Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Synthese von Plazenta Chondroitinsulfat A Bindung Peptid (PlCSA-BP)-konjugiert Lipid-Polymer Nanopartikel über einstufigen Beschallung und Bioconjugate Techniken. Diese Partikel bilden ein neuartiges Instrument für die gezielte Bereitstellung von Therapeutika, die meisten menschlichen Tumoren und Plazenta Trophoblasten zur Behandlung von Krebserkrankungen und plazentare Störungen.
Abstract
Eine wirksame Krebs therapeutische Methode reduziert und beseitigt Tumoren mit minimaler systemischer Toxizität. Aktiv targeting Nanopartikel bieten einen vielversprechenden Ansatz in der Krebstherapie. Plazentar Chondroitinsulfat Glykosaminoglykan (PlCSA) drückt sich auf einer Vielzahl von Krebszellen und Plazenta Trophoblasten und Malaria Protein, das VAR2CSA speziell an PlCSA binden können. Eine gemeldete plazentar Chondroitinsulfat A Bindung Peptid (PlCSA-BP), abgeleitet von Malaria Protein VAR2CSA, kann auch speziell an PlCSA auf Krebszellen und Plazenta Trophoblasten binden. Infolgedessen konnte PlCSA-BP-konjugiert Nanopartikel als Instrument zur zielgerichteten Wirkstoffabgabe menschlichen Krebserkrankungen und Plazenta Trophoblasten eingesetzt werden. In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode zu synthetisieren, PlCSA-BP-konjugiert Lipid-Polymer Nanopartikel geladen mit Doxorubicin (PlCSA-DNPs); die Methode besteht aus einer einzigen Beschallung Schritt und Bioconjugate Techniken. Darüber hinaus werden verschiedene Methoden zur Charakterisierung von PlCSA-DNPs, einschließlich der Bestimmung ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften und zelluläre Aufnahme durch plazentare Choriocarcinoma (JEG3) Zellen beschrieben.
Introduction
Eine wirksame Krebs therapeutische Methode reduziert und beseitigt Tumoren mit minimaler systemischer Toxizität. Daher ist die selektive Tumor targeting der Schlüssel zum erfolgreiche therapeutischen Methoden zu erforschen. Nanopartikel bieten eine vielversprechende Möglichkeit für die Krebstherapie und molekulare Baugruppen mit unterschiedlichen Funktionsgruppen Wirksamkeit von Medikamenten zu verbessern und reduzieren damit verbundenen Nebenwirkungen1,2. Darüber hinaus nutzen Nanopartikel Systeme vor allem passive und aktive targeting um Ziel Tumoren3zu erreichen.
Passive targeting nutzt die angeborenen Eigenschaften von Nanopartikeln und verbesserte Durchlässigkeit und Aufbewahrung (EPR) Effekte, Tumorzellen zu erreichen. Kationische Liposomen sind erfolgreich benutzt worden, Tumore in klinische Anwendungen4,5,6verschiedene Krebsmedikamente anzubieten. Trotz der potenziellen wirksam Krebs therapeutische Wirkung eine geringe Wirkstoffkonzentration in der tumorregion und der Unfähigkeit, Tumorzellen von normalen Zellen zu unterscheiden sind zwei wesentliche Einschränkungen des passiv-targeting Nanopartikel7.
Aktive targeting-Strategien nutzen Sie Antigen-Antikörper, Ligand-Rezeptor und andere molekulare Erkennung Interaktionen gezielt Medikamente an Tumoren8liefern. Plazentar Chondroitinsulfat Glykosaminoglykan (PlCSA) drückt sich im großen und ganzen auf die meisten Krebszellen und Plazenta Trophoblasten. Darüber hinaus können die Malaria Protein VAR2CSA speziell an PlCSA9,10binden. Daher kann VAR2CSA ein Werkzeug für das targeting von menschlichen Krebszellen sein. Wenn VAR2CSA mit Nanopartikeln konjugiert wird, kann das Full-Length Protein jedoch das Eindringen von Nanopartikeln in Tumorzellen einschränken. Kürzlich entdeckten wir eine PlCSA Bindung Peptid (PlCSA-BP), abgeleitet von der Malaria Protein VAR2CSA. PlCSA-BP-konjugiert Lipid-Polymer Nanopartikel rasch auf Choriocarcinoma Zellen und deutlich erhöhte Doxorubicin (DOX) Anti-Krebs-Aktivität in Vivo11gebunden; Diese Partikel auch speziell auf Plazenta Trophoblasten gebunden und als ein Instrument für die gezielte Abgabe von Medikamenten auf die Plazenta12dienen könnte.
Lipid-Polymer Nanopartikel bestehen aus einer Lipid-Monolayer-Shell und einer hydrophoben Polymeren Kern und repräsentieren einen neuen Träger für Drug-Delivery. Diese Nanopartikel verbinden die Vorteile von Liposomen und Polymeren darin, z. B. steuerbare nanopartikelgröße hohe Biokompatibilität, nachhaltiger Wirkstofffreisetzung, hohe Medikament laden Effizienz (LE) und ausgezeichnete Stabilität13. In dieser Arbeit haben wir eine einstufigen Beschallung Methode Lipid-Polymer Nanopartikel synthetisieren. Diese Methode ist schnell, bequem und Scale-up geeignet und ist am meisten benutzt Lipid-Polymer Nanopartikel Vorbereiten von unserer Gruppe11,14 u. a.15,16,17,18 .
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) Carbodiimide Hydrochlorid (EDC) ist eine beliebte Carbodiimide als ein Vernetzungsmittel für Biomoleküle mit Aminen und Carboxylates19Konjugation verwendet. Neben EDC ist N-Hydroxysulfosuccinimide (NHS) das am weitesten verbreitete Konjugation Reagenz in Oberfläche und Nanopartikel Konjugation Reaktionen20,21. NHS kann reduzieren die Anzahl der Nebenreaktionen und verbessern die Stabilität und Ausbeute an Ester Zwischenprodukte22,23.
Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Synthese von PlCSA gezielt Lipid-Polymer Nanopartikel. Erstens wird die einstufigen Beschallung Synthese von DOX-geladene Lipid-Polymer-Nanopartikeln (DNPs) beschrieben. Dann wird eine EDC/NHS Bioconjugate Technik zur Erzeugung von PlCSA-BP-konjugiert Lipid-Polymer Nanopartikel eingeführt. Diese Bioconjugate Technik kann auch verwendet werden, andere Antikörper und Peptide mit Nanopartikeln zu konjugieren. Schließlich beschreiben wir die physikalisch-chemischen Eigenschaften und in-vitro- Assay verwendet, um die PlCSA ausgerichtete Lipid-Polymer Nanopartikel charakterisieren. Wir glauben, dass diese PlCSA gezielt Lipid-Polymer Nanopartikel ein effektives System für die gezielte Gabe von Medikamenten, um die meisten menschlichen Krebserkrankungen und die gezielte Bereitstellung von Nutzlasten der Plazenta zu plazentare Störungen zu behandeln sein könnte.
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Protocol
1. Vorbereitung der Stammlösungen
- Bereiten Sie eine wässrige Lösung von 4 % Ethanol durch Verdünnung 4 mL absolutes Ethanol mit 100 mL Reinstwasser. Die Lösung bei 4 ° c Lagern
Hinweis: Reinstwasser bezeichnet Wasser ohne Verunreinigungen wie Bakterien, Partikel, Ionen oder Nukleasen. Reinstwasser aus eine Wasseraufbereitungsanlage mit einem Ziel-Widerstand von bis zu 18,2 mΩ·cm, d.h. geringe anionischen Belastung ermittelt. - Bereiten Sie eine 1 mg/mL Soja-Lecithin-Stammlösung durch Auflösen von 20 mg Soja-Lecithin in 20 mL der wässrigen Lösung von 4 % Ethanol. Lagern Sie Soja-Lecithin-Stammlösung bei 4 ° c
- Bereiten Sie eine 25 mg/mL DSPE-PEG (2000)-COOH Stammlösung durch Auflösen 100 mg DSPE-PEG-COOH in 4 mL der wässrigen Lösung von 4 % Ethanol. Speichern der Stammlösung bei-20 ° C.
- Bereiten Sie eine 10 mg/mL DOX Stammlösung durch Auflösen von 50 mg in 5 mL Reinstwasser DOX. Speichern Sie die DOX-Stammlösung bei 4 ° C im Dunkeln.
- Bereiten Sie 2 mg/mL durch Auflösen von 20 mg in 10 mL Acetonitril PLGA PLGA-Stammlösung vor. Speichern der PLGA-Stammlösung bei 4 ° C.
Achtung: Acetonitril ist brennbar und giftig. Arbeiten mit Sorgfalt in einer Dampfhaube und entsprechende persönliche Ausrüstung, wie Laborkittel, Schutzbrille und Handschuhe aus Latex zu tragen. - Bereiten Sie eine 0,1 M 2-(morpholino) Ethanesulfonic Säure (MES, pH 6.0) Stammlösung durch MES 2,17 g in 100 mL hochreines Wasser auflösen. Speichern der Stammlösung bei 4 ° C.
2. Synthese von DNPs
Hinweis: Zur Vermeidung von DOX photochemischen Abbau wurden alle Vorgänge in der Dunkelheit durchgeführt.
Nanopartikel synthetisiert wurden durch eine zuvor gemeldeten Einzelschritt Beschallung Methode11,13,14.
- Eine sterile 10 mL Zentrifugenröhrchen 3 mL der wässrigen Lösung von 4 % Ethanol hinzufügen. Fügen Sie dann 90 µg der Vorratslösung Soja Lecithin, 210 µg der DSPE-PEG-COOH Vorratslösung und 750 µg der Vorratslösung DOX bis 3 mL der wässrigen Lösung von 4 % Ethanol.
- Legen Sie die Zentrifugenröhrchen in ein Eisbad, und platzieren Sie das Eisbad auf einem Ultraschall-Prozessor.
- Mit einer 1 mL Spritze pipette 2 mg der PLGA Vorratslösung tropfenweise (1 Tropfen/4-6 s) in die Zentrifugenröhrchen. In der Zwischenzeit, Beschallen Sie die Röhre mit einem Ultraschall-Prozessor bei einer Frequenz von 20 kHz und einer Ausgabe Amplitude von 30 % für 5 min die DNPs synthetisieren.
Hinweis: Um einheitliche Partikel mit kleinen Größen zu synthetisieren, muss die Geschwindigkeit bei der PLGA-Lösung in das Röhrchen getropft ist langsam und Blase sollte vermieden werden. - Reinigen Sie die DNPs durch Waschen die obige Lösung in 0,1 M-MES-Puffer (pH 6.0) 3 Mal mit einer Zentrifuge Filter (MWCO, 10 kDa). Zentrifuge bei 4 ° C und 1000 × g für 3 min jedes Mal. Zu guter Letzt sollte etwa 1 mL der Nanopartikel MES gelöst bleiben.
Hinweis: Dies ist eine akzeptable Haltepunkt in der Prozedur. Wenn nicht verwendet, um Peptide zu konjugieren, Nanopartikel können durch PBS-Puffer (pH 7,4) gereinigt werden, und die gereinigten DNPs können bei 4° C im Dunkeln gelagert werden.
(3) Konjugation von Peptiden, DNPs
-
Ester-Aktivierung
- Hinzufügen von 0,4 mg von EDC (Endkonzentration 2 mM), 1 mL DNPs.
- Die Reaktion 0,24 mg des NHS hinzufügen (Endkonzentration 2 mM).
Hinweis: Für einfache Zugabe der richtigen Menge an EDC und NHS, kann eine Stammlösung hergestellt werden, wenn die Reagenzien sind aufgelöst und sofort verwendet werden. - Mischen Sie die reaktionskomponenten gut, und legen Sie die Reaktion auf einen Shaker; lassen Sie Reaktion für 30 min - 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln.
-
Amin-Reaktion
- Erhöhen Sie den Puffer pH-Wert auf 7.2-7.5 mit PBS (20 ×, pH 7.4).
- Die Reaktionslösung 0,5 mg des PlCSA-targeting Peptids (PlCSA-BP, EDVKDINFDTKEKFLAGCLIVSFHEGKC) hinzufügen.
Hinweis: Vor der Zugabe, lösen Sie die Peptide in 20 % Acetonitril auf. Wenn Peptide nicht auflösbar sind, kann Ultraschall in einem Bad sonikator hilfreich. - Mischen Sie die Lösung gut und dann auf einen Shaker; lassen Sie die Reaktion bei 4 ° C über Nacht im Dunkeln vorzugehen.
- Dialysebeutel (MWCO, 3.500 Da), Dialyse und Reinigen der PlCSA-DNPs conjugate Lösung setzen mit PBS (pH 7,4) Puffer bei Raumtemperatur für 24 h im Dunkeln.
Hinweis: Alternativ könnte Reinigung wie in Schritt 2.4 zu PlCSA-DNPs durchgeführt werden. - Für Zelle Kultur Anwendungen filtern Sie die rekonstituierte Lösung durch einen 0,22 µm sterile Spritze Filter, mögliche Ausscheidungen zu entfernen.
4. Charakterisierung der PlCSA gezielte Lipid-Polymer Nanopartikel
-
Messung der hydrodynamischen nanopartikelgröße verwenden dynamische Lichtstreuung (DLS)
- Verdünnen Sie Nanopartikel mit Reinstwasser (50-fold Verdünnung). Laden Sie 500 µL der Probe in eine Küvette gemäß den Anweisungen des DLS oder Zeta potential Instruments.
Hinweis: Zeta-Potential und DLS Küvetten können abhängig von dem Instrument den Spezifikationen abweichen. - Nachdem die Messung abgeschlossen ist, notieren Sie die Partikeldurchmesser, Polydispersität Index (PDI) und Zetapotenzial. Durchschnittliche Ergebnisse von 4 Lesungen wiederholt, und die Standardabweichung zu berechnen.
- Verdünnen Sie Nanopartikel mit Reinstwasser (50-fold Verdünnung). Laden Sie 500 µL der Probe in eine Küvette gemäß den Anweisungen des DLS oder Zeta potential Instruments.
-
Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM)
Hinweis: Die Morphologie der Nanopartikel wurde durch TEM mit negativen Fleck-Methode beobachtet. 24- Verdünnen Sie Nanopartikel mit Reinstwasser (400-fold Verdünnung). Fügen Sie 20 µL der Probe auf ein TEM-Raster hinzu und lassen Sie Sie für 5 Minuten sitzen.
- 100 µL von 2 % (w/V) Phosphotungstic Acid und lassen Sie das Droplet für 2 min. Docht entfernt sitzen.
- Trocknen Sie die TEM-Raster bei Zimmertemperatur.
- Legen Sie die Beschleunigungsspannung TEM bei 80 kV, und vergrößern Sie das Bild auf 100.000 ×, die Nanopartikel zu visualisieren.
-
Bestimmung der Kapselung Effizienz (EE) und LE
- Erstellung der Standardkurve. DOX Reinstwasser zur Vorbereitung DOX Lösungen von fünf verschiedenen Konzentrationen zu lösen: 1 µg/mL, 5 µg/mL, 10 µg/mL, 50 µg/mL und 100 µg/mL. Messen Sie die Absorption der DOX Lösungen bei 480 nm mit einem UV-VIS-Spektrometer. Generieren Sie eine Standardkurve basierend auf die DOX-Konzentrationen.
- Verdünnen Sie 25 µL von Nanopartikeln mit 500 µL ultrareinem Wasser. Messen Sie die Absorption bei 480 nm mit einem UV-VIS-Spektrometer. Berechnen Sie die Droge-Konzentrationen der Standardkurve.
- Berechnen Sie LE, die unter Verwendung der folgenden Gleichung:
LE = ((Menge der Medikamente in Nanopartikel) / (Gesamtgewicht Materialien)) × 100 %. - Berechnen Sie die EE unter Verwendung der folgenden Gleichung:
EE = ((Menge der Medikamente in Nanopartikel) / (Menge zugegeben Droge)) × 100 %.
-
Messung der Konjugation Effizienz mit Hilfe des Bicinchoninic Säuren (BCA) Tests 25 , 26 , 27
- Pipette 25 µL standard Peptid-Lösungen (Tabelle 1) oder PlCSA-DNPs in Mikrotestplatte Vertiefungen in zweifacher Ausfertigung. Jedes gut 200 µL des Reagenz arbeiten hinzu, und mischen Sie die Platte auf einer Platte Shaker für 30 s.
- Die Abdeckplatte, und bei 37 ° C für 30 min inkubieren.
- Messung der Extinktion bei 562 nm auf ein Lesegerät, Platte. Die PlCSA Konzentrationen von PlCSA-DNPs berechnen mithilfe der generierten Standardkurve.
- Berechnen Sie die Konjugation Effizienz unter Verwendung der folgenden Gleichung:
Konjugation Effizienz = ((Betrag des Peptids in Nanopartikel) / (Menge zugegeben Peptid)) × 100 %.
| Durchstechflasche | Volumen des Verdünnungsmittels (μL) | Lautstärke und Quelle des Peptids (μL) | Final-Peptid-Konzentration (μg/mL) |
| A | 0 | 300 Aktien | 1000 |
| B | 250 | 250 der Durchstechflasche einer Verdünnung | 500 |
| C | 250 | 250 der Ampulle B Verdünnung | 250 |
| D | 250 | 250 der Durchstechflasche C Verdünnung | 125 |
| E | 300 | Es werden 200 von Fläschchen D Verdünnung | 50 |
| F | 250 | 250 Fläschchen E Verdünnung | 25 |
| G | 400 | 100 Fläschchen F Verdünnung | 5 |
| H | 500 | 0 | 0 |
Tabelle 1. Vorbereitung der Standard Peptide
(5) Fluoreszenz-Mikroskopie Bewertung der PlCSA gezielt Nanopartikel Aufnahme in Choriocarcinoma (JEG3) Zellen
- Zellen auf sterile 12-Well-Platten bei 1.0 × 10 Samen4 Zellen/Brunnen mit kompletten DMEM/F12 (cDMEM/F12, mit 1 % Penicillin/Streptomycin und 10 % fetalen bovine Serum (FBS)). Lassen Sie die Zellen bis zu 60 % Zusammenfluss bei 37 ° C und 5 % CO2 unter feuchten Bedingungen wachsen.
- Entfernen Sie den Datenträger, und 1 mL kalte frische Medien mit einem niedrigen Serum-Gehalt (5 % FBS) und DNPs oder PlCSA-DNPs (5 µg DOX-Äquivalent).
- Inkubieren Sie die Mischung aus Zellen und Nanopartikeln bei 4 ° C für 1 h.
- Entfernen Sie nach der Inkubation den Datenträger, und waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS. Dann fügen Sie 1 mL frisch cDMEM/F12, und inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C für 30 min.
- Entfernen Sie die cDMEM/F12, und waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS.
- Fügen Sie 2 mL kalten 4 % Paraformaldehyd (PFA) und inkubieren Sie bei Raumtemperatur 15 Minuten, die Zellen zu beheben.
- Entfernen Sie die PFA. Waschen Sie die Zellen mit 2 mL PBS einmal. Fügen Sie 1 mL PBS mit DAPI (1 µg/mL) für Kerne Färbung, und in 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Aspirieren der PBS, und die Zellen dreimal mit PBS waschen.
- Fügen Sie Eindeckmittel und Bild der Fluoreszenz mit einem Fluoreszenz-Mikroskopie, mit grünen und blauen Kanäle um die DOX und Kerne, bzw. zu visualisieren.
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Representative Results
In diesem Protokoll PLGA, DSPE-PEG-COOH und Soja Lecithin sind einer repräsentativen Polymer, Lipid-PEG-COOH Konjugat Lipid, bzw.. Die Synthese von PlCSA gezielt Lipid-Polymer Nanopartikel über einen einstufigen Beschallung Methode und einer EDC/NHS-Technik ist in Abbildung 1dargestellt. Zunächst unter Beschallung Bedingungen, Soja Lecithin, PLGA und DSPE-PEG-COOH selbst zusammensetzen, Form Kern-Schale strukturiert DNPs. Der Kern besteht aus PLGA und gekapselte DOX, die Hülle besteht aus DSPE-PEG-COOH und Soja Lecithin Monolage befindet sich an der Schnittstelle zwischen der Schale und dem Kern. Dann wurden die - COOH-Gruppen auf der Oberfläche von DNP ausgesetzt -NH2 Gruppen der Peptid über EDC/NHS-Technik, PlCSA-DNPs synthetisieren konjugiert.
Die DNPs in diesem Protokoll vorbereitet waren 82,3 ± 4,7 nm im Durchmesser, und nach Konjugation, PlCSA-BP, der Durchmesser der primären DNPs vergrößert bis 109.3 ± 5,9 nm (Abbildung 2). Die PDI DNPs und PlCSA-DNPs war 0.127±0.005 und 0.134 ± 0,065, beziehungsweise. TEM-Bilder der DNPs und PlCSA-DNPs zeigte auch, dass Partikel gut verteilt wurden und in der Regel sphärische Morphologien (Abbildung 3 hatten). Das Zetapotential der DNPs und PlCSA-DNPs war-20.1 ± 1,32 mV und-29.9 ± 3,56 mV, bzw. (Tabelle 2). Daher sind diese Nanopartikel voraussichtlich sehr stabil sein.
| Nanopartikel | Diameter(nm) | PDI | Das Zetapotenzial (mV) |
| DNPs | 82.3±4.7 | 0.127±0.005 | -20.1±1.32 |
| PlCSA-DNPs | 109.3±5.9 | 0.134±0.065 | -29.9±3.56 |
| PDI:polydispersity Index. Daten werden Mittelwert ± SD dargestellt (n = 3). | |||
Tabelle 2. Charakterisierung von Nanopartikeln
Die EE und LE von Nanopartikeln sind wichtig für klinische Anwendungen. EE DOX DNPs und PlCSA-DNPs betrug 40,3 ± 1,67 % bzw. 39,5 ± 1,94 %. LE der DOX in die DNPs und PlCSA-DNPs betrug 6,2 ± 0,74 % bzw. 5.1 ± 0,42 %. Diese Daten zeigten, dass das Ausmaß der Droge be- und Droge Kapselung nach PlCSA-BP Dekoration beibehalten wurde. Die Dekoration-Effizienz der PlCSA-BP auf der Oberfläche des DNPs wurde durch die BCA-Assay (Abbildung 4) bestimmt. Die PlCSA-BP Konjugation Effizienz erwies sich 45,5 ± 3,7 %.
Der JEG3-zelluläre Aufnahme-Test ergab, dass PlCSA-DNPs schnell an JEG3 Zellen innerhalb von 30 min (Abbildung 5) gebunden. PlCSA-BP war daher effizient an die DNP-Oberfläche in diesem Protokoll konjugiert. PlCSA-BP könnte darüber hinaus schnell an JEG3 Zellen binden und erhöhen die zelluläre Aufnahme von Nanopartikeln.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Methode verwendet, um PlCSA ausgerichtete Lipid-Polymer Nanopartikel synthetisieren. Erstens eine Einzelschritt-Beschallung-Methode wurde verwendet, um Lipid-Polymer Nanopartikel (DNPs) zu synthetisieren, und dann die EDC/NHS-Technik wurde verwendet, um Peptide, die Nanopartikel-Oberflächen (PlCSA-DNPs) konjugieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Größenverteilung der verschiedenen Nanopartikel. Hydrodynamische Größe DNPs (A) und (B) gemessen von DLS PlCSA-DNPs. Repräsentative Zahlen werden vorgestellt, um die Partikelgröße und Größenverteilung demonstrieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3. Nanopartikel Morphologie gekennzeichnet durch TEM. Typische TEM Bild DNPs (A) und PlCSA-DNPs (B) mit 2 % Phosphotungstic Acid Färbung beobachtet. Maßstabsleiste = 100 nm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4. Messung der Konjugation Effizienz mit der BCA-Test. Standardkurve der Peptide auf 562 nm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5. Nanopartikel Aufnahme durch die Zellen JEG3. JEG3 Zellen wurden durch Fluoreszenz-Mikroskopie nach 30 min Inkubation mit 5 µg/mL verschiedenen Nanopartikeln ausgewertet. Rot: DOX, blau: DAPI-Label Kerne. Maßstabsleiste = 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Dieses Protokoll bietet eine effiziente und reproduzierbare Methode zur Synthese von PlCSA-BP-konjugiert Lipid-Polymer Nanopartikel. Die einstufigen Beschallung Methode, Lipid-Polymer Nanopartikel vorzubereiten ist schnelle, reproduzierbare und unterscheidet sich von typischen Nanoprecipitation Methoden, die Heizung, aufschütteln oder Verdunstung betreffen. Die entwickelte Methode reduziert daher die Synthese-Zeit. Darüber hinaus ist die EDC/NHS Bioconjugate in diesem Protokoll verwendeten eine häufig gebrauchte und günstige Technik Peptide und Antikörper gegen Nanopartikel konjugieren. Daher die Kombination der einstufigen Beschallung-Methode mit der EDC/NHS Bioconjugate Technik, PlCSA-targeting Lipid-Polymere zu synthetisieren können Nanopartikel für klinische Anwendungen skaliert werden.
Bestimmte Verfahren sind entscheidend für erfolgreiche Synthese und Charakterisierung von PlCSA-DNPs. Bestimmen Sie zuerst die relativen Konzentrationen von Lecithin, PLGA und DSPE-PEG-COOH, Lipid-Polymer nanopartikelgröße und Polydispersität. Wenn die Konzentration von Lecithin wird fixiert, eine höhere Konzentration der DSPE-PEG-COOH Ergebnisse in niedriger Polydispersität und eine kleinere nanopartikelgröße,13,15 , das folglich verringert sich die Droge LE. Wenn die Konzentration der PLGA fixiert ist, wird mehr DSPE-PEG-COOH durch Lecithin, ersetzt führt zu höheren Nanopartikel Polydispersität und größeren Nanopartikel Größe15. In diesem Fall die Nanopartikel sind instabil und aggregierte leicht. In diesem Protokoll der DSPE-PEG-COOH/PLGA-Gewichts-Verhältnis ist 0,11 und das Lezithin/DSPE-PEG-COOH Massenverhältnis ist 0,43. Die Lipid-Polymer nanopartikelgröße ist ca. 82 nm mit einem PDI von ca. 0.127.
Zweitens ist der pH-Wert der Lösung während der Konjugation der Peptide, die Nanopartikel von größter Bedeutung. Der optimale pH-Wert der Ester Aktivierung beträgt 5.0-6.0, und die Amin-Reaktion ist am effizientesten zu pH 7,2-7,519,28,29. Um beste Ergebnisse zu erzielen sollte die Reaktion in zwei Schritten durchgeführt werden. Zunächst tritt Ester Aktivierung bei MES (oder ein anderes Noncarboxylate, Nonamine Puffer) bei pH 5,0-6,0. Dann ist der pH-Wert auf 7.2-7.5 mit PBS (oder einem anderen Nonamine-Puffer) unmittelbar vor der Reaktion mit der Amin-haltigen Molekül19eingestellt. Wenn man bedenkt, dass die Halbwertszeit von NHS Ester 4-5 h bei pH 7,019, überschreitet die Dauer der Reaktion Amin 10 h bei 4 ° C.
Der letzte kritische Faktor ist Nanopartikel Aufnahme. Nontargeted Aufnahme von DNPs von JGE3 Zellen schied im eine Funktionsanalyse der gezielten Aufnahme durch die Kontrolle der Kulturzeit und Temperatur und die Konzentration von FBS in das Medium. In diesem Protokoll wurden mit 5 % JEG3 Zellen inkubiert FBS bei 4 ° C für 1 h und dann kultiviert bei 37 ° C für 30 min, DNP zelluläre Aufnahme zu minimieren.
Wenn während der Prozedur Probleme auftreten, gibt es drei wichtige Schritte zur Problembehandlung im Zusammenhang mit der Synthese und Charakterisierung von PlCSA-DNPs. Zunächst bereiteten Lipid-Polymer Nanopartikel durch die Selbstmontage der PLGA und Lecithin unter Beschallung Bedingungen. PLGA löst sich nur in organischen Lösungsmitteln. Daher auf zusätzlich zu einem hydrophilen Lösungsmittel Niederschläge PLGA schnell in kleine Nanopartikel. Minimieren die Auswirkungen der Lichtgeschwindigkeit die tropfenweise Zugabe und vermeiden größere Partikel erzeugen, ist die Beschallung der Mischung für 1 – 2 min. vor dem Hinzufügen von PLGA notwendig. Zweitens: Obwohl Quantitative Analyse der PlCSA-BP Konjugation Effizienz mit der BCA-Methode schnell und bequem ist, ist ein Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)-Assay genauer. Die HPLC experimentelle Details wurden von unserer Gruppe11 und andere30,31,32beschrieben. Schließlich können die optimalen Bedingungen für PlCSA-DNP zelluläre Aufnahme für andere Krebszellen unterscheiden. Allmählich abnehmende die FBS-Konzentration und zunehmende Inkubationszeit bei 37 ° C können dabei helfen, die optimalen Bedingungen zu ermitteln.
Eine Einschränkung des Protokolls ist, dass der Hydrophobie von Drogen die EE der Drogen bestimmt. Verglichen mit hydrophilen Drogen, haben hydrophobe Medikamente eine stärkere Affinität für PLGA, führt zu einer erhöhten Droge EE. In diesen Fällen müssen die Verfahren für die Synthese der PlCSA gezielte Lipid-Polymer Nanopartikel experimentell untersucht werden, um die effizienteste Methode der Synthese zu bestimmen, die das ideale Medikament LE und EE führt.
Wie bereits erwähnt, wird der Glykosaminoglykan-PlCSA speziell auf die meisten Krebszellen und Plazenta Trophoblasten ausgedrückt. Daher ist es wichtig zu beachten, dass die PlCSA-NPs für die gezielte Auslieferung von Therapeutika an Tumorzellen in nur minderwertigerem Tiere und Menschen verwendet werden soll, und dass diese Drogen-geladenen Teilchen zu Nebenwirkungen in der Plazenta von schwangeren Tieren führen würde und Menschen.
Zusammenfassend lässt sich sagen haben wir eine einfache und bequeme Methode, um PlCSA ausgerichtete Lipid-Polymer Nanopartikel synthetisieren beschrieben. Die Bedeutung dieses Protokolls ist, dass es die Verfügbarkeit von Drogen bei Tumoren und der Plazenta, bei gleichzeitiger Minimierung der damit einhergehende Toxizität erhöht. Dieser Ansatz sollte für die gezielte Abgabe von Medikamenten, Tumoren und Plazenta nützlich sein und kann bis auf PlCSA ausgerichtete Lipid-Polymer Nanopartikel für klinische Anwendungen in der Zukunft vorbereiten skaliert werden.
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Disclosures
X.F. und B.Z. sind die Erfinder das patent PCT/CN2017/108646 und 201710906587.6 Verfasst von SIAT, die eine PlCSA ausgerichtete Nanopartikel-Synthese-Methode und Anwendung abdeckt. Potenzielle Interessenkonflikte wurden von den anderen Autoren bekannt gegeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse vom National Key Research und Development Program of China (2016YFC1000402), der National Natural Sciences Foundation (81571445 und 81771617) und Natural Science Foundation der Provinz Guangdong (2016A030313178), unterstützt. X.F. und die Shenzhen Basic Research Fund (JCYJ20170413165233512), X.F.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plCSA peptide | Shanghai GL Biochem | 573518 | for peptide synthesis |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical | 10009218 | for nanoparticles synthesis |
| Soybean lecithin | Avanti Polar Lipids | 441601 | for nanoparticles synthesis |
| DSPE-PEG-COOH | Avanti Polar Lipids | 880125 | for nanoparticles synthesis |
| Doxorubicin | JKChemical | 113424 | for nanoparticles synthesis |
| Acetonitrile | Shanghai Lingfeng | 1008621 | for nanoparticles synthesis |
| PLGA | Sigma-Aldrich | 719897 | for nanoparticles synthesis |
| Ultrasonic processor | Sonics | VCX130 | for nanoparticles synthesis |
| Centrifuge filter (MWCO 10 kDa) | Millipore | UFC801024 | for nanoparticles purification |
| centrifuge | Sigma | 3-18KS | for nanoparticles purification |
| 2-[morpholino]ethanesulfonic acid(MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | for peptide conjugation |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | 3450 | for peptide conjugation |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 56480 | for peptide conjugation |
| Dialysis bags | Spectrum | 132592T | for nanoparticles purification |
| PBS | Hyclone | SH30028.01 | for cell culture |
| 10 mL centrifuge tubes, polypropylene | Aladdin | S-025 | for nanoparticles synthesis |
| 15 mL centrifuge tubes, polypropylene | Corning | 430791 | for various applications |
| 0.22 μm sterile syringe filter | Millipore | SLGV033RB | for nanoparticles purification |
| 1 ml syringe, polypropylene | BD | 328421 | for nanoparticles synthesis |
| Malvern Zetasizer | Malvern | Nano ZS | for particle size analyer |
| Phosphotungstic acid | for TEM | ||
| TEM grid | EMCN | BZ10024a | for TEM |
| UV-VIS spectrometer | Leagene | DZ0035 | for TEM |
| Transmission electron microscope |
JEOL | JEM-100CXII | for particle size analyer |
| BCA reagent A | Thermo Fisher Scientific | 23228 | for BCA assay |
| BCA reagent B | Thermo Fisher Scientific | 23224 | for BCA assay |
| 96-Well Plates | Corning | 3599 | for BCA assay |
| Plate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan™ GO | for BCA assay |
| 12-well plates | Corning | 3513 | for cell culture |
| JEG3 cell | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | TCHu195 | Human placenta |
| DMEM/F12 | Hyclone | SH30272.01 | phenol red-free |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10100 | for cell culture |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO | 15070063 | for cell culture |
| Fluorescence microscope | OLYMPUS | CKK53 | for celluar uptake |
| Paraformaldehyde | Shanghai Lingfeng | 1372021 | for celluar uptake |
| DAPI | Sangon Biotech | A606584 | for celluar uptake |
| Mounting medium | Life | P36961 | for celluar uptake |
References
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