Summary
Hier presenteren we een protocol voor de synthese van placenta chondroitin sulfaat A bindend peptide (plCSA-BP)-geconjugeerd lipide-polymeer nanodeeltjes via -voor-stapmodus ultrasoonapparaat en bioconjugate technieken. Deze deeltjes een roman hulpmiddel vormen voor de gerichte levering van therapeutics aan de meeste menselijke tumoren en placenta trophoblasts voor de behandeling van kanker en placenta aandoeningen.
Abstract
Een effectieve kanker therapeutische methode vermindert en elimineert tumoren met minimale systemische toxiciteit. Actief targeting nanodeeltjes bieden een veelbelovende aanpak van kankertherapie. De glycosaminoglycaan placenta chondroitin sulfaat een (plCSA) wordt uitgedrukt op een breed scala van kankercellen en placenta trophoblasts en malaria eiwit die var2csa specifiek aan plCSA binden kan. Een gerapporteerde placenta chondroitin sulfaat A bindend peptide (plCSA-BP), afgeleid van malaria eiwit VAR2CSA, kan ook specifiek binden aan plCSA op kankercellen en placenta trophoblasts. Vandaar, kon plCSA-BP-geconjugeerde nanodeeltjes worden gebruikt als een instrument voor gerichte drug levering aan menselijke kankers en placenta trophoblasts. In dit protocol beschrijven we een methode voor het synthetiseren van lipide-polymer plCSA-BP-geconjugeerde nanodeeltjes geladen met Doxorubicine (plCSA-DNPs); de methode bestaat uit een enkele ultrasoonapparaat stap en bioconjugate technieken. Bovendien worden de verschillende methoden voor het karakteriseren van plCSA-DNPs, met inbegrip van de bepaling van de fysisch-chemische eigenschappen en cellulaire opname door cellen van de placenta choriocarcinoma (JEG3), beschreven.
Introduction
Een effectieve kanker therapeutische methode vermindert en elimineert tumoren met minimale systemische toxiciteit. Vandaar, selectieve tumor richten is de sleutel tot het verkennen van de succesvolle therapeutische methoden. Nanodeeltjes bieden een veelbelovende mogelijkheid voor kankertherapie en moleculaire samenstellingen met verschillende functionele groepen zal verbeteren van de drug werkzaamheid en bijbehorende bijwerkingen1,2te verminderen. Bovendien, nanoparticle systemen voornamelijk gebruik maken van passieve en actieve targeting te bereiken doel tumoren3.
Passieve targeting exploiteert de aangeboren kenmerken van nanodeeltjes en verbeterde permeabiliteit en retentie (EPR) effecten te bereiken van tumorcellen. Kationogene liposomen zijn met succes gebruikt om het leveren van diverse geneesmiddelen aan tumoren in klinische toepassingen4,5,6. Ondanks de mogelijke effectieve kanker therapeutische werking, een lage drug-concentratie in de regio van de tumor en een onvermogen om te onderscheiden van tumorcellen van normale weefsels zijn twee belangrijke beperkingen van passief-targeting nanodeeltjes7.
Actieve gerichte strategieën te profiteren van antigeen-antilichaam, ligand-receptor en andere moleculaire erkenning interacties te leveren specifiek drugs aan tumoren8. De glycosaminoglycaan placenta chondroitin sulfaat een (plCSA) wordt over het algemeen uitgedrukt op de meeste kankercellen en placenta trophoblasts. Bovendien, de malaria proteïne VAR2CSA kunt specifiek binden aan de plCSA9,10. VAR2CSA kan dus een hulpmiddel voor het targeten van menselijke kankercellen. Wanneer VAR2CSA is geconjugeerd met nanodeeltjes, kan de full-length proteïne echter de penetratie van nanodeeltjes in tumorcellen beperken. Onlangs ontdekte we een plCSA bindend peptide (plCSA-BP), afgeleid van de malaria proteïne VAR2CSA. plCSA-BP-geconjugeerde lipide-polymeer nanodeeltjes snel gebonden aan de cellen van de choriocarcinoma en beduidend verhoogd Doxorubicine (DOX) antikanker activiteit in vivo11; deze deeltjes ook specifiek gebonden aan placenta trophoblasts en zou kunnen dienen als een instrument voor de beoogde levering van drugs aan de placenta12.
Lipide-polymeer nanodeeltjes bestaat uit een lipide enkelgelaagde shell en een hydrofoob polymeer kern en vertegenwoordigen een nieuwe drager voor drug delivery. Deze nanodeeltjes combineren de voordelen van liposomen en polymere nanocarriers, zoals controleerbare nanoparticle grootte, hoge biocompatibiliteit, aanhoudende drug release, hoge drug laden efficiëntie (LE) en uitstekende stabiliteit13. In dit werk gebruikten we een-voor-stapmodus ultrasoonapparaat methode voor het synthetiseren van lipide-polymeer nanodeeltjes. Deze methode is snel, gemakkelijk en geschikt voor schaalvergroting en is wijd verbeid gebruikt ter voorbereiding van lipide-polymeer nanodeeltjes van onze groep11,14 e.a.15,16,17,18 .
1-ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) is een populaire carbodiimide gebruikt als een agent crosslinking voor biomoleculen met amines en carboxylates19conjugating. Naast EDC is N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) het meest voorkomende vervoeging reagens in oppervlakte- en nanoparticle vervoeging reacties20,21. NHS kan verminderen van het aantal reacties van de kant en verbeteren van de stabiliteit en rendement van ester tussenproducten22,23.
Hier beschrijven we een protocol voor het synthetiseren van lipide-polymer plCSA-gerichte nanodeeltjes. Ten eerste wordt de-voor-stapmodus ultrasoonapparaat synthese van DOX-geladen lipide-polymeer nanodeeltjes (DNPs) beschreven. Vervolgens wordt een EDC/NHS bioconjugate techniek voor het genereren van lipide-polymer plCSA-BP-geconjugeerde nanodeeltjes ingevoerd. Deze bioconjugate-techniek kan ook worden gebruikt om conjugaat van andere antistoffen en peptiden aan nanodeeltjes. Ten slotte, beschrijven we de fysisch-chemische eigenschappen en in vitro assay gebruikt voor het karakteriseren van de plCSA-gerichte lipide-polymeer nanodeeltjes. Wij zijn van mening dat deze plCSA-gerichte lipide-polymeer nanodeeltjes een doeltreffend systeem voor de beoogde levering van drugs naar de meeste menselijke kankers en de gerichte levering van lading aan de placenta te behandelen aandoeningen placenta kunnen vormen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereiding van de stamoplossingen
- Bereid een waterige oplossing van 4% ethanol door absolute ethanol 4 mL met 100 mL ultrazuiver water verdunnen. Winkel de oplossing bij 4 ° C.
Opmerking: Ultrapure water wordt gedefinieerd als water zonder verontreinigingen zoals bacteriën, stofdeeltjes, ionen of nucleasen. Ultrazuiver water was een waterzuiveringsinstallatie verkregen met een doel soortelijke weerstand van maximaal 18.2 mΩ·cm, wat betekent lage anionogene besmetting. - Bereid een 1 mg/mL soja lecithine stockoplossing door ontbinding van 20 mg soja lecithine in 20 mL van de waterige oplossing van 4% ethanol. Winkel de soja lecithine stockoplossing bij 4 ° C.
- Bereid een 25 mg/mL DSPE-PEG (2000)-COOH stockoplossing door ontbinding van 100 mg DSPE-PEG-COOH in de waterige oplossing van 4% ethanol 4 mL. Opslaan van de stockoplossing bij-20 ° C.
- Bereid een 10 mg/mL stockoplossing van DOX door ontbinding van 50 mg DOX in 5 mL ultrazuiver water. Bewaar de stockoplossing van DOX bij 4 ° C in het donker.
- Bereid een 2 mg/mL stockoplossing van PLGA door ontbinding van 20 mg PLGA in 10 mL acetonitril. Opslaan van de stockoplossing van de PLGA bij 4 ° C.
Let op: Acetonitril is brandbaar en giftig. Werken met zorg in een zuurkast, en adequate persoonlijke apparatuur zoals Labjassen, latex handschoenen en veiligheidsbril dragen. - Bereid een 0,1 M 2-(morpholino) ethanesulfonic zuur (MES, pH 6.0) stamoplossing door ontbinding van 2,17 g mes in 100 mL ultrazuiver water. Opslaan van de stockoplossing bij 4 ° C.
2. synthese van DNPs
Opmerking: Om te voorkomen dat DOX fotochemische degradatie, alle operaties werden uitgevoerd in het donker.
Nanodeeltjes werden gesynthetiseerd door een eerder gemeld-voor-stapmodus ultrasoonapparaat methode11,13,14.
- Voeg 3 mL van de waterige oplossing van 4% ethanol tot een centrifugebuis steriele 10 mL. Dan, voeg 90 µg van de stockoplossing van soja lecithine, 210 µg van de stockoplossing van DSPE-PEG-COOH en 750 µg van de stockoplossing van DOX tot 3 mL van de waterige oplossing van 4% ethanol.
- Plaats de centrifugebuis in een ijsbad, en plaats het ijsbad op een ultrasone processor.
- Pipetteer met een spuit van 1 mL, 2 mg van de PLGA stockoplossing dropwise (1 druppel/4-6 s) in de centrifugebuis. Ondertussen, bewerk ultrasone trillingen ten de buis met behulp van een ultrasoon processor op een frequentie van 20 kHz en een amplitude van de uitvoer van 30% voor 5 min voor het synthetiseren van de DNPs.
Opmerking: Om te synthetiseren uniforme deeltjes met kleine afmetingen, de snelheid waarmee de PLGA oplossing is droop in de buis moet traag, en bubble generatie moet worden vermeden. - De DNPs zuiveren door het wassen van de bovenstaande oplossing in 0,1 M MES buffer (pH 6.0) 3 keer met behulp van een centrifuge-filter (MWCO, 10 kDa). Centrifugeer bij 4 ° C en 1000 × g gedurende 3 minuten elke keer. Ten slotte, ongeveer 1 mL van MES-opgelost nanodeeltjes moeten blijven.
Opmerking: Dit is een aanvaardbaar stopplaats in de procedure. Zoniet gewend conjugaat peptiden, nanoparticles kan worden gezuiverd door PBS buffer (pH 7.4), en de gezuiverde DNPs kunnen worden achtergelaten bij 4° C in het donker.
3. de vervoeging van peptiden aan DNPs
-
Ester activering
- Toevoegen van 0.4 mg van EDC (eindconcentratie 2 mM) tot 1 mL van DNPs.
- 0,24 mg NHS toevoegen aan de reactie (de definitieve concentratie van 2 mM).
Opmerking: Voor eenvoudige toevoeging van de juiste hoeveelheid EDC en NHS, een stamoplossing kan worden bereid als de reagentia worden ontbonden en onmiddellijk gebruikt. - Mengen van de componenten van de reactie goed en plaats van de reactie op een shaker; reactie voor 30 min - 1 h staan bij kamertemperatuur in het donker.
-
Amine-reactie
- De pH van de buffer voor het gebruik van 7.2-7.5 PBS (20 ×, pH 7.4).
- Voeg 0,5 mg van de plCSA-targeting peptide (plCSA-BP, EDVKDINFDTKEKFLAGCLIVSFHEGKC) aan de reactie-oplossing.
Opmerking: Vóór toevoeging, Los de peptiden in 20% acetonitril. Als peptiden niet oplosbaar, kan ultrasoonapparaat in een bad ultrasoonapparaat nuttig zijn. - Meng de oplossing goed, en plaats dan op een shaker; Laat de reactie te gaan bij 4 ° C's nachts in het donker.
- Plaats van geconjugeerde oplossing in dialyse zakken (MWCO, 3500 Da) te dialyze en te zuiveren van de plCSA-DNPs met PBS (pH 7.4) buffer bij kamertemperatuur gedurende 24 uur in het donker.
Opmerking: Als alternatief, reiniging kan worden uitgevoerd zoals in stap 2.4 plCSA-DNPs krijgen. - Voor cel cultuur toepassingen, de gereconstitueerde oplossing wordt gefiltreerd door een 0,22 µm steriele injectiespuit filter verwijderen van potentiële precipitaten.
4. karakterisering van plCSA-gerichte lipide-polymeer nanodeeltjes
-
Meting van de grootte van de hydrodynamische nanoparticle met behulp van Dynamische lichtverstrooiing (DLS)
- Verdunde nanodeeltjes met ultrazuiver water (50-fold verdunning). 500 µL van het monster in een cuvet volgens de instructies van de Distributielijsten of zeta potentieel instrument laden.
Opmerking: Zeta potentieel en DLS cuvettes kunnen verschillen, afhankelijk van de specificaties van het instrument. - Na de meting is voltooid, registreren het deeltje diameter, polydispersiteit index (PDI) en zeta potentiële. Gemiddelde de resultaten van 4 lezingen herhaald, en berekenen van de standaarddeviatie.
- Verdunde nanodeeltjes met ultrazuiver water (50-fold verdunning). 500 µL van het monster in een cuvet volgens de instructies van de Distributielijsten of zeta potentieel instrument laden.
-
Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)
Opmerking: De morfologie van de nanodeeltjes werd waargenomen door TEM met de negatieve vlek-methode. 24- Verdunde nanodeeltjes met ultrazuiver water (400-fold verdunning). Voeg 20 µL van het monster op een raster van TEM, en laten zitten voor 5 minuten.
- Voeg 100 µL van 2% (g/v) phosphotungstic zuur en laat het zitten voor 2 min. Wick weg de druppel.
- Het raster TEM bij kamertemperatuur drogen.
- De spanning van de versnelling TEM vastgesteldop 80 kV, en vergroten van de afbeelding aan 100.000 × te visualiseren nanoparticles.
-
Bepaling van de doelmatigheid van de inkapseling (EE) en LE
- Standaard curve generatie. Ontbinden van DOX in ultrazuiver water om te bereiden DOX oplossingen van vijf verschillende concentraties: 1 µg/mL, 5 µg/mL, 10 µg/mL, 50 µg Mo/mL en 100 µg/mL. Meten van de absorptie van de oplossingen van DOX 480 nm met een UV-VIS-spectrometer. Het genereren van een standaard curve op basis van de concentraties van DOX.
- 25 µL van nanodeeltjes met 500 µL ultrazuiver water verdunnen. Meten van de absorptie bij 480 nm met een UV-VIS-spectrometer. Bereken de drug concentraties door de standaard curve.
- Bereken de LE met behulp van de volgende vergelijking:
LE = ((hoeveelheid drugs in nanodeeltjes) / (totale gewicht van de materialen)) × 100%. - Bereken de EE met behulp van de volgende vergelijking:
EE = ((hoeveelheid drugs in nanodeeltjes) / (hoeveelheid toegevoegde drug)) × 100%.
-
Meting van de efficiëntie van de conjugatie met behulp van de bicinchoninic zuur (BCA) bepaling 25 , 26 , 27
- Pipetteer 25 µL van standaard peptide oplossingen (tabel 1) of plCSA-DNPs in microplate wells in tweevoud. Voeg 200 µL van het reagens werken aan elk putje en meng de plaat goed op een plaat-shaker voor 30 s.
- De afdekplaat en Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
- Meet de extinctie op 562 nm op een afleesapparaat. Gebruik de gegenereerde standaard curve voor het berekenen van de concentraties van de plCSA van plCSA-DNPs.
- Berekenen van de efficiëntie van de vervoeging met behulp van de volgende vergelijking:
Vervoeging efficiëntie = ((bedrag van peptide in nanodeeltjes) / (hoeveelheid toegevoegde peptide)) × 100%.
| Flacon | Hoeveelheid oplosmiddel (l) | Volume en bron van peptide (l) | Uiteindelijke peptide concentratie (μg/mL) |
| A | 0 | 300 voorraad | 1000 |
| B | 250 | 250 van flacon een verdunning | 500 |
| C | 250 | 250 flacon B verdunning | 250 |
| D | 250 | 250 flacon C verdunning | 125 |
| E | 300 | 200 flacon D verdunning | 50 |
| F | 250 | 250 flacon E verdunning | 25 |
| G | 400 | 100 van flacon F verdunning | 5 |
| H | 500 | 0 | 0 |
Tabel 1. Bereiding van standaard peptiden
5. fluorescentie microscopie beoordelingvan de plCSA-gerichte Nanoparticle opname in de cellen van de Choriocarcinoma (JEG3)
- Zaad van cellen op steriele 12-Wells-platen op 1.0 × 104 cellen per putje met volledige DMEM/F12 (cDMEM/F12, met 1% penicilline/streptomycine en 10% foetale runderserum (FBS)). De cellen groeien tot 60% samenkomst bij 37 ° C en 5% CO2 onder vochtige omstandigheden toestaan.
- Verwijder het medium, en voeg 1 mL koud vers media met de inhoud van een laag serum (5% FBS) en DNPs of plCSA-DNPs (5 µg DOX equivalent).
- Incubeer het mengsel van cellen en nanodeeltjes bij 4 ° C gedurende 1 uur.
- Na incubatie, verwijder het medium, en wassen van de cellen drie keer met PBS. Vervolgens, voeg 1 mL verse cDMEM/F12 en Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
- Verwijder de cDMEM/F12 en wassen van de cellen drie keer met PBS.
- Voeg toe 2 mL koude 4% paraformaldehyde (PFA) en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten de cellen vast te stellen.
- Verwijder de PFA. De cellen met 2 mL PBS keer wassen. Voeg 1 mL PBS met DAPI (1 µg/mL) voor kernen kleuring, en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
- De PBS gecombineerd, en wassen van de cellen drie keer met PBS.
- Voeg montage medium, en het beeld van de fluorescentie met een fluorescentie microscopie, groene en blauwe kanalen gebruiken om te visualiseren de DOX en kernen, respectievelijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dit protocol, PLGA, DSPE-PEG-COOH en soja lecithine zijn een representatieve polymeer, lipide-PEG-COOH conjugaat lipide, respectievelijk en. De synthese van plCSA-gerichte lipide-polymeer nanodeeltjes via een-voor-stapmodus ultrasoonapparaat methode en een EDC/NHS-techniek wordt geïllustreerd in Figuur 1. Eerst, ultrasoonapparaat voorwaarden, soja lecithine, PLGA en DSPE-PEG-COOH zelf monteren aan formulier core-shell gestructureerd DNPs. De kern bestaat uit PLGA en ingekapselde DOX, de shell bestaat uit DSPE-PEG-COOH en de soja lecithine enkelgelaagde ligt aan de interface van de shell en de kern. Vervolgens werden de - COOH groepen blootgesteld aan de oppervlakte van DNP geconjugeerd met de -NH2 groepen van de peptide via de EDC/NHS techniek voor het synthetiseren van plCSA-DNPs.
De in dit protocol opgesteld DNPs waren 82.3 ± 4,7 nm in diameter, en na conjugatie met plCSA-BP, de diameter van de primaire DNPs verhoogd tot 109.3 ± 5,9 nm (Figuur 2). De PDI DNPs en plCSA-DNPs was 0.127±0.005 en 0.134 ± 0,065, respectievelijk. TEM beelden van de DNPs en plCSA-DNPs toonde ook aan dat de deeltjes werden goed verspreid en in het algemeen had sferische morphologies (Figuur 3). Het potentieel van de zeta van de DNPs en plCSA-DNPs was-20.1 ± 1,32 mV en-29.9 ± 3.56 mV, respectievelijk (tabel 2). Vandaar worden deze nanodeeltjes voorspeld zeer stabiel te zijn.
| Nanodeeltjes | Diameter(nm) | PDI | Zeta potentiële (mV) |
| DNPs | 82.3±4.7 | 0.127±0.005 | -20.1±1.32 |
| plCSA-DNPs | 109.3±5.9 | 0.134±0.065 | -29.9±3.56 |
| PDI:polydispersity index. Gegevens zijn gemiddelde ± SD gepresenteerd (n = 3). | |||
Tabel 2. Karakterisering van nanodeeltjes
De EE en LE van nanodeeltjes zijn belangrijk voor klinische toepassingen. De EE van DOX door de DNPs en plCSA-DNPs was 40.3 ± 1,67 tot 39,5 ± 1,94%, respectievelijk. De LE van DOX in de DNPs en plCSA-DNPs was 6.2 ± 0,74% en 5.1 ± 0,42%, respectievelijk. Deze gegevens bleek dat de omvang van het laden van de drug en drug inkapseling na plCSA-BP decoratie werd gehandhaafd. De efficiëntie van de decoratie van plCSA-BP op het oppervlak van DNPs werd bepaald door de BCA assay (Figuur 4). De efficiëntie van de geconjugeerde plCSA-BP bleek te zijn 45.5 ± 3,7%.
De bepaling van de cellulaire opname JEG3 aangegeven dat de plCSA-DNPs snel aan de JEG3 cellen binnen 30 min (Figuur 5 gebonden). PlCSA-BP was daarom efficiënt geconjugeerd aan de oppervlakte van de DNP in dit protocol. Bovendien kan plCSA-BP snel binden aan JEG3 cellen en verhogen de cellulaire opname van de nanodeeltjes.
Figuur 1. Schematische illustratie van de methode die wordt gebruikt voor het synthetiseren van lipide-polymer plCSA-gerichte nanodeeltjes. Eerst een-voor-stapmodus ultrasoonapparaat methode werd gebruikt voor het synthetiseren van lipide-polymeer nanodeeltjes (DNPs), en vervolgens de EDC/NHS techniek werd gebruikt om conjugaat peptiden op de oppervlakken van de nanoparticle (plCSA-DNPs). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Het formaat van de verdeling van de verschillende nanodeeltjes. Hydrodynamische grootte van DNPs (A) en plCSA-DNPs (B) gemeten door DLS. Representatieve cijfers worden om aan te tonen van de deeltjesgrootte en de grootteverdeling. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. Nanoparticle morfologie gekenmerkt door TEM. Typische TEM beeld van DNPs (A) en plCSA-DNPs b waargenomen met 2% phosphotungstic zuur kleuring. Schaal bar = 100 nm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. Meting van de efficiëntie van de conjugatie met behulp van de BCA-assay. Standaard curve van de peptiden op 562 nm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5. Nanoparticle opname door cellen JEG3. JEG3 cellen werden geanalyseerd door fluorescentie microscopie na 30 min van incubatie met 5 µg/mL verschillende nanodeeltjes. Rood: DOX, blauw: DAPI-geëtiketteerden kernen. Schaal bar = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol biedt een efficiënte en reproduceerbare methode voor de synthese van plCSA-BP-geconjugeerde lipide-polymeer nanodeeltjes. De methode-voor-stapmodus ultrasoonapparaat te bereiden lipide-polymeer nanodeeltjes is snelle, reproduceerbare en verschilt van de typische nanoprecipitation methoden waarbij Verwarming, vortexing of verdamping. Vandaar, de ontwikkelde methode vermindert het installatieprogramma de synthese-tijd. Bovendien, is de EDC/NHS-bioconjugate gebruikt in dit protocol een algemeen gebruikte en gemakkelijke techniek om conjugaat peptiden en antilichamen tegen nanodeeltjes. Dus, de combinatie van de-voor-stapmodus ultrasoonapparaat methode met de EDC/NHS bioconjugate techniek voor het synthetiseren van lipide-polymer plCSA-targeting nanodeeltjes kan worden opgeschaald voor klinische toepassingen.
Bepaalde procedures zijn essentieel voor succesvol synthese en karakteriseren van plCSA-DNPs. De relatieve concentraties van lecithine, PLGA en DSPE-PEG-COOH Bepaal eerst de lipide-polymeer nanoparticle grootte en polydispersiteit. Wanneer de concentratie van lecithine is vastgesteld, een hogere concentratie van DSPE-PEG-COOH resulteert in lagere polydispersiteit en een kleinere omvang van de nanoparticle,13,15 , die bijgevolg de drug LE vermindert. Wanneer de concentratie van PLGA is vastgesteld, wordt meer DSPE-PEG-COOH vervangen door lecithine, wat leidt tot hogere nanoparticle polydispersiteit en grotere nanoparticle grootte15. In deze situatie zijn de nanodeeltjes meer instabiele en statistische gemakkelijk. In dit protocol, de DSPE-PEG-COOH/PLGA-gewichtsverhouding is 0.11 en de massaverhouding van lecithine/DSPE-PEG-COOH is 0,43. De grootte van de nanoparticle lipide-polymeer is ongeveer 82 nm met een PDI van ongeveer 0.127.
Ten tweede, de pH van de oplossing tijdens de vervoeging van de peptiden aan nanoparticles is van het allergrootste belang. De optimale pH van ester activering is 5.0-6.0, en de reactie van de amine is optimaal bij pH 7,2-7,519,28,29. Voor de beste resultaten moet de reactie in twee stappen worden uitgevoerd. Eerst, ester activering treedt in MES (of een andere noncarboxylate, nonamine buffer) op pH 5.0-6.0. Vervolgens wordt de pH aangepast tot 7.2-7.5 met PBS (of een ander nonamine buffer) onmiddellijk vóór de reactie met de amine-bevattende molecuul19. Gezien het feit dat de halfwaardetijd van NHS esters 4-5 h bij pH 7.019, de duur van de amine reactie langer is dan 10 uur bij 4 ° C.
De laatste kritieke factor is nanoparticle opname. Nontargeted opname van DNPs door JGE3 cellen werd uitgeschakeld in een functie-analyse van de gerichte opname door het beheersen van de cultuur-tijd en temperatuur en de concentratie van FBS in het medium. In dit protocol, JEG3 cellen werden geïncubeerd met 5% FBS bij 4 ° C gedurende 1 h, en vervolgens gekweekt bij 37 ° C gedurende 30 minuten om te minimaliseren van DNP cellulaire opname.
Als er zich problemen tijdens de procedure voordoen, zijn er drie belangrijke stappen voor probleemoplossing in verband met de synthese en de karakterisering van plCSA-DNPs. Eerst, lipide-polymeer nanodeeltjes werden voorbereid door de zelf-assemblage van PLGA en lecithine ultrasoonapparaat omstandigheden. PLGA lost alleen in organisch oplosmiddel. Vandaar, op toevoeging aan een hydrofiele oplosmiddel, PLGA precipitaten snel in kleine nanodeeltjes. Om te minimaliseren van het effect van de snelheid van de dropwise toevoeging en vermijden het genereren van grotere deeltjes, is ultrasoonapparaat van het mengsel gedurende 1-2 minuten voordat u toevoegt PLGA noodzakelijk. Ten tweede, hoewel de kwantitatieve analyse van de plCSA-BP vervoeging efficiëntie met behulp van de BCA-methode is snel en handig, een krachtige vloeibare chromatografie (HPLC) assay is nauwkeuriger. De experimentele gegevens van HPLC zijn beschreven door onze fractie-11 en anderen3231,30,. Tot slot, de optimale voorwaarden voor plCSA-DNP cellulaire opname kunnen verschillen voor andere kankercellen. Geleidelijk de FBS concentratie afneemt en steeds meer incubatie bij 37 ° C kunnen helpen bij het bepalen van de optimale omstandigheden.
Een beperking van het protocol is dat de hydrophobicity van drugs de EE van de drugs bepaalt. Vergeleken met hydrofiele drugs, hebben hydrofobe drugs een sterkere affiniteit voor PLGA, wat in een verhoogde drug EE resulteert. In dergelijke gevallen zal de procedures voor de synthese van het lipide-polymer plCSA-gerichte nanodeeltjes moet experimenteel worden onderzocht om te bepalen van de meest efficiënte methode is synthese die in de ideale drug LE en EE resulteert.
Zoals hierboven vermeld, de glycosaminoglycaan plCSA zich specifiek op de meeste kankercellen en placenta trophoblasts. Daarom is het belangrijk op te merken dat de plCSA-server met NPs moeten worden gebruikt voor de gerichte levering van therapeutics aan tumorcellen bij alleen nonpregnant dieren en mensen, en dat deze drugs-geladen deeltjes zou leiden tot bijwerkingen in de placenta van drachtige dieren en mens.
Kortom, hebben wij beschreven een eenvoudige en handige methode om te synthetiseren lipide-polymer plCSA-gerichte nanodeeltjes. De betekenis van dit protocol is dat het verhoogt de beschikbaarheid van de drug tegen tumoren en de placenta, terwijl het minimaliseren van de daarmee gepaard gaande toxiciteit. Deze aanpak moet nuttig zijn voor de beoogde levering van drugs aan tumoren en placenta en voor te bereiden op plCSA-gerichte lipide-polymeer nanodeeltjes klinische toepassingen in de toekomst kan worden opgeschaald.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
X.F. en B.Z. zijn de uitvinders op het octrooi PCT/CN2017/108646 en 201710906587.6 afkomstig van SIAT dat betrekking heeft op een plCSA-gerichte nanoparticle synthese methode en de toepassing. Geen potentiële belangenconflicten werden onthuld door de andere auteurs.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door subsidies van de nationale sleutel-onderzoek en ontwikkeling programma van China (2016YFC1000402), de nationale stichting van de natuurwetenschappen (81571445 en 81771617) en de Natural Science Foundation van Guangdong provincie (2016A030313178) op X.F. en de Shenzhen Basic onderzoeksfonds (JCYJ20170413165233512) naar X.F.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plCSA peptide | Shanghai GL Biochem | 573518 | for peptide synthesis |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical | 10009218 | for nanoparticles synthesis |
| Soybean lecithin | Avanti Polar Lipids | 441601 | for nanoparticles synthesis |
| DSPE-PEG-COOH | Avanti Polar Lipids | 880125 | for nanoparticles synthesis |
| Doxorubicin | JKChemical | 113424 | for nanoparticles synthesis |
| Acetonitrile | Shanghai Lingfeng | 1008621 | for nanoparticles synthesis |
| PLGA | Sigma-Aldrich | 719897 | for nanoparticles synthesis |
| Ultrasonic processor | Sonics | VCX130 | for nanoparticles synthesis |
| Centrifuge filter (MWCO 10 kDa) | Millipore | UFC801024 | for nanoparticles purification |
| centrifuge | Sigma | 3-18KS | for nanoparticles purification |
| 2-[morpholino]ethanesulfonic acid(MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | for peptide conjugation |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | 3450 | for peptide conjugation |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 56480 | for peptide conjugation |
| Dialysis bags | Spectrum | 132592T | for nanoparticles purification |
| PBS | Hyclone | SH30028.01 | for cell culture |
| 10 mL centrifuge tubes, polypropylene | Aladdin | S-025 | for nanoparticles synthesis |
| 15 mL centrifuge tubes, polypropylene | Corning | 430791 | for various applications |
| 0.22 μm sterile syringe filter | Millipore | SLGV033RB | for nanoparticles purification |
| 1 ml syringe, polypropylene | BD | 328421 | for nanoparticles synthesis |
| Malvern Zetasizer | Malvern | Nano ZS | for particle size analyer |
| Phosphotungstic acid | for TEM | ||
| TEM grid | EMCN | BZ10024a | for TEM |
| UV-VIS spectrometer | Leagene | DZ0035 | for TEM |
| Transmission electron microscope |
JEOL | JEM-100CXII | for particle size analyer |
| BCA reagent A | Thermo Fisher Scientific | 23228 | for BCA assay |
| BCA reagent B | Thermo Fisher Scientific | 23224 | for BCA assay |
| 96-Well Plates | Corning | 3599 | for BCA assay |
| Plate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan™ GO | for BCA assay |
| 12-well plates | Corning | 3513 | for cell culture |
| JEG3 cell | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | TCHu195 | Human placenta |
| DMEM/F12 | Hyclone | SH30272.01 | phenol red-free |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10100 | for cell culture |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO | 15070063 | for cell culture |
| Fluorescence microscope | OLYMPUS | CKK53 | for celluar uptake |
| Paraformaldehyde | Shanghai Lingfeng | 1372021 | for celluar uptake |
| DAPI | Sangon Biotech | A606584 | for celluar uptake |
| Mounting medium | Life | P36961 | for celluar uptake |
References
- Davis, M. E., Shin, D. M. Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (9), 771 (2008).
- Nie, S., Xing, Y., Kim, G. J., Simons, J. W. Nanotechnology applications in cancer. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 257-288 (2007).
- Jabir, N. R., et al. An overview on the current status of cancer nanomedicines. Current Medical Research and Opinion. 34 (5), 911-921 (2018).
- Pillai, G. Nanomedicines for Cancer Therapy: An Update of FDA Approved and Those under Various Stages of Development. SOJ Pharmacy & Pharmaceutical Sciences. 1 (2), 1-13 (2014).
- Marta, T., Luca, S., Serena, M., Luisa, F., Fabio, C. What is the role of nanotechnology in diagnosis and treatment of metastatic breast cancer? Promising Scenarios for the Near Future. Journal of Nanomaterials. 2016, e5436458 (2016).
- Dasari, S., Tchounwou, P. B. Cisplatin in cancer therapy: molecular mechanisms of action. European journal of Pharmacology. 740, 364-378 (2014).
- Brigger, I., Dubernet, C., Couvreur, P. Nanoparticles in cancer therapy and diagnosis. Advanced Drug Delivery Reviews. 64, 24-36 (2012).
- Steichen, S. D., Caldorera-Moore, M., Peppas, N. A. A review of current nanoparticle and targeting moieties for the delivery of cancer therapeutics. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 48 (3), 416-427 (2013).
- Salanti, A., et al. Targeting human cancer by a glycosaminoglycan binding malaria protein. Cancer Cell. 28 (4), 500-514 (2015).
- Seiler, R., et al. An Oncofetal Glycosaminoglycan Modification Provides Therapeutic Access to Cisplatin-resistant Bladder Cancer. European Urology. 72 (1), 142-150 (2017).
- Zhang, B., et al. Targeted delivery of doxorubicin by CSA-binding nanoparticles for choriocarcinoma treatment. Drug Delivery. 25 (1), 461-471 (2018).
- Zhang, B., et al. Placenta-specific drug delivery by trophoblast-targeted nanoparticles in mice. Theranostics. 26 (2), 130-137 (2018).
- Zhang, L., et al. Self-assembled lipid--polymer hybrid nanoparticles: a robust drug delivery platform. ACS Nano. 2 (8), 1696-1702 (2008).
- Zheng, M., et al. Single-step assembly of DOX/ICG loaded lipid-polymer nanoparticles for highly effective chemo-photothermal combination therapy. ACS. 7 (3), 2056-2067 (2013).
- Fang, R. H., Aryal, S., Hu, C. -M. J., Zhang, L. Quick synthesis of lipid− polymer hybrid nanoparticles with low polydispersity using a single-step sonication method. Langmuir. 26 (22), 16958-16962 (2010).
- Gu, L., et al. Folate-modified, indocyanine green-loaded lipid-polymer hybrid nanoparticles for targeted delivery of cisplatin. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 28 (7), 690-702 (2017).
- Mandal, B., Mittal, N. K., Balabathula, P., Thoma, L. A., Wood, G. C. Development and in vitro evaluation of core-shell type lipid-polymer hybrid nanoparticles for the delivery of erlotinib in non-small cell lung cancer. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 81, 162-171 (2016).
- Shi, T., et al. Enhanced legumain-recognition and NIR controlled released of cisplatin-indocyanine nanosphere against gastric carcinoma. European Journal of Pharmacology. 794, 184-192 (2017).
- Grabarek, Z., Gergely, J. Zero-length crosslinking procedure with the use of active esters. Analytical Biochemistry. 185 (1), 131-135 (1990).
- Hadjipanayis, C. G., et al. EGFRvIII Antibody-Conjugated Iron Oxide Nanoparticles for Magnetic Resonance Imaging-Guided Convection-Enhanced Delivery and Targeted Therapy of Glioblastoma. Cancer Research. 70 (15), 6303-6312 (2010).
- Sadhukha, T., Wiedmann, T. S., Panyam, J. Inhalable magnetic nanoparticles for targeted hyperthermia in lung cancer therapy. Biomaterials. 34 (21), 5163-5171 (2013).
- Jennings, M., Nicknish, J. Localization of a site of intermolecular cross-linking in human red blood cell band 3 protein. Journal of Biological Chemistry. 260 (9), 5472-5479 (1985).
- Staros, J. V. N-hydroxysulfosuccinimide active esters: bis(N-hydroxysulfosuccinimide) esters of two dicarboxylic acids are hydrophilic, membrane-impermeant, protein cross-linkers. Biochemistry. 21 (17), 3950-3955 (1982).
- Valencia, P. M., et al. Single-step assembly of homogenous lipid− polymeric and lipid− quantum dot nanoparticles enabled by microfluidic rapid mixing. ACS. 4 (3), 1671-1679 (2010).
- Altintas, I., et al. Nanobody-albumin nanoparticles (NANAPs) for the delivery of a multikinase inhibitor 17864 to EGFR overexpressing tumor cells. Journal of Controlled Release. 165 (2), 110-118 (2013).
- Maya, S., et al. Cetuximab conjugated O-carboxymethyl chitosan nanoparticles for targeting EGFR overexpressing cancer cells. Carbohydrate Polymers. 93 (2), 661-669 (2013).
- Deepagan, V. G., et al. In vitro targeted imaging and delivery of camptothecin using cetuximab-conjugated multifunctional PLGA-ZnS nanoparticles. Nanomedicine. 7 (4), 507-519 (2012).
- Totaro, K. A., et al. Systematic investigation of EDC/sNHS-mediated bioconjugation reactions for carboxylated peptide substrates. Bioconjugate Chemistry. 27 (4), 994-1004 (2016).
- Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions. Mass Spectrometry Reviews. 25 (4), 663-682 (2006).
- Zhang, B., et al. LDLR-mediated peptide-22-conjugated nanoparticles for dual-targeting therapy of brain glioma. Biomaterials. 34 (36), 9171-9182 (2013).
- Koren, E., Apte, A., Sawant, R. R., Grunwald, J., Torchilin, V. P. Cell-penetrating TAT peptide in drug delivery systems: proteolytic stability requirements. Drug Delivery. 18 (5), 377-384 (2011).
- Chu, Y., et al. Topical ocular delivery to laser-induced choroidal neovascularization by dual internalizing RGD and TAT peptide-modified nanoparticles. International Journal of Nanomedicine. 12, 1353-1368 (2017).
