acid | for TEM | ||
| TEM grid | EMCN | BZ10024a | for TEM |
| UV-VIS spectrometer | Leagene | DZ0035 | for TEM |
| Transmission electron microscope |
JEOL | JEM-100CXII | for particle size analyer |
| BCA reagent A | Thermo Fisher Scientific | 23228 | for BCA assay |
| BCA reagent B | Thermo Fisher Scientific | 23224 | for BCA assay |
| 96-Well Plates | Corning | 3599 | for BCA assay |
| Plate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan™ GO | for BCA assay |
| 12-well plates | Corning | 3513 | for cell culture |
| JEG3 cell | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | TCHu195 | Human placenta |
| DMEM/F12 | Hyclone | SH30272.01 | phenol red-free |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10100 | for cell culture |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO | 15070063 | for cell culture |
| Fluorescence microscope | OLYMPUS | CKK53 | for celluar uptake |
| Paraformaldehyde | Shanghai Lingfeng | 1372021 | for celluar uptake |
| DAPI | Sangon Biotech | A606584 | for celluar uptake |
| Mounting medium | Life | P36961 | for celluar uptake |
References
- Davis, M. E., Shin, D. M. Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (9), 771 (2008).
- Nie, S., Xing, Y., Kim, G. J., Simons, J. W. Nanotechnology applications in cancer. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 257-288 (2007).
- Jabir, N. R., et al. An overview on the current status of cancer nanomedicines. Current Medical Research and Opinion. 34 (5), 911-921 (2018).
- Pillai, G. Nanomedicines for Cancer Therapy: An Update of FDA Approved and Those under Various Stages of Development. SOJ Pharmacy & Pharmaceutical Sciences. 1 (2), 1-13 (2014).
- Marta, T., Luca, S., Serena, M., Luisa, F., Fabio, C. What is the role of nanotechnology in diagnosis and treatment of metastatic breast cancer? Promising Scenarios for the Near Future. Journal of Nanomaterials. 2016, e5436458 (2016).
- Dasari, S., Tchounwou, P. B. Cisplatin in cancer therapy: molecular mechanisms of action. European journal of Pharmacology. 740, 364-378 (2014).
- Brigger, I., Dubernet, C., Couvreur, P. Nanoparticles in cancer therapy and diagnosis. Advanced Drug Delivery Reviews. 64, 24-36 (2012).
- Steichen, S. D., Caldorera-Moore, M., Peppas, N. A. A review of current nanoparticle and targeting moieties for the delivery of cancer therapeutics. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 48 (3), 416-427 (2013).
- Salanti, A., et al. Targeting human cancer by a glycosaminoglycan binding malaria protein. Cancer Cell. 28 (4), 500-514 (2015).
- Seiler, R., et al. An Oncofetal Glycosaminoglycan Modification Provides Therapeutic Access to Cisplatin-resistant Bladder Cancer. European Urology. 72 (1), 142-150 (2017).
- Zhang, B., et al. Targeted delivery of doxorubicin by CSA-binding nanoparticles for choriocarcinoma treatment. Drug Delivery. 25 (1), 461-471 (2018).
- Zhang, B., et al. Placenta-specific drug delivery by trophoblast-targeted nanoparticles in mice. Theranostics. 26 (2), 130-137 (2018).
- Zhang, L., et al. Self-assembled lipid--polymer hybrid nanoparticles: a robust drug delivery platform. ACS Nano. 2 (8), 1696-1702 (2008).
- Zheng, M., et al. Single-step assembly of DOX/ICG loaded lipid-polymer nanoparticles for highly effective chemo-photothermal combination therapy. ACS. 7 (3), 2056-2067 (2013).
- Fang, R. H., Aryal, S., Hu, C. -M. J., Zhang, L. Quick synthesis of lipid− polymer hybrid nanoparticles with low polydispersity using a single-step sonication method. Langmuir. 26 (22), 16958-16962 (2010).
- Gu, L., et al. Folate-modified, indocyanine green-loaded lipid-polymer hybrid nanoparticles for targeted delivery of cisplatin. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 28 (7), 690-702 (2017).
- Mandal, B., Mittal, N. K., Balabathula, P., Thoma, L. A., Wood, G. C. Development and in vitro evaluation of core-shell type lipid-polymer hybrid nanoparticles for the delivery of erlotinib in non-small cell lung cancer. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 81, 162-171 (2016).
- Shi, T., et al. Enhanced legumain-recognition and NIR controlled released of cisplatin-indocyanine nanosphere against gastric carcinoma. European Journal of Pharmacology. 794, 184-192 (2017).
- Grabarek, Z., Gergely, J. Zero-length crosslinking procedure with the use of active esters. Analytical Biochemistry. 185 (1), 131-135 (1990).
- Hadjipanayis, C. G., et al. EGFRvIII Antibody-Conjugated Iron Oxide Nanoparticles for Magnetic Resonance Imaging-Guided Convection-Enhanced Delivery and Targeted Therapy of Glioblastoma. Cancer Research. 70 (15), 6303-6312 (2010).
- Sadhukha, T., Wiedmann, T. S., Panyam, J. Inhalable magnetic nanoparticles for targeted hyperthermia in lung cancer therapy. Biomaterials. 34 (21), 5163-5171 (2013).
- Jennings, M., Nicknish, J. Localization of a site of intermolecular cross-linking in human red blood cell band 3 protein. Journal of Biological Chemistry. 260 (9), 5472-5479 (1985).
- Staros, J. V. N-hydroxysulfosuccinimide active esters: bis(N-hydroxysulfosuccinimide) esters of two dicarboxylic acids are hydrophilic, membrane-impermeant, protein cross-linkers. Biochemistry. 21 (17), 3950-3955 (1982).
- Valencia, P. M., et al. Single-step assembly of homogenous lipid− polymeric and lipid− quantum dot nanoparticles enabled by microfluidic rapid mixing. ACS. 4 (3), 1671-1679 (2010).
- Altintas, I., et al. Nanobody-albumin nanoparticles (NANAPs) for the delivery of a multikinase inhibitor 17864 to EGFR overexpressing tumor cells. Journal of Controlled Release. 165 (2), 110-118 (2013).
- Maya, S., et al. Cetuximab conjugated O-carboxymethyl chitosan nanoparticles for targeting EGFR overexpressing cancer cells. Carbohydrate Polymers. 93 (2), 661-669 (2013).
- Deepagan, V. G., et al. In vitro targeted imaging and delivery of camptothecin using cetuximab-conjugated multifunctional PLGA-ZnS nanoparticles. Nanomedicine. 7 (4), 507-519 (2012).
- Totaro, K. A., et al. Systematic investigation of EDC/sNHS-mediated bioconjugation reactions for carboxylated peptide substrates. Bioconjugate Chemistry. 27 (4), 994-1004 (2016).
- Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions. Mass Spectrometry Reviews. 25 (4), 663-682 (2006).
- Zhang, B., et al. LDLR-mediated peptide-22-conjugated nanoparticles for dual-targeting therapy of brain glioma. Biomaterials. 34 (36), 9171-9182 (2013).
- Koren, E., Apte, A., Sawant, R. R., Grunwald, J., Torchilin, V. P. Cell-penetrating TAT peptide in drug delivery systems: proteolytic stability requirements. Drug Delivery. 18 (5), 377-384 (2011).
- Chu, Y., et al. Topical ocular delivery to laser-induced choroidal neovascularization by dual internalizing RGD and TAT peptide-modified nanoparticles. International Journal of Nanomedicine. 12, 1353-1368 (2017).
