Summary
Aquí, presentamos un protocolo para la síntesis del péptido de Unión placentaria condroitin sulfato A (plCSA-BP)-conjugados polímero lipídico nanopartículas via solo paso sonicación y bioconjugate técnicas. Estas partículas constituyen una novedosa herramienta para la entrega específica de la terapéutica para tumores más humanos y trofoblastos placentarios para tratar cánceres y trastornos placentarios.
Abstract
Un método terapéutico eficaz cáncer reduce y elimina tumores con mínima toxicidad sistémica. Nanopartículas activamente dirigida a ofrecen un enfoque prometedor para la terapia del cáncer. El sulfato de condroitina placentaria glycosaminoglycan (plCSA) se expresa en una amplia gama de las células cancerosas y trofoblastos placentarios y palúdica proteína que var2csa puede atar específicamente a plCSA. Un péptido de Unión placentaria divulgado el sulfato de condroitina A (plCSA-BP), derivado de proteína de la malaria VAR2CSA, puede enlazar también específicamente plCSA en las células cancerosas y trofoblastos placentarios. Por lo tanto, las nanopartículas conjugadas de BP plCSA podrían utilizarse como una herramienta para el suministro de medicamentos dirigidos a los cánceres humanos y trofoblastos placentarios. En este protocolo, se describe un método para sintetizar lípidos-polímero conjugado de BP plCSA nanopartículas cargadas con doxorrubicina (plCSA-DNPs); el método consiste en una técnica de sonicación solo paso y bioconjugate. Además, se describen varios métodos para la caracterización de plCSA-DNPs, incluyendo la determinación de sus propiedades fisicoquímicas y la absorción celular de las células de coriocarcinoma placentario (JEG3).
Introduction
Un método terapéutico eficaz cáncer reduce y elimina tumores con mínima toxicidad sistémica. Por lo tanto, selectiva tumor targeting es la clave para explorar métodos terapéuticos exitosos. Nanopartículas ofrecen una oportunidad prometedora para tratamiento del cáncer, y conjuntos moleculares con diferentes grupos funcionales serán mejorar la eficacia de los medicamentos y reducir los efectos secundarios asociados1,2. Por otra parte, nanopartículas sistemas utilizan principalmente pasiva y activa dirigida a para alcanzar el objetivo tumores3.
Orientación pasivo explota las características innatas de nanopartículas y permeabilidad mejorada y los efectos de la retención (EPR) para llegar a las células del tumor. Liposomas catiónicos se han utilizado con éxito para entregar varios medicamentos anticancerosos a tumores en aplicaciones clínicas4,5,6. A pesar del potencial efecto terapéutico de cáncer eficaz, una concentración baja de drogas en la región del tumor y una incapacidad para distinguir las células tumorales de los tejidos normales son dos limitaciones importantes de nanopartículas dirigidas a pasivo7.
Activadas estrategias dirigida a toman ventaja de antígeno-anticuerpo, ligando-receptor y otras interacciones de reconocimiento molecular específicamente entregar drogas a tumores8. El sulfato de condroitina placentaria glycosaminoglycan (plCSA) se expresa ampliamente en la mayoría de las células cancerosas y trofoblastos placentarios. Por otra parte, la proteína de la malaria VAR2CSA puede atar específicamente a plCSA9,10. Por lo tanto, VAR2CSA puede ser una herramienta para apuntar las células de cáncer humano. Sin embargo, cuando VAR2CSA es conjugados a nanopartículas, la proteína de larga duración puede limitar la penetración de nanopartículas en las células del tumor. Recientemente, descubrió un péptido de Unión plCSA (plCSA-BP), derivado de la proteína de la malaria VAR2CSA. nanopartículas de polímero lipídico plCSA BP conjugado enlazado rápidamente a células de coriocarcinoma y aumentó significativamente la doxorrubicina (DOX) actividad anticancerosa en vivo11; Estas partículas también específicamente adheridos a trofoblastos placentarios y podrían servir como una herramienta para la entrega específica de drogas a la placenta12.
Nanopartículas de polímeros lípidos consisten en una cáscara de monocapa de lípidos y un núcleo polímero hidrofóbico y representan un portador nuevo de la entrega de la droga. Estas nanopartículas combinan las ventajas de liposomas y nanocarriers poliméricos, tales como tamaño de nanopartícula controlable, alta biocompatibilidad, liberación sostenida del fármaco, eficacia de drogas alta carga (LE) y excelente estabilidad13. En este trabajo, utilizamos un método de sonicación solo paso para sintetizar nanopartículas de polímero lipídico. Este método es rápido, conveniente y adecuado para escala-para arriba y ha sido ampliamente utilizado para la preparación de nanopartículas de polímero lipídico por nuestro grupo11,14 y otros15,16,17,18 .
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) clorhidrato de carbodiimida (EDC) es una carbodiimida popular utilizada como agente de reticulación para conjugar la biomoléculas que contiene aminas y carboxylates19. Además de EDC, N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) es el reactivo verbal más común en la superficie y nanopartículas Conjugación reacciones20,21. NHS puede reducir el número de reacciones secundarias y mejorar la estabilidad y rendimiento de éster intermediarios22,23.
Aquí, describimos un protocolo para la síntesis de nanopartículas de polímero lipídico plCSA dirigidos. En primer lugar, se describe la síntesis de sonicación solo paso de nanopartículas de polímero de lípidos cargados de DOX (DNPs). Luego, se introduce una técnica de bioconjugate EDC/NHS para la generación de nanopartículas de polímero lipídico plCSA-BP-conjugados. Esta técnica de bioconjugate puede utilizarse también para conjugar otros anticuerpos y péptidos a nanopartículas. Finalmente, describimos el análisis de propiedades y en vitro fisicoquímico utilizado para caracterizar las nanopartículas de polímeros de lípidos plCSA dirigidos. Creemos que estas nanopartículas de polímero lipídico plCSA dirigida podrían constituir un sistema eficaz para la entrega específica de fármacos para cánceres más humanos y la entrega específica de cargas a la placenta para tratar los trastornos placentarios.
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Protocol
1. preparación de soluciones Stock
- Preparar una solución acuosa de etanol 4% diluyendo 4 mL de etanol absoluto con 100 mL de agua ultrapura. La solución a 4 ° C.
Nota: Agua ultrapura se define como agua sin contaminantes tales como bacterias, partículas, iones o nucleasas. Agua ultrapura fue obtenida de un sistema de purificación de agua con una resistencia de blanco de hasta 18.2 mΩ·cm, que significa baja contaminación aniónica. - Preparar un 1 mg/mL solución stock de la lecitina de soja mediante la disolución de 20 mg de lecitina de soja en 20 mL de la solución acuosa de etanol al 4%. Almacenar la solución madre de lecitina de soja a 4 ° C.
- Prepare un 25 mg/mL solución DSPE-PEG (2000)-COOH disolviendo 100 mg de DSPE-PEG-COOH en 4 mL de la solución acuosa de etanol al 4%. Almacenar la solución a-20 ° C.
- Prepare un 10 mg/mL solución DOX disolviendo 50 mg de DOX en 5 mL de agua ultrapura. Almacenar la solución DOX a 4 ° C en la oscuridad.
- Prepare un 2 mg/mL solución PLGA mediante la disolución de 20 mg de PLGA en 10 mL de acetonitrilo. Almacenar la solución PLGA a 4 ° C.
PRECAUCIÓN: Acetonitrilo es inflamable y tóxico. Operar con cuidado en una campana de humos y use el equipo de personal adecuado, tales como batas de laboratorio, gafas de seguridad y guantes de látex. - Prepare una solución ácido (MES, pH 6.0) de 0.1 M 2-(morpholino) (n-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido disolviendo 2,17 g de MES en 100 mL de agua ultrapura. Almacenar la solución a 4 ° C.
2. síntesis de la DNPs
Nota: Para evitar la degradación fotoquímica de DOX, todas las operaciones se realizaron en la oscuridad.
Las nanopartículas fueron sintetizadas por un método de sonicación solo paso previamente divulgados11,13,14.
- Añadir 3 mL de la solución acuosa de etanol 4% a un tubo de centrífuga estéril de 10 mL. Luego, añadir 90 μg de la solución madre de lecitina de soja, 210 μg de la solución madre de DSPE-PEG-COOH y 750 μg de la solución madre de DOX a 3 mL de la solución acuosa de etanol al 4%.
- El tubo de centrífuga en un baño de hielo y el baño de hielo en un procesador de ultrasonidos.
- Con una jeringa de 1 mL pipetear 2 mg de la solución madre de PLGA gota a gota (1 gota/4-6 s) en el tubo de centrífuga. Mientras tanto, someter a ultrasonidos el tubo usando un Sonificador Ultrasonidos de una frecuencia de 20 kHz y una amplitud de salida de 30% por 5 min para sintetizar la DNPs.
Nota: Para sintetizar partículas uniformes con tamaños pequeños, la velocidad en que la solución del EGLP se goteó en el tubo tiene que ser lento, y debe evitarse la generación de burbujas. - Purificar la DNPs lavando la solución anterior en tampón MES de 0,1 M (pH 6.0) 3 veces con un filtro de centrífugas (MWCO, 10 kDa). Centrifugar a 4 ° C y 1000 × g durante 3 minutos cada vez. Por último, debe permanecer aproximadamente 1 mL de nanopartículas MES resuelto.
Nota: Este es un punto de parada aceptable en el procedimiento. Si no utiliza la conjugación de péptidos, las nanopartículas pueden ser purificadas por tampón PBS (pH 7.4), y la DNPs purificada pueden almacenarse a 4° C en la oscuridad.
3. Conjugación de péptidos a la DNPs
-
Activación de Ester
- Agregar 0,4 mg de EDC (concentración final de 2 mM) a 1 mL de la DNPs.
- Añadir a 0,24 mg de NHS a la reacción (concentración final de 2 mM).
Nota: Para la fácil adición de la cantidad correcta de EDC y NHS, una solución stock se puede preparar si los reactivos están disueltos y utilizados inmediatamente. - Mezclar bien los componentes de la reacción y coloque la reacción en una coctelera; permita que la reacción de 30min - 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad.
-
Reacción de Amina
- Aumentar el tampón, pH 7.2-7.5 uso PBS (20 ×, pH 7,4).
- Añadir 0,5 mg del péptido plCSA-targeting (plCSA-BP, EDVKDINFDTKEKFLAGCLIVSFHEGKC) a la solución de reacción.
Nota: Antes además, disolver los péptidos en acetonitrilo 20%. Si no son absorbibles péptidos, sonicación en un sonicador de baño puede útil. - Mezcle bien la solución y luego colocar en una coctelera; permitir la reacción proceder a 4 ° C durante la noche en la oscuridad.
- Coloque la solución de conjugado en las bolsas de diálisis (MWCO, 3.500 Da) a dializarse y purificar la DNPs plCSA con tampón PBS (pH 7.4) a temperatura ambiente por 24 h en la oscuridad.
Nota: Alternativamente, purificación puede realizarse como en el paso 2.4 para obtener plCSA-DNPs. - Para las aplicaciones de la cultura de célula, filtrar la solución reconstituida a través de un filtro de jeringa estéril de 0,22 μm para eliminar posibles precipitados.
4. Caracterización de lípidos objetivo plCSA-nanopartículas de polímero
-
Medición de las dimensiones de nanopartículas hidrodinámico con dispersión ligera dinámica (DLS)
- Nanopartículas diluidas con agua ultrapura (50-fold dilución). Carga de 500 μl de la muestra en una cubeta siguiendo las instrucciones del instrumento potencial DLS o zeta.
Nota: Potencial Zeta y cubetas DLS pueden diferenciarse en base a las especificaciones del instrumento. - Una vez finalizada la medición, registre el diámetro de la partícula, índice de polidispersidad (PDI) y potencial zeta. Medio los resultados de 4 repitieron lecturas y calcular la desviación estándar.
- Nanopartículas diluidas con agua ultrapura (50-fold dilución). Carga de 500 μl de la muestra en una cubeta siguiendo las instrucciones del instrumento potencial DLS o zeta.
-
Microscopía electrónica de transmisión (TEM)
Nota: Se observó la morfología de las nanopartículas por TEM con el método de tinción negativa. 24- Nanopartículas diluidas con agua ultrapura (400-fold dilución). Añadir 20 μl de la muestra en una cuadrícula TEM y dejar para reposar 5 minutos.
- Añada 100 μl de ácido fosfotúngstico al 2% (w/v) y dejar para reposar 2 minutos mecha la gota.
- Secar la rejilla TEM a temperatura ambiente.
- Ajustar la tensión de aceleración de TEM a 80 kV y ampliar la imagen a × 100.000 para visualizar las nanopartículas.
-
Determinación de la eficiencia de encapsulación (EE) y LE
- Generación de la curva estándar. Disolver DOX en agua ultrapura para preparar soluciones DOX de cinco diferentes concentraciones: 1 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL, 50 μg/mL y 100 μg/mL. Medir la absorción de las soluciones DOX a 480 nm con un espectrómetro de UV-VIS. Generar una curva estándar basada en las concentraciones de DOX.
- Diluir 25 μl de nanopartículas con 500 μl de agua ultrapura. Medir la absorción a 480 nm con un espectrómetro de UV-VIS. Calcular las concentraciones de la droga por la curva estándar.
- Calcular LE utilizando la siguiente ecuación:
LE = ((cantidad de droga en nanopartículas) / (peso total de materiales)) × 100%. - Calcular el EE mediante la siguiente ecuación:
EE = ((cantidad de droga en nanopartículas) / (cantidad de agregado drogas)) × 100%.
-
Medición de la eficiencia verbal usando el análisis de (BCA) ácido bicinchoninic 25 , 26 , 27
- Pipetear 25 μl de soluciones de péptido estándar (tabla 1) o plCSA-DNPs en pocillos de microplacas en duplicado. Añadir 200 μL de reactivo de trabajo a cada pocillo y mezclar la placa bien en una coctelera de placa por 30 s.
- Cubra la placa e incubar a 37 ° C durante 30 minutos.
- Medir la absorbancia a 562 nm en un lector de placas. Utilice la curva estándar generada para calcular las concentraciones de plCSA de plCSA-DNPs.
- Calcular la eficiencia verbal utilizando la siguiente ecuación:
Eficiencia verbal = ((cantidad de péptido en nanopartículas) / (cantidad de añadido péptido)) × 100%.
| Frasco | Volumen de diluyente (μL) | Volumen y fuente de péptidos (μL) | Concentración final del péptido (μg/mL) |
| A | 0 | 300 de Stock | 1000 |
| B | 250 | frasco una dilución de 250 | 500 |
| C | 250 | 250 de dilución del vial B | 250 |
| D | 250 | 250 de dilución frasco C | 125 |
| E | 300 | 200 de dilución frasco D | 50 |
| F | 250 | 250 de dilución frasco E | 25 |
| G | 400 | 100 de dilución frasco F | 5 |
| H | 500 | 0 | 0 |
Tabla 1. Preparación de péptidos estándar
5. fluorescencia microscopía evaluación de la absorción de nanopartículas plCSA dirigida en células de coriocarcinoma (JEG3)
- Semilla de células en placas de 12 bien estériles a 1.0 × 104 células/pozo con completo DMEM/F12 (cDMEM/F12, que contiene 1% penicilina/estreptomicina y 10% suero bovino fetal (FBS)). Permitir a las células a crecer hasta 60% de confluencia a 37 ° C y 5% de CO2 en condiciones húmedas.
- Quitar los medios de comunicación y agregar 1 mL de medio fresco frío con un contenido bajo del suero (5% SBF) y DNPs o plCSA-DNPs (5 μg de equivalentes DOX).
- Incubar la mezcla de células y nanopartículas a 4 ° C durante 1 hora.
- Después de la incubación, retirar los medios de comunicación y lavar las células 3 veces con PBS. Luego, añadir 1 mL de cDMEM fresco/F12 e Incube las células a 37 ° C durante 30 minutos.
- Retire el cDMEM/F12 y lavar las células 3 veces con PBS.
- Añadir 2 mL de frío 4% paraformaldehido (PFA) e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos reparar las células.
- Retire la PFA. Lavar una vez las células con 2 mL de PBS. Añadir 1 mL de PBS con DAPI (1 μg/mL) para núcleos coloración e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
- Aspire el PBS y lavar las células 3 veces con PBS.
- Añadir medio de montaje y la imagen de la fluorescencia con una microscopía de fluorescencia, utilizando los canales verdes y azules para visualizar los DOX y núcleos, respectivamente.
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Representative Results
En este protocolo, PLGA, DSPE-PEG-COOH y soja lecitina son un polímero representativo, lípido-PEG-COOH conjugado y lípidos, respectivamente. La síntesis de nanopartículas a través de un solo paso método de sonicación polímero lipídico plCSA dirigida y una técnica EDC/NHS se ilustra en la figura 1. En primer lugar, bajo condiciones de sonicación, lecitina de soja, PLGA y DSPE-PEG-COOH uno mismo-montar al core-shell de forma estructurada DNPs. El núcleo se compone de PLGA y DOX encapsulada, la cáscara consiste en DSPE-PEG-COOH y la monocapa de la lecitina de soja se encuentra en la interfase de la cáscara y el núcleo. Entonces, los grupos - COOH expuestos en la superficie DNP fueron conjugados con el -NH2 grupos el péptido a través de la técnica EDC/NHS para sintetizar plCSA-DNPs.
La DNPs en este protocolo fueron 82,3 ± 4,7 nm de diámetro, y después de la conjugación a plCSA-BP, el diámetro de la DNPs primaria aumentó a 109,3 ± 5,9 nm (figura 2). El PDI de la DNPs y plCSA-DNPs fue 0.127±0.005 y ± 0.134 0,065, respectivamente. Imágenes TEM de la DNPs y plCSA-DNPs también demostraban que las partículas se dispersaron bien y generalmente tenían morfologías esféricas (figura 3). El potencial zeta de la DNPs y plCSA-DNPs fue-20.1 ± 1,32 MT y-29.9 ± 3.56 mV, respectivamente (tabla 2). Por lo tanto, estas nanopartículas se predicen que sea muy estable.
| Nanopartículas | Diameter(nm) | PDI | Potencial zeta (mV) |
| DNPs | 82.3±4.7 | 0.127±0.005 | -20.1±1.32 |
| plCSA-DNPs | 109.3±5.9 | 0.134±0.065 | -29.9±3.56 |
| Índice de PDI:polydispersity. Los datos presentan media ± SD (n = 3). | |||
Tabla 2. Caracterización de las nanopartículas
La EE y LE de las nanopartículas son importantes para aplicaciones clínicas. EE de DOX de la DNPs y plCSA-DNPs fue 40,3 ± 1,67% y 39,5 ± 1,94%, respectivamente. LE de DOX en la DNPs y plCSA-DNPs fue 6,2 ± 0,74% y 5,1 ± 0.42%, respectivamente. Estos datos demostraron que el grado de cargamento de droga y droga encapsulación fue mantenido después de decoración plCSA-BP. La eficacia de la decoración de plCSA-BP en la superficie de la DNPs se determinó por el ensayo BCA (figura 4). La eficiencia verbal de plCSA-BP fue encontrada para ser de 45.5 ± 3,7%.
El ensayo de absorción celular JEG3 indicó que la DNPs plCSA obligados rápidamente a células JEG3 dentro de 30 minutos (figura 5). Por lo tanto, BP plCSA fue conjugado eficientemente a la superficie DNP en este protocolo. Por otra parte, plCSA BP podría rápidamente se unen a las células JEG3 y aumentar la absorción celular de las nanopartículas.
Figura 1. Ilustración esquemática del método utilizado para sintetizar nanopartículas de polímero lipídico orientada a plCSA. En primer lugar, se utilizó un método de sonicación solo paso para sintetizar nanopartículas de polímero lipídico (DNPs), y luego se utilizó la técnica EDC/NHS Conjugación de péptidos a las superficies de nanopartículas (plCSA-DNPs). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Tamaño de distribución de las nanopartículas diferentes. Tamaño hidrodinámico de la DNPs (A) y (B) medidos por DLS plCSA-DNPs. Figuras representativas se presentan para demostrar el tamaño de partícula y distribución del tamaño. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Morfología de nanopartículas caracterizado por TEM. Típica imagen TEM de la DNPs (A) y (B) observados con la coloración ácido fosfotúngstico 2% plCSA-DNPs. Barra de escala = 100 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Medición de la eficiencia verbal usando el ensayo BCA. Curva estándar de los péptidos a 562 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Absorción de nanopartículas por las células JEG3. Las células JEG3 se analizaron por microscopía de fluorescencia después de 30 min de incubación con nanopartículas diferentes de 5 μg/mL. Rojo: DOX, azul: núcleos marcados con DAPI. Barra de escala = 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo proporciona un método eficiente y reproducible para la síntesis de nanopartículas de polímero lipídico plCSA-BP-conjugados. El método de sonicación solo paso para la preparación de nanopartículas de polímero lipídico es rápido, reproducible y diferente del típico nanoprecipitation métodos que implican calentamiento, Vortex o evaporación. Por lo tanto, el método desarrollado reduce significativamente el tiempo de síntesis. Además, la EDC/NHS bioconjugate utilizado en este protocolo es una técnica comúnmente usada y conveniente Conjugación de péptidos y anticuerpos a nanopartículas. Por lo tanto, la combinación del método de sonicación solo paso con la técnica de bioconjugate EDC/NHS para sintetizar polímeros de lípidos plCSA-targeting nanopartículas pueden ampliarse para aplicaciones clínicas.
Ciertos procedimientos son críticos para sintetizar y caracterizar plCSA-DNPs con éxito. En primer lugar, las concentraciones relativas de lecitina, PLGA y DSPE-PEG-COOH determinan el tamaño de nanopartículas de polímero lipídico y polidispersidad. Cuando se fija la concentración de lecitina, una concentración más alta de los resultados de DSPE-PEG-COOH en baja polidispersidad y un menor tamaño de nanopartículas,13,15 que por lo tanto disminuye la droga LE. Cuando se fija la concentración de PLGA, más DSPE-PEG-COOH es sustituido por lecitina, llevando a mayor polidispersidad de nanopartículas y mayor tamaño de nanopartícula15. En esta situación, las nanopartículas son más inestables y agregados fácilmente. En el presente Protocolo, el cociente del peso DSPE-PEG-COOH/PLGA es 0.11, y el cociente total de lecitina/DSPE-PEG-COOH es 0,43. El tamaño de nanopartículas de polímero lipídico es de aproximadamente 82 nm con una PDI de aproximadamente 0.127.
En segundo lugar, el pH de la solución durante la conjugación de los péptidos a las nanopartículas es de suma importancia. El pH óptimo de activación de éster es 5.0-6.0, y la reacción de Amina es más eficiente a pH 7.2-7.519,28,29. Para mejores resultados, la reacción debe realizarse en dos pasos. En primer lugar, activación de éster se produce en el MES (u otro noncarboxylate, almacenador intermediario del nonamine) en pH 5.0-6.0. Luego, se ajustó el pH a 7.2-7.5 utilizando PBS (u otro buffer nonamine) inmediatamente antes de la reacción con la molécula que contiene amina19. Teniendo en cuenta que la vida media de los ésteres de NHS es 4-5 h a pH 7.019, la duración de la reacción de Amina excede de 10 h a 4 ° C.
El último factor crítico es la absorción de nanopartículas. Absorción descartando de la DNPs por células JGE3 fue eliminada en un análisis de la función de la absorción específica controlando el tiempo de la cultura y la temperatura y la concentración de FBS en el medio. En este protocolo, se incubaron las células JEG3 con 5% FBS a 4 ° C para 1 h y luego cultivados a 37 ° C por 30 min para minimizar la absorción celular de DNP.
Si surgen problemas durante el procedimiento, hay tres pasos principales relacionadas con la síntesis y caracterización de plCSA-DNPs. En primer lugar, se prepararon nanopartículas de polímero lipídico por el autoensamblaje de PLGA y lecitina en condiciones de sonicación. PLGA sólo se disuelve en solvente orgánico. Por lo tanto, en adición a un disolvente hidrófilo, PLGA precipita rápidamente en pequeñas nanopartículas. Para minimizar el efecto de la velocidad de la adición gota a gota y evitar la generación de partículas más grandes, la sonicación de la mezcla por 1-2 min antes de agregar el EGLP es necesario. En segundo lugar, aunque el análisis cuantitativo de la eficiencia verbal de BP plCSA utilizando el método BCA es rápido y cómodo, un ensayo de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) es más preciso. Los detalles experimentales de HPLC han sido descritas por nuestro grupo11 y otros30,31,32. Por último, las condiciones óptimas para la absorción celular plCSA-DNP pueden ser diferente para otras células del cáncer. Poco a poco disminuyendo la concentración de FBS y aumentar el tiempo de incubación a 37 ° C pueden ayudar a determinar las condiciones óptimas.
Una limitación del protocolo es que la hidrofobicidad de drogas determina la EE de los fármacos. En comparación con fármacos hidrofílicos, hidrofóbicos medicamentos tienen una afinidad más fuerte por PLGA, que resulta en un aumento de drogas EE. En estos casos, los procedimientos para la síntesis de las nanopartículas de polímeros de lípidos plCSA dirigidos tendrán que examinarse experimentalmente para determinar el método de síntesis más eficiente que se traduce en la droga ideal LE y EE.
Como se mencionó anteriormente, el glicosaminoglicano plCSA específicamente se expresa en la mayoría de las células cancerosas y trofoblastos placentarios. Por lo tanto, es importante tener en cuenta que el NPs plCSA debe usarse para la entrega específica de la terapéutica a las células tumorales en animales sólo las y los seres humanos, y que estas partículas cargadas de drogas provocaría efectos secundarios en la placenta de animales gestantes y seres humanos.
En Resumen, hemos descrito un método simple y conveniente para sintetizar nanopartículas de polímero lipídico plCSA dirigidos. La importancia de este protocolo es que aumenta la disponibilidad de drogas en los tumores y la placenta, y reducir al mínimo la toxicidad concomitante. Este enfoque puede ser útil para la entrega específica de drogas a los tumores y de la placenta y puede ampliarse para preparar nanopartículas dirigidas plCSA lípido-polímero para aplicaciones clínicas en el futuro.
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Disclosures
X.F. y B.Z. son los inventores de la patente PCT/CN2017/108646 y 201710906587.6 enviado por SIAT que cubre un método de síntesis de nanopartículas dirigidas plCSA y aplicación. No hay posibles conflictos de interés fueron revelados por otros autores.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la nacional clave de investigación y programa de desarrollo de China (2016YFC1000402), la Fundación Nacional de Ciencias naturales (81571445 y 81771617) y la Fundación Ciencias naturales de la provincia de Guangdong (2016A030313178) a X.F. y el fondo de investigación básica de Shenzhen (JCYJ20170413165233512) a X.F.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plCSA peptide | Shanghai GL Biochem | 573518 | for peptide synthesis |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical | 10009218 | for nanoparticles synthesis |
| Soybean lecithin | Avanti Polar Lipids | 441601 | for nanoparticles synthesis |
| DSPE-PEG-COOH | Avanti Polar Lipids | 880125 | for nanoparticles synthesis |
| Doxorubicin | JKChemical | 113424 | for nanoparticles synthesis |
| Acetonitrile | Shanghai Lingfeng | 1008621 | for nanoparticles synthesis |
| PLGA | Sigma-Aldrich | 719897 | for nanoparticles synthesis |
| Ultrasonic processor | Sonics | VCX130 | for nanoparticles synthesis |
| Centrifuge filter (MWCO 10 kDa) | Millipore | UFC801024 | for nanoparticles purification |
| centrifuge | Sigma | 3-18KS | for nanoparticles purification |
| 2-[morpholino]ethanesulfonic acid(MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | for peptide conjugation |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | 3450 | for peptide conjugation |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 56480 | for peptide conjugation |
| Dialysis bags | Spectrum | 132592T | for nanoparticles purification |
| PBS | Hyclone | SH30028.01 | for cell culture |
| 10 mL centrifuge tubes, polypropylene | Aladdin | S-025 | for nanoparticles synthesis |
| 15 mL centrifuge tubes, polypropylene | Corning | 430791 | for various applications |
| 0.22 μm sterile syringe filter | Millipore | SLGV033RB | for nanoparticles purification |
| 1 ml syringe, polypropylene | BD | 328421 | for nanoparticles synthesis |
| Malvern Zetasizer | Malvern | Nano ZS | for particle size analyer |
| Phosphotungstic acid | for TEM | ||
| TEM grid | EMCN | BZ10024a | for TEM |
| UV-VIS spectrometer | Leagene | DZ0035 | for TEM |
| Transmission electron microscope |
JEOL | JEM-100CXII | for particle size analyer |
| BCA reagent A | Thermo Fisher Scientific | 23228 | for BCA assay |
| BCA reagent B | Thermo Fisher Scientific | 23224 | for BCA assay |
| 96-Well Plates | Corning | 3599 | for BCA assay |
| Plate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan™ GO | for BCA assay |
| 12-well plates | Corning | 3513 | for cell culture |
| JEG3 cell | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | TCHu195 | Human placenta |
| DMEM/F12 | Hyclone | SH30272.01 | phenol red-free |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10100 | for cell culture |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO | 15070063 | for cell culture |
| Fluorescence microscope | OLYMPUS | CKK53 | for celluar uptake |
| Paraformaldehyde | Shanghai Lingfeng | 1372021 | for celluar uptake |
| DAPI | Sangon Biotech | A606584 | for celluar uptake |
| Mounting medium | Life | P36961 | for celluar uptake |
References
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